Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri
Summary
Bu kulak ve farelerin kuyrukları primer fibroblastlar üretilmesi için basit ve hızlı bir deney prosedürü tarif etmektedir. Prosedür özel hayvan eğitim gerektirmeyen ve 10 gün oda sıcaklığında saklanan kulaklardan fibroblast kültürlerin üretimi için de kullanılabilir.
Abstract
Birincil hücreler doku şirketinden elde edilir yerleşmiş hücre hatlarında ve daha etkin in vivo hücre fizyolojik durumu daha iyi temsil olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, birincil hücre kültürleri, genellikle sınırlı bir ömre sahiptir ve sık sık yeniden tesis edilmesi gerekir. Fibroblastlar primer hücre kolay ulaşılabilir bir kaynağıdır. Burada, kulakları ve farelerin kuyrukları primer fibroblast kültürleri kurmak için basit ve hızlı bir deneysel prosedür tartışır. Protokolü için 10 gün süreyle oda sıcaklığında depolanan kulak birincil fibroblast kültürleri oluşturmak için de kullanılabilir. Protokol dikkatle takip edildiğinde, bulaşmalar bazı durumlarda uzun süre saklanan steril olmayan doku kullanımına rağmen ortaya çıkması olası değildir. Fibroblastlar kültürde hızla çoğalırlar ve replikatif yaşlanmayı geçmeden önce önemli sayıda genişletilebilir.
Introduction
Birincil hücreler, in vitro koşullarda doku ve kültüre canlı elde edilir. Genellikle birincil hücreler daha yakından fizyolojik durumu ve ölümsüzleştirilmiş veya tümör hücre çizgileri 1 den kaynaklandığı doku genetik yapısının benzer olduğu varsayılır. Bu nedenle, birincil hücreler biyolojik sorular 2,3 eğitimi için yararlı bir model oluşturmaktadır. Ancak, sonsuza kadar büyümesine kurulan hücre hatları aksine, birincil hücreler sonunda kültürdeki yaşlanmayı geçmesi ve sık sık yeniden oluşturulması gerekmektedir.
Yaygın olarak kullanılan birincil hücreler, fibroblastlar, epitel hücreleri, endoteliyel hücreler, T hücreleri, B hücreleri, kemik iliği türevli makrofajlar (BMDM) ve kemik iliği türevli dendritik hücreleri (BMDC) içerir. Fibroblastlar, genellikle birincil hücre kültürü modeli olarak kullanılır. Onlar diğer birincil hücreler üzerinde önemli avantajlar sunuyoruz. Hücre kültürleri kolayca kolayca muhafaza kurulmuş ve hiçbir purifica gerektirirkültür öncesi hücrelerin tion. Onlar, hızlı başlangıç çoğalması ve uzman, orta veya aktivasyon protokolleri için hiçbir şartı var. Fibroblastlar verimli biyolojik, kimyasal ve fiziksel protokolleri 4,5 ile transfekte edilebilir. Hücre kültürleri kurulmadan önce oda sıcaklığında en fazla 10 gün süreyle kulaklarını saklamak için bir olasılık var. Fibroblast kültürleri sitoplazmik süreçlerin görselleştirme için elverişli ve uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden 6 içine yeniden programlanması için uygundur.
Fibroblastlar kollajen proteinleri ve hücre dışı matriks 7 salgılayan bağ dokusunun önemli hücreleridir. Bunlar birçok dokuda 8 yapısal çerçeve sağlar ve yara iyileşmesi ve doku onarımı, 9,10 önemli bir rol oynar.
Burada, biz fibroblast kulaklar kültür ve farelerin 11 kuyrukları kurmak için basit ve hızlı bir (<4 saat) protokol açıklar. Protokol minimal fare gerektirirdeneyimi (diğer protokollere 12,13 aksine) dokular hasat ve 10 gün oda sıcaklığında ortamında saklanır kulak kültürleri oluşturmak için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada kulakları ve farelerin kuyrukları primer fibroblast kültürleri kurmak için, basit, ucuz ve hızlı bir deneysel prosedür sağlar. Ekstraksiyon doku 3 gün sonra izole olan yapışık ve hızlı bölünen fibroblastlar ile sonuçlanmalıdır. Primer hücrelerin önemli bir sınırlama yaşlanması, kalıcı bir büyüme tutuklama 15'dir. Fibroblastlar yaşlanmış hale gelmeden önce protokolü kullanarak, fibroblast kültürleri boyutu (3/2 katı artış) ve genişletmek için başarısızlı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.
Materials
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
