Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment

Arenavirussen zijn een familie van omhulde, enkelstrengs RNA-virussen die voornamelijk gevoerd knaagdieren aard ^1-3. Hoewel deze virussen meestal vast een asymptomatische, aanhoudende infectie bij knaagdieren reservoirs ^1,2, kunnen ze ernstige ziekte bij de mens veroorzaken ^3. Belangrijke pathogene soorten zijn de Nieuwe Wereld Junin virus (JUNV) ⁴ en de Oude Wereld Lassa virus ^5, waarbij de etiologische agenten van de Argentijnse hemorragische koorts in Zuid-Amerika en Lassa koorts in Afrika, respectievelijk. Lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV), het prototype virus van de familie ^6, heeft een wereldwijde verspreiding en is verantwoordelijk voor een aantal ziektetoestanden waaronder aseptische meningitis bij immuuncompetente individuen ^6, ernstige aangeboren afwijkingen bij de foetus ⁷ of hoge letaliteit immunosuppressieve individuen na solide-orgaantransplantatie ^8,9. Het ontbreken van Verenigde StatenFood and Drug Administration (FDA) -goedgekeurd vaccins of effectieve antivirale middelen om deze virussen te bestrijden wijst op de absolute noodzaak om nieuwe strategieën voor het therapeutisch deze opkomende / re-opkomende ziekteverwekkers te ontwikkelen.

De arenavirus genoom bestaat uit twee enkelstrengige RNA-segmenten, de grote (L) (~ 7,2 kb) en klein (S) (~ 3,6 kb) segmenten ^10. De S-segment codeert het virale nucleoproteïne (NP) en envelop glycoproteïne (GP), terwijl de L-segment codeert voor het virale polymerase (L) en matrix eiwit (Z). De SL en genomische RNA segmenten (vRNA's) worden verpakt in virions ^10-12. De eerste stap van arenavirus infectie hechting van virale partikels aan gastheercellen via een interactie tussen de virale huisarts en de bijbehorende gastheercel receptoren die voor JUNV, omvat de menselijke transferrinereceptor 1 (hTfR1) ^13,14. Na bevestiging worden JUNV deeltjes in de cel genomen via clathrine-gemedieerde endocytose ^15.Deeltjes dan verkeer naar de late endosoom waar de lage pH van dit compartiment het startsein voor de activering van GP ^16,17. Eenmaal geactiveerd, de GP-gecodeerde fusiepeptide inserts in de endosomale membraan, het initiëren van fusie tussen de virale en endosomale membranen. Succesvolle combinatie resulteert in het vrijkomen van het virion verpakt vRNA's in het cytoplasma, waar ze dienen als matrijzen voor genomische replicatie en transcriptie. Wanneer voldoende hoeveelheden virale structurele proteïnen en vRNA's worden gegenereerd, nieuwe deeltjes monteren en de knop van de geïnfecteerde cel naar de levenscyclus ¹⁸ ronden.

Tot de ontdekking van nieuwe strategieën vergemakkelijken het therapeutisch pathogene arenavirussen, heeft onze fractie gericht op de identificatie van gastheer factoren die kritiek zijn voor viruspropagatie, maar overbodig voor de gastheer. In dit verband vaststellen van de precieze fase (n) van de virale levenscyclus worden gecontroleerd door deze gastheerfactoren moet de leidraadontwikkeling van antivirale strategieën. Hierin beschrijven we een kwantitatief (q) RT-PCR gebaseerde bepaling die kan worden gebruikt om arenavirus-celhechting voor de identificatie of geselecteerde gastheer- en / of antivirale moleculen beïnvloeden deze eerste fase van virale ingang ¹⁹ meten. Alternatieve benaderingen arenavirus-celhechting te meten hebben gekenmerkt virionen gelabeld met biotine ^20, fluorescerende kleurstoffen ^21, of radioactieve isotopen ^22. Nadelen van deze methoden kan de vereiste grote hoeveelheden toegevoegd virus (bijvoorbeeld hoge multipliciteit van infectie (MOI)), het gebruik van radioactiviteit en / of aanvullende behandelingsstappen aan toegevoegd virus (bijvoorbeeld concentratie en / of het etiket van virus) te bereiden omvatten . Met name het gebruik van hoge MOI maakt het moeilijk om onderscheid te maken productief versus niet-productieve gehechtheid gebeurtenissen ^15,23. De qRT-PCR-gebaseerde test die hier beschreven kunnen attachment gebeurtenissen detecteren met behulp van zo weinig als 20 plaque voorming eenheden (PVE) virus, wat zich vertaalt in een MOI van 0,0004 voor een 48-wells plaat. Daarom is de sterke gevoeligheid van de test overwint de behoefte aan hoog traagheidsmoment en virussen etikettering of concentratiestappen. Verder kan de assay i) ingericht om virion endocytose meten en afgifte van virusgenoom in het cytoplasma volgende fusie en ii) aangepast zijn voor andere virussen door de ontwikkeling van virus-specifieke qRT-PCR reagentia (voor voorbeelden zie ^24-27).