Zebrafish come modello per valutare il potenziale teratogeno di nitriti
Summary
L'esposizione a teratogeni può causare difetti alla nascita. Zebrafish sono utili per determinare il potenziale teratogeno di sostanze chimiche. Dimostriamo l'utilità di zebrafish esponendo embrioni a vari livelli di nitriti e anche in diversi tempi di esposizione. Abbiamo dimostrato che il nitrito può essere tossico e causare gravi difetti di sviluppo.
Abstract
Alti livelli di nitrati nell'ambiente può causare difetti congeniti o aborti negli esseri umani. Presumibilmente, questo è dovuto alla conversione dei nitrati in nitriti da intestinali e salivari batteri. Tuttavia, in altri studi di mammiferi, alti livelli di nitriti non causano difetti alla nascita, anche se possono portare a scarsi esiti riproduttivi. Pertanto, il potenziale teratogeno di nitriti non è chiaro. Sarebbe utile avere un sistema modello vertebrato valutare facilmente effetti teratogeni di nitrito o qualsiasi altro prodotto chimico di interesse. Qui, dimostriamo l'utilità di zebrafish (Danio rerio) per lo screening di composti per la tossicità e difetti embrionali. zebrafish embrioni sono fecondati esternamente ed avere un rapido sviluppo, che li rende un buon modello per gli studi teratogeni. Abbiamo dimostrato che aumentando il tempo di esposizione al nitrito influenza negativamente la sopravvivenza. Aumentando la concentrazione di nitrito anche effetti negativi di sopravvivenza, considerando che il nitrato non. Per gli embrioni that sopravvivere l'esposizione nitrito, vari difetti si possono verificare, tra cui pericardico e tuorlo d'edema sac, nuotare noninflation vescica e malformazioni cranio-facciale. I nostri risultati indicano che il zebrafish è un sistema conveniente per studiare il potenziale teratogeno di nitriti. Questo approccio può essere facilmente adattato per testare altre sostanze chimiche per i loro effetti sul primo sviluppo dei vertebrati.
Introduction
Teratogenesi è un processo che sconvolge il normale sviluppo di un embrione o il feto, provocando anomalie strutturali e funzionali permanenti, ritardo della crescita, o aborto spontaneo nei casi più gravi 1. Esso può essere causato da alcuni agenti naturali (teratogeni), che interferiscono con lo sviluppo embrionale in diversi modi 2. Durante lo sviluppo fetale umano, teratogeni comuni come le radiazioni, agenti infettivi, metalli tossici e sostanze chimiche organiche sono stati segnalati per causare difetti di epicanto (la pelle piega nella palpebra superiore) e clinodattilia (dito curvo o tep) attraverso errori morfogenetici 1.
La comprensione del meccanismo molecolare di teratogenesi è il primo passo verso lo sviluppo di trattamento e la prevenzione. Diversi modelli vertebrati quali la rana africana artigliata (Xenopus laevis) e zebrafish (Danio rerio) sono stati utilizzati per determinare i percorsi molecolari colpite dalla TeratOgens. Studi precedenti hanno utilizzato zebrafish come modello per l'epidemiologia, tossicologia e teratogenesi 3-7. Scholz et al. zebrafish considerato come un "gold standard" per la valutazione della tossicità ambientale. Ciò è dovuto, in parte, alla trasparenza dell'embrione zebrafish, che permette ai ricercatori di visualizzare il difetto di sviluppo come avviene 8. Circa il 70% dei geni umani hanno ortologhi in zebrafish, facendo zebrafish un modello vertebrato desiderabile per lo studio di difetti umani 9.
Alcuni studi epidemiologici hanno suggerito che nitrati e nitriti, comunemente presenti negli alimenti agricoli e acqua, sono associate a difetti di nascita o aborti spontanei 10,11, mentre altri studi non supportano questa associazione 12. Nitrati (NO 3 -) e nitriti (NO 2 -) sono naturalmente presenti nel suolo e nell'acqua. Essi sono una fonte di azoto per le piante e sono una parte della nciclo itrogen 13. Alimenti come fagiolini, carote, zucca, spinaci, bietole e provenienti da allevamenti che utilizzano fertilizzanti ad alto contenuto di nitrati hanno livelli di nitrati e nitriti 7 aumentata in modo significativo. Il latte da mucche alimentate con alimenti di nitrati alti e pesci in acqua alta nitrato (principalmente dal deflusso terreno 30) può portare agli esseri umani che consumano grandi quantità di nitrati e nitriti 14. Nitrati e nitriti sono comunemente utilizzati nella conservazione degli alimenti, che aumenta notevolmente la quantità ingerita dagli esseri umani 12.
Livelli ottimali di nitrati e nitriti svolgono un ruolo fondamentale nei processi fisiologici come omeostasi vascolare e la funzione, la neurotrasmissione e meccanismi di difesa ospite immunologici 13-15. Tuttavia, l'esposizione ad alti livelli di nitrati e nitriti può portare ad effetti negativi, soprattutto nei neonati e nei bambini 16. nitrato ingerito viene ulteriormente convertito in nitriti nella cavità orale microflora e in the tratto gastrointestinale dalla microflora intestinale 17.
Nitrato mette i neonati ad alto rischio per la sindrome del bambino blu per ossidazione di emoglobina a metaemoglobina, compromettendo l'emoglobina che trasporta l'ossigeno dalla sua capacità di 18. Ciò comporta il colore blu di pelle che si estende ai tessuti periferici nei casi più gravi. L'ossigenazione inibito di tessuti risultati in altri sintomi, più gravemente che porta al coma e alla morte 19,20. Sintomi simili sono stati osservati nei bambini e negli adulti a concentrazioni più elevate di nitrati 21. Elevati livelli di metaemoglobina negli adulti a causa di risultati di avvelenamento nitrito di cianosi, mal di testa, disturbi respiratori, 31 e morte se non trattata a causa di complicazioni legate alla ipossia tissutale vitale 32,33.
Il nitrato ingerito a livelli più alti può anche tradursi in varie complicazioni di salute. diabete infantile, diarrea ricorrente, e infezioni delle vie respiratorie ricorrentinei bambini sono stati collegati con elevata assunzione di nitrato 11,17,22. L'esposizione cronica a un alto livello di nitrato è associato con la minzione e della milza emorragie. L'esposizione acuta ad alte dosi di nitrati può portare ad un ampio spettro di condizioni mediche come dolori addominali, debolezza muscolare, sangue nelle feci e nelle urine, svenimenti e morte 11. L'esposizione prenatale al nitrato ad alti livelli è stato associato con il tubo neurale e difetti muscolo-scheletrico 11.
Un recente rapporto ha mostrato che il trattamento di embrioni di zebrafish con il nitrito ha portato alla tuorlo edema sac, malformazioni cranio-facciali e assiali, e vescica natatoria noninflation 5. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per il trattamento di embrioni di zebrafish con nitrati e nitriti per determinare il loro potenziale teratogeno. Gli embrioni sono stati esposti a nitrito a differenti concentrazioni e periodi di tempo diversi. L'etanolo è stato utilizzato come controllo positivo, poiché è un teratogeno stabilita 23. Our metodo ha dimostrato che entrambe le concentrazioni elevate e tempi di esposizione lunghi in nitriti erano dannosi per la sopravvivenza e ha portato in vari fenotipi, che vanno da lievi (edema) a gravi difetti di sviluppo (lordi). Pertanto, il pesce zebra è un modello utile per esplorare direttamente i potenziali effetti teratogeni di nitrati e nitriti sugli embrioni per completare gli studi epidemiologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto qui dimostra l'utilità di zebrafish nel valutare il potenziale teratogeno di nitriti e nitrati. Rispetto ad altri vertebrati, zebrafish hanno vantaggi che includono alta fecondità, fecondazione esterna, trasparenza ottica e rapido sviluppo. Mutanti disponibili che mancano di pigmentazione (come ad esempio il pesce zebra Casper 36) aiutano anche a migliorare la visibilità degli organi interni. E 'anche facile generare zebrafish transgenico con geni reporter per facilitare l'a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VK was funded by grants from the IUP Department of Biology and School of Graduate Studies and Research (Graduate Student Professional Development). CQD and TWS were supported by the IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). We also thank members of the Diep laboratory for maintaining the zebrafish facility.
Materials
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
References
- Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
- Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
- Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
- Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
- Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
- Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
- Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment–applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water–LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
- Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
- Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
- Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
- Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
- Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
- Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
- Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
- Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
- Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
- Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
- Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
- Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
- . . Methods for chemical analysis of water and wastes. , (1983).
- Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
- Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , 1-26 (1996).
- Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
- Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
- Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
- Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
