Summary

マウスの耳としっぽの組織から生成初代線維芽細胞培養

Published: January 10, 2016
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Summary

我々は、マウスの耳と尾から初代線維芽細胞を生成するための簡単​​かつ迅速に実験手順を説明します。手順は、特別の動物の訓練を必要とせず、最大10日間室温で保存された耳からの線維芽細胞培養物の生成のために使用することができます。

Abstract

初代細胞は、組織から直接誘導され、確立された細胞株よりも、インビボでの細胞の生理学的状態をより代表すると考えられています。しかし、初代細胞培養は通常、有限の寿命を有しており、頻繁に再確立される必要があります。線維芽細胞は、初代​​細胞の容易にアクセス可能な供給源です。ここでは、マウスの耳と尾からの一次線維芽細胞培養物を確立するための簡単​​かつ迅速な実験手順を説明します。プロトコルは、最大10日間室温で保存された耳からの一次線維芽細胞培養物を確立するために使用することができます。プロトコルを注意深く続く場合、汚染は、場合によっては長時間保存された非滅菌組織を使用しても発生しにくいです。線維芽細胞は、培養液中で急速に増殖し、複製老化を受ける前に、かなりの数に拡張することができます。

Introduction

初代細胞 、in vitro条件下で組織培養を生きから誘導されます。それは一般的に一次細胞は、より密接に生理学的状態、それらが不死化より由来する組織または腫瘍細胞株1の遺伝的背景に似ていることが想定されます。そのため、一次細胞は、生物学的な質問の2,3を研究するための有用なモデルを表します。しかし、無制限に成長する樹立細胞株とは異なり、一次細胞培養物は、最終的に老化を受け、頻繁に再確立される必要があります。

一般的に使用される一次細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、T細胞、B細胞、骨髄由来マクロファージ(BMDM)及び骨髄由来樹状細胞(BMDC)を含みます。線維芽細胞は、多くの場合、一次細胞培養モデルとして利用されます。彼らは、他の一次細胞を超える重要な利点を提供します。細胞培養物は、簡単に容易に維持し、設立され、何のpurificaを必要とされていません培養前の細胞の化。彼らは、迅速な初期の増殖および特殊な媒体や活性化のプロトコルのための要件が​​あります。線維芽細胞は、効率的に4,5、生物学的、化学的、および物理的なプロトコルを使用してトランスフェクトすることができます。細胞培養を確立する前に、室温で最大10日間の耳を格納する可能性があります。線維芽細胞培養物は、細胞質プロセスの可視化に資すると人工多能性幹(iPS)細胞6に再プログラミングするのに適しています。

線維芽細胞は、コラーゲンタンパク質及び細胞外マトリックス7を分泌する結合組織の重要な細胞です。彼らは多くの組織8の構造フレームワークを提供し、創傷治癒および組織修復9,10において重要な役割を果たしています。

ここでは、マウス11の耳と尾から線維芽細胞培養物を確立するための簡単かつ迅速(<4時間)プロトコルを記述します。プロトコルは、最小限のマウスが必要です経験は、(他のプロトコル12,13とは対照的に)組織を採取し、最大10日間室温で媒体に記憶された耳からの培養物を確立するために使用することができます。

Protocol

マウスを安楽死(シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)のガイドラインおよび実験動物研究のための国家諮問委員会(NACLAR)ガイドライン)まで機関のガイドラインに準拠して無菌状態で飼育しました。 1.マウス適切な遺伝的背景の一つにマウスを注文。このプロトコルは、1つのC57BL / 6マウス由来の組織に基づいています。 完全培?…

Representative Results

組織破片のかなりの量の組織の結果からの線維芽細胞の抽出( 図1)。組織片とは対照的に、線維芽細胞を1日培養の3との間の組織培養プラスチック表面に付着します。線維芽細胞培養物の培地は、安全に大幅文化( 図2)に存在するデブリのレベルを減少させるべきである文化、の3日目に変更することができます。線維芽細胞は、細長い形態とはっきりと見える細?…

Discussion

ここでは、マウスの耳と尾からの一次線維芽細胞培養物を確立するために、単純な、安価で高速な実験手順を提供します。抽出は、組織の3日後に分離以内に付着し、急速に分裂する線維芽細胞を生じるはずです。初代細胞の重要な制限は、老化、永久的な増殖停止15です。プロトコルを使用して、線維芽細胞培養物は、サイズの増加(2〜3倍の増加)と拡大に失敗、線維芽細胞が老化…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Materials

RPMI-1640 HyClone SH30027.01
Fetal Calf Serum HyClone SV30160.03
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Asparagine Sigma-Aldrich A4159
Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Ethanol Merck Millipore 107017 Absolute for analysis
Collagenase D Roche Diagnostics 11088866001 From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease Merck Millipore 53702 From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8) 1st BASE 1415 Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8) 1st BASE BUF-1053 Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) 1st BASE BUF-2040-10X4L Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X Sigma-Aldrich 59418C-100ML 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2492-20ml 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors Aesculap
Forcep Aesculap AE-BD312R
0.2 μM syringe filter Sartorius Stedim 16534
70 μM cell strainer SPL 93070
Syringe plunger Terumo SS+10L
Cryovial tube NUNC 368362
1.7 ml microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 cm cell culture dish Greiner 664160 Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tube Greiner 188271
50 ml conical bottom tube Greiner 227261
Water bath GFL 1002
Centrifuge Eppendorf 5810R
Incubation shaker Sartorius Stedim Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope Carl Zeiss AG

References

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Cite This Article
Khan, M., Gasser, S. Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues. J. Vis. Exp. (107), e53565, doi:10.3791/53565 (2016).

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