Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
sinyal yollarının kapsamlı bir anlayış ligand-reseptör etkileşimi hakkında detaylı bilgi gerektirir. Spesifik reseptör ile belirli bir ligandın etkileşiminin değerlendirmek için en yöntemleri zaman alıcı, emek yoğun, pahalı ve özel ekipman ve uzmanlık 1 gerektirir.
doğrudan ligand-reseptör etkileşimi deneyi (LRA) ve rekabet LRA: Bu makale immünosorbent deneyi (ELISA) ile bağlantılı bir enzimin göre ligand-reseptör etkileşimi araştırmak için iki hızlı ve güvenilir bir nokta-nokta protokollerini tasvir eder. ELISA rutin hemen hemen her laboratuvarda kullanılan yüksek, duyarlı özel ve hazır bir tekniktir. ELISA yapıldı ve çeşitli usullerde uyarlanabilir. sunulan protokoller farklı lambda interferonlar (INFLs) ve reseptörü arasındaki etkileşimin araştırılması için optimize edilmiştir.
Doğrudan LRA bir quantificati sağlarLigand-reseptör ligand konsantrasyonuna göre bağlanma ve böylece bağlanma eğrisini verir. Ligand-reseptör etkileşimi için uygun bir model kullanılarak veriler ayrıca ayrılma sabiti (KD) tahmin etmek için analiz edilebilir.
Sunulan protokol olarak, yaygın olarak kullanılan, Hill denklemi ligand-reseptör modeli uygulanır. Bu tür yüzey plazmon rezonans tekniği 2,3 gibi diğer yöntemler, iki protein arasındaki bağlanma afiniteleri tespitine imkan da, bu teknoloji, emek-yoğun, pahalı ve özel laboratuar donanımına ihtiyaç duymaktadır.
Yarışma LRA önleyici peptidlerin taranmasını sağlar: bağlayıcı ligand-reseptör peptit konsantrasyonuna göre ölçülür. Bu peptid inhibitör etkisini açıklayan bir doz-yanıt eğrisi elde edilir. Veriler bundan başka, 50 IC (yarım maksimal inhibisyon konsantrasyonunu tahmin etmek için analiz edilebilir </alt>) bloke peptid.
Hem ELISA protokolleri kullanımı kolay ve araştırma soruları geniş bir şekilde adapte edilebilir. herhangi bir rekombinant proteinler, güvenilir ve hızlı iletişim düzenlemelerini belirlemek için kullanılır. Buna ek olarak, rekabet LRA ligand veya reseptör, ya taklit edecek şekilde tasarlanmıştır bloke peptidler kullanılarak ligand ve reseptör kritik etkileşim bölgelerine belirlemek için kullanılabilir. bloke peptid etkin ve spesifik inhibisyonunu gösteriyorsa, peptid kritik bir etkileşim ligandın sitesi (peptid taklit halinde reseptör) veya ligand (peptit taklit halinde ligandı) kaplar.
İlk protokol farklı INFLs K D değeri belirlenmesi ve bunların reseptörünün alfa alt birimini, yani açıklar, direkt LRA kullanarak interlökin-28 reseptör (IL28RA). Daha sonra, ikinci protokol bir 20 amino asit uzunluğunda bir peptid kapasitesini belirlemek için gösterilmiştirINFL-IL28RA etkileşimi inhibe eder. peptid reseptör bağlanma yerinde IFNLs ile rekabet etmek için tasarlanmış olup bir etkileşimin moleküler bir anlayış mümkün kılar. Bundan başka, bu peptidin aşağı akış sinyalleme etkileri 4 üzerindeki etkisini belirlemek için in vitro deneylerde IL28RA engellemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA birçok laboratuvar için standart ve köklü bir yöntemdir. Biz daha değiştirilebilir ve daha önce yayınlanan bir yöntem, 5,7 iyileştirilmiştir. Gösterilen adım adım protokolü ligand-reseptör etkileşimlerinin KD değerlerinin belirlenmesi için basit bir şekilde nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, ligand-reseptör etkileşimi engelleyen bir bloke edici peptidin IC50 belirlenebilir.
En araştırmacılar daha önce bir ELISA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
