Veiligheidsmaatregelen en operationele procedures in een (A) BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology
Summary
As high-consequence pathogens can potentially infect subjects through airborne particles, aerobiology has been increasingly applied in pathogenesis research and medical countermeasure development. We present a detailed visual demonstration of aerobiology procedures during an aerosol challenge in nonhuman primates in an animal biosafety level 4 maximum containment environment.
Abstract
Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol releases or unexpected natural aerosol transmission. Specific laboratories designed to perform these experiments require tremendous engineering controls to provide a safe and secure working environment and constant systems maintenance to sustain functionality. Class III biosafety cabinets, also referred to as gloveboxes, are gas-tight enclosures with non-opening windows. These cabinets are maintained under negative pressure by double high-efficiency-particulate-air (HEPA)-filtered exhaust systems and are the ideal primary containment for housing aerosolization equipment. A well planned workflow between staff members within high containment from, for instance, an animal biosafety level-4 (ABSL-4) suit laboratory to the ABSL-4 cabinet laboratory is a crucial component for successful experimentation. For smooth study execution, establishing a communication network, moving equipment and subjects, and setting up and placing equipment, requires staff members to meticulously plan procedures prior to study initiation. Here, we provide an overview and a visual representation of how aerobiology research is conducted at the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Integrated Research Facility at Fort Detrick, Maryland, USA, within an ABSL-4 environment.
Introduction
Overbrenging van virussen gebeurt gewoonlijk door direct of fysiek contact, maar veel belangrijke virale ziekten (bijvoorbeeld mazelen, waterpokken, influenza) worden veroorzaakt door pathogenen die door aërosol of ademhalingsdruppeltjes worden overgedragen. Dergelijke pathogenen hebben het potentieel om een pandemie met gevolgen variërend van algemeen voorkomende milde ziekte geassocieerd met verlies van gegevens veroorzaken (bijvoorbeeld verkoudheid) ernstige ziekte met hoge letaliteit (bijvoorbeeld pokken) zeldzamer. High-gevolg pathogenen die natuurlijk verspreid door aerosol of opzettelijke aerosolen (biologische wapens) zijn van bijzonder belang aërobiologie 1. Mensen kunnen raken snel geïnfecteerd met een aantal van deze ziekteverwekkers door grote respiratoire druppels of kleine deeltjes kernen en gemakkelijk verspreid deze ziekteverwekkers aan anderen door speeksel afscheidingen, hoesten en niezen 2. In de VS biodefense gemeenschap, high-gevolg pathogenen (bijv filoviruses of andere NIAID Category AC Priority Pathogens en CDC Bioterrorisme gemachtigden) zijn de focus van aerosol onderzoeksprogramma's als gevolg van hoge dodelijkheid van infecties 3,4. Belangrijke wetenschappelijke vooruitgang op het gebied aërobiologie zijn gemaakt in de afgelopen tien jaar als gevolg van de technologische vooruitgang in spuitbussen apparatuur en high containment faciliteiten 5,6. Onderzoek bij de National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH / NIAID), Integrated Research Facility in Fort Detrick gelegen in Frederick, MD, USA (IRF-Frederick) is gericht op high-gevolg opkomende ziekteverwekkers die dierlijke bioveiligheid vereisen 4 (ABSL-4) containment. De algemene opdracht van het IRF-Frederick te evalueren en de ontwikkeling van kandidaat-vaccins en therapeutica (medische tegenmaatregelen) vergemakkelijken.
Onderzoek met high-gevolg ziekteverwekkers bij de IRF-Frederick wordt beheerst door strikte bioveiligheid en verzorging van dieren en gebruikseisen. deze requirements zijn uiteengezet in het Bioveiligheid in Microbiologische en Biomedische Laboratories (BMBL) manual 7 en de federale dierenwelzijn voorschriften. Deze vereisten kunnen het type van onderzoek dat kan worden uitgevoerd te beperken en de impact algehele opzet van het onderzoek. Zoals we eerder in dit tijdschrift beschreven, al het onderzoek uitgevoerd in een ABSL-4 omgeving vereist de nodige voorzichtigheid, zeer gespecialiseerde opleiding, en een robuuste en redundante faciliteiteninfrastructuur 8,9.
Binnenkomst in de IRF-Frederick ABSL-4 pak laboratorium vereist het aantrekken van een positieve druk inkapselen suit 8. Positieve druk chemiepakken zijn niet vereist voor het invoeren van de ABSL-4 kast laboratorium. Aantrekken van een scrub pak, rubber of nitril, en close-toed schoenen is geschikt wanneer het manipuleren Risk Group 4 besmettelijk materiaal in een gecertificeerde klasse III bioveiligheid Cabinet (BSC) in een ABSL-4 kast laboratorium 7.
Aan de IRF-Frederick, is aerosol-apparatuur ontworpen, samengesteld en wordt onderhouden in twee hermetisch afgesloten, roestvrij staal, luchtdichte, negatieve druk klasse III BSC, figuur 1. De IRF-Frederick Aerobiology Core maakt gebruik van een geautomatiseerde aerosol Management Platform ( AAMP) en besturen aerosol experimenten binnen deze BSCs figuur 2. een eerdere publicatie zet de specifieke functies van de klasse III BSC op IRF-Frederick en de verbinding met het pak laboratorium via een doorvoerpoort 5. De werkwijze voor het bereiden van de klasse III BSC vóór experimenten is specifiek voor de IRF. Andere Class III BSC's gebruikt bij andere instellingen functioneren op dezelfde wijze als de Class III BSC in gebruik bij de IRF, maar kan verschillende mechanismen voor het vervoer, de toegang, of docking te hebben.
Om verder te begrijpen hoe hoog-gevolg ziekteverwekkers besmettelijk blijven en verspreid via aerosol transmissie, veilig aerobiological experimenten moeten in deze klasse III BSC's worden uitgevoerd volgens een specifieke workflow procedure. Onderzoekers hebben zorgvuldig en grondig getraind om deze workflow wordt gevolgd in een veilige en consistente wijze te waarborgen. Voorafgaand aan niet-menselijke primaten (NHP) aerosol uitdaging, verschillende aerosol karakterisering of sham aerosol runs worden uitgevoerd om de stabiliteit en de levensvatbaarheid van een agent bij in de vorm van spuitbussen te testen. De aerosol karakterisering die bootst de werkelijke aerosol uitdaging, en de onderzoeker beoordeelt de variabelen in verband met spuitbussen studies.
Een ander deel van de workflow fysieke manipulaties, toediening of anesthetica of andere middelen of routineprocedures nemen op grafieken voor elk NHP. Deze onderwerp kaarten worden grondig geanalyseerd om procedurele consistentie en standaardisatie te waarborgen. Onderwerpen verdoofd vóór aërosol. Voorbeeld anesthetica bevatten tiletamine / zolazepam, ketamine / acepromazine en ketamine. Anesthetica zijn gekozen op basis van het minimaliseren van respiratoire onderdrukking en bevordering van de gecontroleerde, steady-state ademhaling. Extra verdoving leveringen worden onderhouden in het dier procedure kamers en getransporteerd over de overdracht kar met de NHP aan de aërobiologie ABSL-4 kast laboratorium.
Binnen het ABSL-4 pak laboratorium NHP ondergaan plethysmografie via één van de twee methoden (dwz head-out plethysmografie, respiratoire inductie plethysmografie [RIP]) om inspiratoire tidal volume te bepalen en ademhaling verandert 10-12. Deze afgeleide parameters worden gebruikt voor nauwkeurige berekening van de geschatte geïnhaleerde dosis van het pathogeen onmiddellijk vóór of tijdens een aërosol blootstelling. Head-out plethysmografie maakt gebruik van een lange, cilindrische kamer dat de NHP 13 huizen. De drukval ontstaat wanneer een dier in de cylinder wordt opgevangen door een pneumotachograaf, doorgegeven aan de versterker, verwerkt door de wisselstroom / direct current converter, en geïntegreerd in de software de bovengenoemde pulmonaire parameters afleiden. RIP gebruikt sensoren van inductieve gewikkelde koperen draden die zijn ingebed in elastische banden rond de borst van de patiënt en de buik 11,12. Een inductieve-condensator een magnetisch veld in de sensor. Ademhaling verandert het magnetisch veld en de resulterende spanningsveranderingen worden doorgegeven van een zender naast de elastische band naar een ontvanger in de computer via korte-golflengte UV-hoogfrequente radiogolven. Dedicated software bepaalt ademhaling en getijdenenergie volume van de totale thoracale verplaatsing.
De minuutvolume (MV) verkregen via plethysmografie wordt gebruikt bij de berekening van de geschatte geïnhaleerde dosis (D). Bij het genereren en bemonstering een aërosol wordt de aerosol concentratie (AC) berekend door de biosampler concentratie (BC) te vermenigvuldigen met het volume van media (V) en te delen door het resultaat van vermenigvuldiging van de stroomsnelheid biosampler (FL) van debelichtingstijd (T). De vereenvoudigde formule wordt voorgesteld als AC = BC x V ÷ FL x T. Op zijn beurt, voor de eigenlijke aerosol uitdaging in het NHP, D wordt berekend door vermenigvuldiging AC door MV en de duur van de blootstelling (tijd = T). De vereenvoudigde formule wordt voorgesteld als D = AC x MV x T.
Het doel van dit artikel is om visueel te tonen het hele aerosol uitdaging procedure met behulp van NHP's vanuit twee gezichtspunten, de ABSL-4 pak laboratorium kant en de ABSL-4 kast laboratorium kant. Hoewel deze procedures algemeen van aard kunnen zijn voor meerdere genoemde praktijken, ze zijn specifiek voor de IRF-Frederick Aerobiology Core en vertegenwoordigen de huidige praktijken die in deze instelling. Dit artikel richt zich op de bioveiligheid procedures die nodig zijn om veilig uit te voeren een aerosol uitdaging, niet de werkelijke aerosol uitdaging zelf. In deze procedures, maken we gebruik van een dummy onderworpen aan bioveiligheidspraktijken, als gevolg van de risico's geassocieerd met verlamming een NHP tonen. Echter, het proces van performing een aerosol uitdaging is geschreven in algemene zin, omdat de procedure is hetzelfde, ongeacht de high-gevolg ziekteverwekker gebruikt. Wij streven ernaar om kennis en begrip van de wetenschappers over de ontberingen van het uitvoeren van aerosol studies van grote gevolgen ziekteverwekkers onder maximale insluiting omstandigheden te verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We schetsen de aërobiologie procedures die worden gebruikt bij de IRF-Frederick voor het werken met zeer gevaarlijke (Risk Group 4) ziekteverwekkers. Een doel van het visualiseren van de bio-aërosoldeeltjes procedures is de veiligheid van het personeel te benadrukken wanneer een klasse III BSC tijdens experimenten met dergelijke pathogenen laboratorium verworven infecties te voorkomen. Klasse III BSC's behouden een binnenkomende gerichte luchtstroom die uitlaten in dubbelstrengig HEPA filters zodat ziekteverwekker…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. J.K.B., K.J., M.R.H., D.P., L.B., and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: J.H.K., an employee of Tunnell Government Services, Inc.; and M.G.L., an employee of Lovelace Respiratory Research Institute.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Class III BSC | Germfree | DGB-10 | |
| Integrated BSC gloves | Piercan | 10UY2032-9 | |
| Aerosol Management Platform (AeroMP) | Biaera Technologies | NA | |
| Head-out plethysmography | Buxco/Data Sciences International | NA | |
| Respriatory inductive plethysmography | Data Sciences International | NA | |
| Centered flow tangential aerosol generator (CenTAG) | CH Technologies | NA | |
| Collison nebulizer | BGI Inc. | CN25 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Sperian positive-pressure suit | Honeywell Safety Products | BSL 4-2 | |
| Outer suit gloves (latex, Ansell Canners and Handlers) | Fisher | 19-019-601 | |
| Outer suit gloves (nitrile/rubber, MAPA) | Fisher | 2MYU1 | |
| Scrubs | Cintas | 60975/60976 | |
| Socks | Cintas | 944 | |
| Duct tape | Pack-N-Tape | 51131069695 | |
| Towels | Cintas | 2720 | |
| O-rings | O-ring warehouse | AS568-343 | |
| Overshoes | Amazon | B0034KZE22 | |
| Zip lube | Amazon | B000GKBEJA |
References
- Alibek, K., Handelman, S. . The chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world-told from inside by the man who ran it. , (1999).
- Roy, C. J., Pitt, L. M., Swearingen, J. R. Infectious disease aerobiology: aerosol challenge methods. Biodefense: research methodology and animal models. , 61-76 (2006).
- Lackemeyer, M. G., et al. ABSL-4 aerobiology biosafety and technology at the NIH/NIAID integrated research facility at Fort Detrick. Viruses. 6 (1), 137-150 (2014).
- Bohannon, J. K., et al. Generation and characterization of large-particle aerosols using a center flow tangential aerosol generator with a non-human-primate, head-only aerosol chamber. Inhal Toxicol. , (2015).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E., eds, . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 1. Biosafety level 4 suit laboratory suite entry and exit procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Mazur, S., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 2. General Practices. J Vis Exp. , (2015).
- Mortola, J. P., Frappell, P. B. On the barometric method for measurements of ventilation, and its use in small animals. Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 937-944 (1998).
- Zhang, Z., et al. Development of a respiratory inductive plethysmography module supporting multiple sensors for wearable systems. Sensors (Basel). 12 (10), 13167-13184 (2012).
- Ingram-Ross, J. L., et al. Cardiorespiratory safety evaluation in non-human primates. J Pharmacol Toxicol Meth. 66 (2), 114-124 (2012).
- Besch, T. K., Ruble, D. L., Gibbs, P. H., Pitt, M. L. Steady-state minute volume determination by body-only plethysmography in juvenile rhesus monkeys. Lab Anim Sci. 46 (5), 539-544 (1996).
