の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em>エンテロコッカス属。</em>およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

それらは伝統的な培養ベースの方法に比べてより速く、より柔軟かつ特異的であるため、定量的PCR（定量PCR）法が広く娯楽水質監視及び微生物源追跡用途に使用されてきました。その結果、定量PCRは、 エンテロコッカス属などの一般的な糞便指標の急速な水のモニタリング結果を達成するために推奨されている。改訂USEPAレクリエーション水質基準¹で。多くのqPCRアッセイはまた、環境水²に糞便汚染の発生源を特定するために開発および検証されてきました。これらの中でも、HF183マーカーアッセイは、最も頻繁に人間関連糞便汚染^3を識別するため^に使用される一つです。

彼らは定量化のための標準曲線に依存しているためしかし、定量PCRの結果は、多くの場合、バイアスすることができます。定量PCRはスタンから、その定量化サイクル（CQ）を補間することによって、サンプル中の標的の未知の濃度を定量化CQと直列に希釈した標準のセットの対数量との間の線形関係を記述する準の曲線。信頼性と一貫性標準物質の欠如は、したがって、大幅に定量PCRの結果にバイアスをかけることができます。研究は、定量PCRの結果は、異なるベンダー⁴と同じベンダ⁵から規格の異なるバッチを使用して、2倍から標準を使用して約半分のログによって異なっていることを示しました。

デジタルPCR（DPCR）技術は、均一なナノリットルまたはピコリットルの反応⁶の数千または数百万へのバルク定量PCRを分割することによって生成されたミニチュアPCRの大量に陽性の頻度をカウントすることにより、未知試料を定量化します。パーティションは油中水型液滴（ すなわち 、この記事）、またはチップ上の小室であるかどうかは、それぞれ（ すなわち 、この記事）液滴デジタルPCRまたはチャンバデジタルPCR、と呼ばれています。より高い試料濃度は、標的DNAの存在をもたらしますパーティションの高い割合で（したがって、正PCR）、ポアソン分布で近似関係。このように、バイナリ結果（正または負PCR）が記録され、正の液滴の周波数は、定量PCRのような標準曲線のための必要性を排除し、直接ポアソン近似を介して未知試料の濃度を計算するために使用されます。

デジタルPCR定量のこのバイナリ性質は定量PCR ⁷の上に付加的な利点を提供します。遅延増幅がまだ正のPCRを得ることができるので、DPCR定量は、増幅効率を低下させる阻害に対してよりロバストです。定量PCR ^8-10と比較して、DPCRの高精度化につながる、定量PCRである同様に、DPCRの定量化は、Cqの値の変動による影響を受けません。

また、分割処理を効果的amplificatio中（基質競合を最小化する、各小滴中の標的DNAの存在の非常に少量を保証します定量PCR（ すなわちアッセイは、同時に2つのDNA標的を測定）の二重化を実現するための共通の障害となっている別のDNA標的）のn個。このように、二重またはシンプレックスで実行が（ つまり、一つのターゲットは、単一のアッセイで測定された）かどうかDPCRは、両方のターゲット^7,11のほとんど区別できなく定量化を生成します。

この記事で説明したデジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）の目標は、一般的な糞便指標腸球菌属の同時直接定量を得ることである。そして改善された精度、再現性および阻害に対するロバスト性を有するヒト、糞便関連HF183マーカーは、その定量PCRと比較します対応。このアッセイは、正常な環境淡水、海水、および種々の糞便物質⁷の糞便汚染を定量するために使用されているだけでなく、水と廃水の任意の他のタイプに適用することができます。このアッセイは、原因それに堆積物や土壌を分析するための非常に有望ですsの阻害に対する高い耐性が、は更なる試験があるため、サンプルのこれらのタイプの中の阻害剤混合物の複雑さが要求されます。