マウスモデルを用いた急性電離放射線による皮膚毒性の定量的評価のための光学分光拡散

以下の方法は、サニーブルック研究所動物実験倫理委員会のガイドラインに従っています。 1.拡散反射分光システム以前に記載されているハンドヘルド、光ファイバープローブとポータブル分光取得システム（Kim ら2010）を用いて拡散反射スペクトルを収集し、簡単に完全1,2については、 図1（及び関連するキャプション）に概説されています。 急性放射線皮膚損傷のマウスモデルの作製そして彼らは、実験を開始する前の週のための動物施設に順応することを可能にする（例えば、無胸腺またはSKH-1として好ましくは毛のない、）注文6週齢のマウス。リザーブ非照射対照群では、少なくとも3匹のマウスと照射群5匹のマウス。 ベースラインDOSの測定および照射前に、耳パンチまたは永久的なマーカーメートルを使用して、マウスをラベル尾部にarkings。マウスがヌードでない場合は、フランク皮膚の2cmのパッチで2センチメートルの毛を削除するが、これは皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。 3.拡散光分光データ集録電子機器への電源供給をオンにします。 マウスの皮膚の場合は、ボックスカーフィルタの幅の収集時間を25ミリ秒、信号平均化のための25と1を入力して収集ソフトウェア用の信号パラメータを設定します。これらのパラメータは、ノイズに取得時間と信号との間の合理的なバランスを提供しています。 カスタムプログラムされた収集ソフトウェアを使用して、自動的に、2光源-検出器分離距離でのバックグラウンド読み取り、RのBG（LED消灯）と拡散反射率を獲得し、「取得」ボタンをクリックすることにより、RのMEAS（260ミクロン、520ミクロン）。総取得時間は約2秒です。 測定を行う前に、室内灯スイッチを押して、すべての室内蛍光灯のスイッチをオフにします。 注：FluorescENTの室内光検出信号（これらの光は、時間的に変化する光強度を生成し、従って、バックグラウンド信号として減算することは困難である）に干渉する。なお、白熱電球は、（ノイズと悪い信号）高いバックグラウンドレベルを回避するために、DOSプローブからある距離に光を保つ使用してもよいです。 4.動物麻酔およびベースラインDOS測定すべての接続を調べて、液体イソフルランレベルが適切であることを保証することによって麻酔マシンを準備します。 DOSプローブの快適な手の届くところに滅菌し、そっとパッド入りの表面までテープで固定することができる接続チューブおよびノー​​ズコーンで麻酔導入チャンバーを使用します。 30秒間、4％イソフルランで誘導することにより、誘導チャンバ内の時間でのマウスのケージをAnaesthetize。次の2分間、2％のイソフルラン量を下げます。マウスが後肢のつま先をつまんからの応答を観察しないことにより、麻酔されていることを確認します。 早く滅菌DOSプロービング領域に1マウスを移動し、その側の上に置き、ノーズ​​コーンにその鼻を固定し、麻酔の流れ（2％イソフルラン）にノーズコーンチューブを開きます。 注：手順は、長い1以上かかる場合 – 2分、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。 マウス皮膚測定値を取得する前に、70％エタノールで拭くことによって、プローブを滅菌します。皮膚を殺菌しないでください。 地元の血管系の分散を避けるために確認して脇腹肌に優しくプローブを配置します。測定時間のために手でプローブを保持します。 ダイ上に5ドット形成に従って、2 cmの（被照射領域）で約2cmの脇腹皮膚領域をプロービングすることによって反射率データを取得します。すべての後続の測定のために一貫性のあるこのプロービングパターン、エリア、プローブ圧力と本体側（左または右）を保管してください。 注：完全なスキャンは約60秒かかります。プローブ圧はリットルを分散させずにスキャンを取得するだけで十分なはずですOCAL血管系。 回復ケージにマウスを移動し、DOSプロービングエリアの隣に、マウスを上に移動。すべてのマウスが測定されるまで、4.6 – を繰り返して、4.2を繰り返します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。 5.動物の照射注：このプロトコルは、照射の使用を必要とし、動物の準備は、照射装置のニーズを満たすように調整される必要があり得ます。照射中、フランク皮膚の小さな領域のみを放射ビームにさらされるべきです。照射は、滅菌施設に配置する必要があり、それらの無菌住宅エリアにマウスを返すとき、適切なケージ滅菌が観察されるはずです。 （ステップ4.1のように – 4.2）麻酔器を準備し、照射のためにそれを準備する前に誘導室で一度に1つずつのマウスをanaesthetize。 誘導室、GENからマウスを削除しますTLYフラップを形成し、延伸皮膚の上や下にフランク皮膚や場所テープをつまみます。 プレキシガラスのステージ上にマウスを置き、カスタムリードジグで体をカバー（ワーキングデザインが脇腹の皮膚が貫通引かれることを可能にするサイドウィンドウと一緒に、有底の長方形の箱であり、少なくとも1つの端オープン）。ジグの窓から皮膚弁を引き出し、ゆっくりとステージにフラップをテープで固定します。 注：カスタムリードジグマウスを固定化するのに十分に小さいです。全体の照射にわたって固定化マウスを維持する腹腔内注射を介して – （12.5ミリグラム/ kgの10） – カスタム治具が完全にマウスを固定しない場合には、追加のレストレーナーを使用し、および/またはケタミン投与（80を100mg / kg）およびキシラジンを手順。 照射への治具やマウスでプレキシガラスのステージを配置します。設定（X線源、電圧、継続時間およびアンペア数から皮膚までの距離）を決定し、所望の用量を送達（ 例えば、160 kVpのx軸から11センチメートル6.3ミリアンペアで2.5分間線源）。 注：火傷やDNAの損傷を避けるために、マシンの使用のガイドラインに従うことにより、X線源と注意を使用してください。 注：胸腺欠損ヌードマウスは、14日の周り湿性落屑を開発35 Gyのに応じて照射を投稿したが、17 Gyを持つ唯一のマイナーな斑状落屑。 照射のうち、装置およびマウスを取り、シールドを取り外し、テープを除去して、個々の回復ケージに入れてください。それは麻酔から回復した後、通常の共有ケージにマウスを返します。繰り返しは5.2手順 – すべてのマウスのための5.4、および対照マウスに偽手術を行います。 照射後、彼らの定期的な条件で動物を収容します。異常行動は（痛みを意味例えば 、猫背の姿勢を、）開発した場合は、問題を診断するために獣医師に相談してください。痛みの緩和が0.1ミリグラム/キログラムブプレノルフィン皮下または獣医師が監督としての投与を含むことができます。重量損失は、通常のBの20％を超える場合ODY質量、独自のケージ内の別々の家にそれを、高栄養食品を提供します。 6.フォローアップDOS測定監視および定量DOS技術を使用して皮膚反応の強度を測定します。皮膚の変化と前作の目視検査6の周囲（ベースラインと比較して）DOSパラメータの大きな変化が期待できることを示唆している-照射3,4次の12日間。かなりの変化がモデルによっても前または後に行うことができるので、他の測定時点で調査するのに有用であり得ます。 DOS機器およびセクション4で説明したように麻酔器とは、DOSの測定値を取得3.Prepareセクションで説明したようにキャリブレーションを設定します。 7.ポスト取得処理注：以下のセクションのすべてのステップは、高性能ソフトウェア環境で作成されたカスタムプログラムを使用して行われます。標準化された命名修道院各スペクトルの取得ファイルのイオンは、バッチ処理を可能にするために使用されます。すべてのステップは、図2に示されています。 バックグラウンドの読みを含むすべての測定スペクトルからベースライン（ノイズフロア）を引きます。 測定スペクトルは、R MEASからステップ3.3で得られたバックグラウンド読み取り、RのBG（LED消灯）を、減算。 注：この資料の残りの部分については、全てのスペクトルがノイズ・フロアと背景であると仮定されている減算およびR corrのと呼ばれます。 第1節での文献1,2に記載されているように、絶対反射率、R 絶対にR CORRを変換します。 相対反射率測定値を得る、Rrelは、イントラリピド、20％ファントム（フレゼニウスカービ、スウェーデン）で48％まで、3％のアリコート画分の増加と共にファントム（ すなわち、3％、6％、9％、…、48％）とイントラリピッド濃度に対するRrelのプロットを作成します。 ＆R対絶対の絶対的プロットを生成します＃956; s ' を反射するための拡散方程式を使用して14。 両方の曲線のピークと一致し、Rの腹筋 x軸と一致するようにRrelのx軸を調整します。 所与の波長及び光源 – 検出器の分離に使用したY軸スケール： 注：以下のセクションでは、すべての測定値のフィッティングは、R 腹筋を参照します。 8.スペクトルデータのフィッティング注：以下のセクションでは、マウスの皮膚の機能的パラメータを抽出するために利用理論とフィッティングアルゴリズムの概要を説明します。用いられるすべての理論については、その中に以下の記事14-18及び参考文献を参照してください。すべての式は、一般的に、物理学や工学の研究室で使用される（事前にプログラムモジュールを含む）、ハイエンドの科学的なソフトウェア環境でプログラムされているものとします。 Aプログラムを記述機能bsorptionスペクトルは、式を用いて、関心のスペクトル範囲内の関連する個々の発色団の和として皮膚の（λ）をμ： STO 2は 0から1までの範囲の単位なしの酸素飽和度であるが、ここで、H bは 、総ヘモグロビン濃度（G / L）です。 オキシを取得し、 、およびデオキシ、 プラール19のオンラインコレクションから（テキストファイルとして保存されている）、ヘモグロビンスペクトル。 プログラムの皮膚の散乱スペクトルを説明する機能、 、（センチ-1）= 1 nmのoを λでμ 秒 'の値であり、kは、メディア依存の力率であるべき乗則依存性を、使用して16。 順モデル関数に8.3（ すなわち 、R（rは、（λ）、S '（λ、μμ -プログラムのステップからのスペクトルの式を組み込む参照14からの式に基づいて拡散反射率の順モデルのための数学関数8.2 ））= R（R、H、B、STO 2、A、K）。 注：さまざまなモデルが存在するが、定常状態拡散理論方程式は、組織内の光分布の簡単かつ正確な説明を提供します。 プログラムの四角は、前方の差は8.4項および測定反射スペクトルから反射スペクトルをモデル化機能。 8.5節での最小二乗差関数が最小になるまで反復してH bの 、STO 2、A、及びkを変更します。 MATLABのlsqcurvefitは、自動的にこのステップを実行するために使用することができます。 Repeaすべての測定された反射率データセットのDOSパラメータ（H bの 、STO 2、A、及びk）を得るために、8.6 – tは8.5ステップ。 5正規化されたプローブのスポット測定 – 3の各マウスのセットの平均値を用いて、対応するユニークなベースライン測定値とDOSパラメータの相対的な変化をプロットします。これらのプロットは、MATLABのplotコマンドを使用して作成されます。 9.ビジュアル放射線皮膚炎スコアリング期間 （ -照射後24時間1も変更3を観察することができる）毎に48時間照射後（ダグラスとファウラー評価尺度20を参照） を監視し、定性的な評価尺度を用いた皮膚反応の強さを獲得。二つ盲検研究者らは理想的です。手持ちカメラと基準スケール（ すなわち、定規）で写真を取得したことで評価を支援することができます。 注：2日毎照射後の得点肌がfoの最適なDOSの測定時間を決定するのに役立つことがありモデルrを。より頻繁なスコアリングモデルや研究の質問に応じて重要なデータをもたらすことができます。 各時点で、各群の中央値をプロットします。特定の時点または各曲線下の中央値は、全体的な領域でグループを比較してください。 マウスが所望される皮膚の治癒の点（ 例えば 、4週間）に続いされた後、適切な（承認）法により、マウスを安楽死させます。