Espectroscopia óptica difusa para la evaluación cuantitativa de la radiación ionizante aguda La toxicidad cutánea inducida utilizando un modelo de ratón

Los métodos siguientes están en conformidad con las directrices del Comité de Ética Animal Care Research Institute Sunnybrook. 1. Sistema de espectroscopía de reflectancia difusa Recoger los espectros de reflectancia difusa utilizando un dispositivo de mano, una sonda de fibra óptica y sistema de adquisición de espectroscópica portátil que se ha descrito previamente (Kim et al. 2010) y se revisa brevemente en la Figura 1 (y los títulos relacionados) para la integridad 1,2. 2. Preparación del modelo de ratón de radiación aguda daños de la piel Orden de 6 semanas de edad, los ratones sin pelo (de preferencia, como atímicos o SKH-1) y dejar que se aclimaten en las instalaciones de animales durante una semana antes de comenzar los experimentos. Reserva al menos 3 ratones para un grupo de control no irradiado y 5 ratones para un grupo irradiado. Antes de las mediciones de línea de base y la irradiación de DOS, etiquetar los ratones utilizando troqueles para los oídos o marcador permanente markings en la cola. Si los ratones no son desnudos, quitar el pelo en unos 2 cm por 2 cm parche de piel del flanco, pero esto puede causar irritación de la piel. 3. difusa espectroscopia óptica de Adquisición de Datos Encienda la fuente de alimentación a la electrónica. Para la piel del ratón, configurar los parámetros de la señal para el software de adquisición escribiendo en 25 milisegundos en cuanto al tiempo de recolección, 25 para los promedios de señal y 1 de ancho del filtro vagón. Estos parámetros ofrecen un equilibrio razonable entre el tiempo de adquisición y de señal a ruido. El uso de software de adquisición programada de encargo, adquieren automáticamente una lectura de fondo, R bg (LED apagado) y la reflectancia difusa a dos distancias de separación de fuente-detector, meas R (260 m, 520 m) haciendo clic en el botón "Adquirir". El tiempo total de adquisición es ~ 2 seg. Apagar todas las luces de la habitación fluorescentes pulsando el interruptor de luz de la habitación antes de realizar mediciones. NOTA: FLUORESCluz de la habitación ent interfiere con la señal detectada (estas luces producen una intensidad de luz variable en el tiempo y por lo tanto es difícil de restar como una señal de fondo). Aunque las bombillas incandescentes se pueden emplear mantienen las luces a una distancia de la sonda DOS para evitar niveles de fondo de alta (y la mala señal a ruido). 4. Medidas de anestesia de los animales y de línea de base DOS Preparar la máquina de anestesia, garantizando que todas las conexiones están intactas y nivel de isoflurano líquido es adecuada. Utilizar una cámara de inducción de anestesia con un tubo unido y el cono de la nariz que puede ser pegado con cinta adhesiva a una superficie esterilizada, suavemente acolchado dentro del alcance de la sonda DOS. Anestesiar una jaula de los ratones a la vez en la cámara de inducción mediante la inducción con 4% de isoflurano para 30 seg. Disminuir la cantidad de isoflurano al 2% para el próximo 2 min. Compruebe que el ratón se anestesió al observar ninguna respuesta de pellizcar un dedo del pie de la extremidad posterior. Con rapidezmover un ratón en la zona de sondeo DOS esterilizada, colocarlo en su lado, abroche su hocico en el cono de la nariz y abrir el tubo de cono de la nariz con el flujo de la anestesia (isoflurano al 2%). NOTA: Si el procedimiento tarda más de 1 – 2 minutos, aplique una pomada veterinario en los ojos para evitar la sequedad. Antes de la adquisición de las mediciones de la piel del ratón, esterilizar la sonda limpiando con 70% de etanol. No esterilizar la piel. Coloque la sonda suavemente sobre la piel del flanco asegurándose de evitar la dispersión de la vasculatura local. Mantenga la sonda con la mano durante la duración de la medición. Adquirir datos de reflectancia mediante el sondeo de un área de la piel del flanco de aproximadamente 2 cm por 2 cm (el área a ser irradiada) siguiendo la formación 5-punto sobre una matriz. Mantenga este sondeo patrón, el área, la presión de la sonda y del lado del cuerpo (izquierda o derecha) consistente para todas las mediciones posteriores. NOTA: La exploración completa tarda aproximadamente 60 segundos. presión de la sonda debe ser suficiente para obtener una imagen sin dispersar lvasculatura vecinal. Mover el ratón en una jaula de recuperación, y mover el puntero del ratón sobre la próxima a la zona de sondeo DOS. Repita los pasos 4.2 a 4.6 hasta que todos los ratones que se han medido. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. 5. irradiación Animal NOTA: Este protocolo requiere el uso de un irradiador, y puede ser necesario ajustar para satisfacer las necesidades del dispositivo irradiador preparación animal. Durante la irradiación, sólo el área pequeña de la piel del flanco debe ser expuesto al haz de radiación. El irradiador debe estar ubicado en un centro de estériles y esterilización jaula apropiada debe ser observado cuando se entreguen los ratones a su área de vivienda estéril. Preparar la máquina de anestesia (como en los pasos 4.1 – 4.2) y anestesiar a un ratón a la vez en la cámara de inducción antes de su preparación para la irradiación. Retire el ratón desde la cámara de inducción, gently pellizcar la cinta de la piel y el lugar sobre el flanco y por debajo de la piel estirada, formando una solapa. Coloque el ratón en una etapa de plexiglás y cubre el cuerpo con una plantilla del plomo a medida (un diseño de trabajo es una caja rectangular con la parte inferior y al menos un extremo abierto, junto con una ventana lateral para permitir que la piel del flanco a pasar a través). Tire de la solapa de la piel a través de la ventana de la plantilla y la cinta suavemente el colgajo en el escenario. NOTA: La plantilla de encargo del plomo es lo suficientemente pequeño como para inmovilizar el ratón. Si la plantilla personalizada no inmovilizar completamente el ratón, a continuación, utilizar restrainers adicionales y / o administrar la ketamina (80 – 100 mg / kg) y xilazina (10 a 12,5 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal de mantener el ratón inmovilizada a través de toda la irradiación procedimiento. Coloque la etapa de plexiglás con la plantilla y el ratón en el irradiador. Determinar la configuración (distancia de la piel de la fuente de rayos x, el voltaje, la duración y amperaje) y entregar la dosis deseada (por ejemplo, 11 cm de un kVp x- 160fuente de rayos durante 2,5 minutos con 6,3 mA). NOTA: Tenga cuidado con la fuente de rayos X, siguiendo las directrices de uso de la máquina para evitar quemaduras y daños en el ADN. NOTA: ratones desnudos atímicos desarrollan descamación húmeda alrededor de 14 días después de la irradiación en respuesta a 35 Gy, pero sólo descamación irregular menor con 17 Gy. Tome el aparato y el ratón fuera del irradiador, retire el blindaje, retire la cinta y colocarla en una jaula de recuperación individual. Vuelva a colocar el puntero del ratón a su jaula compartida normal después de que se ha recuperado de la anestesia. Repita los pasos 5.2 a 5.4 para todos los ratones, y llevar a cabo un simulacro de operación en los ratones de control. Después de la irradiación, alojar a los animales en sus condiciones normales. Si se desarrolla un comportamiento anormal (por ejemplo, postura encorvada, lo que puede significar el dolor), consulte a un veterinario para diagnosticar el problema. alivio del dolor puede incluir la administración de 0,1 mg / kg por vía subcutánea buprenorfina o como lo indique el veterinario. Si la pérdida de peso no supere el 20% de lo normal body masa, casa por separado en su propia jaula y proporcionar alimentos de alto contenido de nutrientes. 6. Mediciones DOS de seguimiento Monitorear y medir la intensidad de la reacción de la piel mediante la técnica cuantitativa de DOS. La inspección visual de los cambios en la piel y los trabajos previos sugieren que los grandes cambios en los parámetros de DOS se puede esperar (en relación a la línea de base) alrededor de 6 – 12 días después de la irradiación de 3,4. Sin embargo, ya que los cambios apreciables pueden tener lugar incluso antes o después, dependiendo del modelo, otros puntos de tiempo de medición pueden ser útiles para investigar. Configurar equipos DOS y calibraciones que se describen en la sección 3.Prepare la máquina de anestesia y adquirir mediciones de DOS como se describe en la sección 4. 7. Post-Procesamiento de adquisición NOTA: Todos los pasos de la siguiente sección se realizan usando un programa personalizado creado en un entorno de software de alto rendimiento. convento de nomenclatura estándariones para cada archivo de adquisición espectral se emplean para permitir el procesamiento por lotes. Todas las etapas se ilustran en la Figura 2. Reste la línea de fondo (ruido de fondo) de todos los espectros medidos incluyendo la lectura de fondo. Restar la lectura de fondo, R bg (LED apagado), obtenido en el paso 3.3 a partir del espectro de medición, R meas. NOTA: Para el resto de este artículo todos los espectros se asume que es ruido de fondo y el fondo se restan y se utilizarán para R corr. Convertir R corr a la reflectancia absoluta, R abs, como se describe en las referencias 1,2 en la Sección 1. Obtener mediciones de reflectancia relativos, Rrel, en Intralipid 20%-fantasmas (Fresenius Kabi, Suecia) fantasmas con el aumento de 3% fracciones alícuotas de hasta 48% (es decir, 3%, 6%, 9%, …, 48%) y crear la trama de Rrel frente a la concentración Intralipid. Generar una trama absoluta de R abdominales y frente# 956; s 'usando la ecuación de difusión de reflectancia 14. Coinciden con el pico de ambas curvas y ajustar el eje x Rrel para que coincida con el eje x R abs. En una longitud de onda y la fuente-detector separación dada, la escala del eje y usando: NOTA: En la siguiente sección, todo apropiado de las mediciones se referirá a R abs. Fitting 8. Datos espectrales NOTA: La siguiente sección describe la teoría y algoritmo de ajuste utilizado para la extracción de los parámetros funcionales de la piel de ratones. Para toda la teoría empleada, consulte los siguientes artículos 14-18 y las referencias en él. Todas las ecuaciones se supone que ser programado en un entorno de software científico de gama alta (que contiene módulos preprogramados) comúnmente utilizado en física o ingeniería laboratorios. Programar una función que describe la unaespectro bsorption, mu a (λ) de la piel como la suma de cromóforos individuales relevantes en el rango espectral de interés utilizando la ecuación: Aquí, H b es la concentración total de hemoglobina (g / L), mientras que StO 2 es la saturación de oxígeno sin unidades que van de 0 a 1. Obtener oxi, Y desoxi, , Los espectros de hemoglobina (almacenados como archivos de texto) de la colección en línea de Prahl 19. Programar una función que describe el espectro de dispersión de la piel, , Utilizando una dependencia de ley de potencia, en donde A (cm-1) es el valor de μ s 'en λ o = 1 nm y k es un factor de potencia dependiente medio16. Programar una función matemática para el modelo directo de reflectancia difusa basado en las ecuaciones de referencia 14 que incorporan las ecuaciones espectrales de los Pasos 8.2 a 8.3 en la función de modelo directo (es decir, R (r, mu un (λ), mu s '(λ )) = R (r, H b, StO 2, A, k). NOTA: Si bien existen varios modelos, la ecuación de la teoría de difusión en estado estacionario ofrece una descripción sencilla y precisa de la distribución de la luz en el tejido. Programar una función que los cuadrados de la diferencia entre el delantero modelado espectros de reflectancia de la Sección 8.4 y los espectros de reflectancia medido. Iterativa cambiar H b, STO 2, A y K hasta que la función menor diferencia cuadrados en la sección 8.5 es más pequeño. lsqcurvefit de MatLab se puede utilizar para realizar automáticamente este paso. REPEAt pasos 8/5 a 8/6 para obtener parámetros de DOS (H b, StO 2, A, y k) para todos los conjuntos de datos de reflectancia medidos. Trazar el cambio relativo en el parámetro DOS con el correspondiente medida de referencia único utilizando el promedio de un conjunto de 3 de cada ratón – 5 mediciones puntuales sonda normalizados. Estas parcelas se crean con el comando de MATLAB parcela. 9. Período de puntuación visual de la radiación Dermatitis Vigilar y anotar la intensidad de la reacción de la piel usando una escala de calificación cualitativa (véase Douglas y Fowler escala de clasificación 20) después de la irradiación cada 48 horas (también se puede observar los cambios 3 – 24 horas después de la irradiación). Dos investigadores ciegos son ideales. La adquisición de fotografías con una cámara y referencia escala de mano (es decir, una regla) puede ayudar con las evaluaciones. NOTA: Clasificación de la piel cada dos días después de la irradiación puede ayudar a determinar los momentos óptimos de medición DOS FOr el modelo. Más de puntuación frecuente puede producir datos importantes dependiendo del modelo y el problema de investigación. Trazar la mediana de cada grupo en cada punto de tiempo. Comparar los grupos en momentos específicos o las áreas globales medias debajo de cada curva. Después los ratones se han seguido hasta el punto de cicatrización de la piel que se desea (por ejemplo, 4 semanas), la eutanasia a los ratones mediante un método apropiado (aprobado).