Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon
Summary
Optogenetic yaklaşımlar yaygın nöral aktiviteyi işlemek ve beyin fonksiyonu için sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır. Burada, bir teknik optik aktivatör channelrhodopsin in vivo tanımlanması üzerine, korku ile ilgili devreler özel uzun menzilli ve yerel sinirsel bağlantılar sinaptik özellikleri ex vivo analiz için izin verdiği gösterilmiştir.
Abstract
Optogenetic yaklaşımlar günümüzde yaygın ışığı ışık ile aktive olan protein ve nöral etkinlik sonraki manipülasyon hedeflenen ifade birleştirerek nöral popülasyonları ve devrelerin işlevini incelemek için kullanılır. Channelrhodopsins (CHRS) ışık geçişli katyon-kanal ve bir flüoresan proteinine olduğunda ekspresyon görselleştirme ve özel hücre tipleri aynı anda harekete geçirmek ve beynin belirli bölgelerde aksonal projeksiyonlar sağlar. Viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon yoluyla, CHR füzyon proteinleri yapısal olarak ya da koşullu tanımlanmış bir beyin bölgesi spesifik hücrelerde eksprese edilebilir, ve aksonal çıkıntılar daha sonra beyin kesitleri ex vivo Optogenetic aktivasyonu yoluyla anatomik ve fonksiyonel olarak incelenebilir. Geleneksel elektriksel stimülasyon yaklaşımlarla ele edilemeyen bağlantılarının sinaptik özelliklerini anlamak amacıyla bu, ya da roman AFFE belirlenmesinde özel bir öneme sahiptirkira ve daha önce çok az anlaşılmış oldu efferent bağlantısı. İşte bir kaç örnek bu teknik amigdala korku ile ilgili devreleri açıklık bu soruları araştırmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. amigdala korku ve duygusal anılar edinilmesi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. kanıt kaç satır medial prefrontal korteks (MPFC) korku edinimi ve nesli farklı yönlerini katılır, ancak amigdala ile hassas bağlantı sadece anlaşılmalıdır başlıyor düşündürmektedir. Ex vivo Optogenetic aktivasyon bazolateral amigdala (bla) 'de MPFC afferent ve hedef hücreler arasındaki sinaptik iletişim yönlerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini İlk olarak, gösterilmiştir. Bundan başka, bu ex vivo Optogenetic yaklaşım, amigdala GABAerjik nöronlar bir grup ile yeni bir bağlantı boyutlarını ölçen uygulanabilir kadar gösterilmiş olup, bir örnek olarak paracapsular birleştirilmiş zigot (mpITC).
Introduction
görselleştirme ve beyin bölgeleri ve nöronların belirli türleri arasında belirli bağlantı eşzamanlı aktivasyonu için hassas aletleri fonksiyonel bağlantı altta yatan sağlıklı beyin fonksiyonu ve hastalık durumları anlamada daha önemli hale gelmektedir. İdeal olarak, bu nöronlar iletişim tespit hangi hassas sinaptik özellikleri fizyolojik soruşturma gerektirir. Bu, tek bir akut beyin diliminde korunamaz beyin alanları arasında bağlantı için geçerlidir. Geçmişte, bu büyük ölçüde ayrı deneylerde elde edilmiştir. Bir yandan, nöral izleyiciler enjekte in vivo daha sonra ışık veya ön ve postsinaptik mümkün elektron mikroskopik analizi ile bir arada kullanılmıştır. Kalkış bölgesinden lif yollarının korunması ve dilim hazırlanmasında erişilebilir Diğer taraftan, elektrik stimülasyonu hedef bölgede hücrelerin sinaptik iletişim mekanizması değerlendirmek için kullanılmıştır.
Kendi görselleştirme ve post-hoc anatomik analiz 1- için izin verirken optogenetics gelişine, bu tür floresan proteinleri kaynaşmış Channelrhodopsins (Chrs) olarak ışık kapılı katyon kanalları, hedeflenen ifadesi, artık nöronlar ve onların aksonal yörüngeleri aktivasyonunu sağlar 4. Lif yolları belirli yörünge ayrılabilir olmadığı veya nedeni, 1) geleneksel elektrik stimülasyonu ile erişilebilir değildi beyin bölgelerinden girişleri değerlendirmek: Üst somata 5 kopmuş zaman CHR-ifade aksonlar bile teşvik edilebilir, çünkü beyin dilimleri mümkündür bilinmemektedir; 2) tümden öne ama eksik anlaşılmıştır belirli girdiler için menşe bölgeyi tanımlamak; ve 3) hem yerel hem de uzun menzilli projeksiyonlar, tanımlanan hücre tipleri arasında işlevsel bağlantı araştırmak. Çünkü avantajları bir dizi, beyin dilimleri devre Bu Optogenetic eşleme çapında olmuşturly son yıllarda kullanılan ve floresan etiketli CHRS ekspresyonu için viral vektörler, çeşitli ticari satıcılardan kolayca temin edilebilir. elektriksel stimülasyon da geçit veya diğer yakın hücrelerden ve eşit derecede hızlı ve zamansal hassas stimülasyon lifleri işe çünkü geleneksel elektrik stimülasyonu üzerinde optogenetic aktivasyonu bazı önemli avantajları nedeniyle stimülasyon elektrotları, fiber stimülasyon özgüllüğü yerleştirme dokuya hiçbir zarar vardır. Buna ek olarak, viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon kolayca Kre-bağımlı ekspresyonunu ve / veya özel promoterler 7 kullanılarak elde edilebilir, belirli beyin bölgelerinde 6 ve koşullu veya hücre tipi özel ifadesine hedeflenebilir. İşte, bu teknik korku sisteminde uzun menzilli haritalanması ve yerel devreleri için uygulanır.
Amigdala korku ve duygusal anıları 8,9 edinimi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. Apart froamigdala m, medial prefrontal korteks (MPFC) ve hipokampus (HC), karşılıklı olarak amigdala bağlı yapılar, korku ve yok oluş anı 10,11 edinimi, konsolidasyon ve alma yönleri sorumlu tutulmaktadır. MPFC alt bölümleri aktivite 12,13 devletler, yüksek ve düşük hem de korku kontrolünde bir çift rol oynadığı düşünülmektedir. Bu kısmen amigdala aktivitesi ve çıkışını kontrol ediyorum amigdala için MPFC doğrudan bağlantıları aracılık olabilir. Bu nedenle, son yıllarda, bazı çalışmalar amigdala 14-17 yılında MPFC afferentleri ve belirli hedef hücreleri arasındaki sinaptik etkileşimlerini araştırmak için ex-vivo dilim deneyler başladı.
korku öğrenme sırasında, klimalı ve koşulsuz uyaranlara ilgili duyusal bilgiler belirli talamik ve kortikal bölgelerden projeksiyonlar aracılığıyla amigdala ulaşır. Başol lateral (LA) nöronlara bu girdilerin Plastisiteateral amigdala (BLA) korku klima 9,18 altında yatan önemli bir mekanizmadır. Artan kanıtlar amigdala paralel plastik süreçleri korku bellek 19 kontrol etmek için inhibitör unsurlar içerdiğini göstermektedir. Kümelenmiş inhibitör nöronların bir grup GABAerjik medial paracapsular enterkale hücreler (mpITCs) vardır, ama bunların kesin bağlantı ve fonksiyon tam olarak 20-22 anlaşılmaktadır. Burada, optogenetic devre haritalama mpITCs talamik ve kortikal röle istasyonları 23 doğrudan duyusal girdileri almak olduğunu gösteren, afferent ve efferent bu hücrelerin bağlantı ve amigdala hedef nöronlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılır. mpITCs veya BLA nöronlarda CHR spesifik ifadesi etkili bir BLA aktivitesini kontrol roman ileri beslemeli ve geri bildirim inhibitör devrelerde yerleştirerek, mpITCs engellediğini ortaya, yerel etkileşimlerin haritalama sağlar, aynı zamanda karşılıklı BLA ana nöronlar tarafından aktive edilir23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol değilse tüm kolayca çoğunda uygulanabilir nöral devreleri ve yerel bağlantı ex vivo optogenetic soruşturma için bir yöntem açıklanır, Epifloresans ışık limanda bir LED ~ 470 nm ile donatarak dik dilim patch-kelepçe kayıt kurulumları. dilimleri aksonal çıkıntıların Optogenetic uyarım önemli bir avantajı, mukabil lif yollarının bilinmemektedir açık bir şekilde tanımlanmış olup, ya da korunmuş değildi, çünkü belirli bir aktivasyonu ve konvansiyonel elektrik stim?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
References
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
- Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).
- Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).
- Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
- Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).
- Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
