Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Linda M. Brennan; Mark W. Widder; Michael K. McAleer; Michael W. Mayo; Alex P. Greis; William H. van der Schalie

doi:10.3791/53555

JoVE Journal > Environment

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Environment

Получение и испытание импеданса на основе струйного биочипов с RTgill-W1 Клетки для быстрой оценки питьевой воды проб на токсичность

Published: March 07, 2016

doi:

10.3791/53555

Linda M. Brennan¹, Mark W. Widder¹, Michael K. McAleer², Michael W. Mayo², Alex P. Greis², William H. van der Schalie¹

¹U.S. Army Center for Environmental Health Research, ²Nanohmics, Inc.

Summary

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Abstract

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

Introduction

Общая цель состояла в том, чтобы разработать метод для посева клеток, хранения и испытания жидкостных биочипов в биосенсора ВЕ. Цель для развития этого биосенсора должен был встретить спецификации армии США для полевого портативного устройства, которые могли бы обнаружить возможное загрязнение источников питьевой воды используются солдатами. Требования, предъявляемые к датчику токсичности были, что он может обнаружить широкий спектр токсичных промышленных соединений, быстро (в течение часа) при концентрациях, имеющих отношение к здоровью человека, что устройство будет полевой переносной, и биологические компоненты будут иметь срок годности по крайней мере, девять месяцев. Охлаждение, но не замораживать, скоропортящихся компонентов является приемлемым.

Исторически сложилось так , полевые портативные технологии тестирования воды с биологическим компонентом для них (такие как антитела, ферменты, или нуклеиновых кислот) были аналита конкретных ^1-3. Недостатком этих типов биосенсоров является то, что они будут ONlY обнаружить один тип химического вещества, в то время. Несколько датчиков необходимы, если есть подозрение, что более чем один химический присутствует. Если конкретный датчик не находится в тестовом репертуаром, химические загрязняющие вещества в воде может оставаться нераспознанной.

Датчики токсичности на широкой основе, с другой стороны, есть потенциал, чтобы заполнить этот технологический разрыв. Они , как правило , имеют клеточный компонент для них ^4-8. Преимущества биосенсоров токсичности широкой основе, что они могут обнаружить наличие широкого спектра химических примесей, включая смеси и неизвестных, в течение относительно короткого периода времени , ^5,9,10.

Концепция использования измерения электрического импеданса клеток монослоев в качестве возможного датчика токсичности, которая также известна как электрическая клетка-субстрат зондирования импеданса (ВЕ), впервые был описан Гиавера и Keese ^11. За последние два десятилетия было показано, чтобы быть чувствительным индикатором клеток viability и цитотоксичность. В основном, клеточный монослой, который приклеен к электродам на биочипов подвергается воздействию высокой частоты и низкого напряжения и силы тока сигнал переменного тока. Сливающийся монослой клеток препятствует потоку электронов. Когда целостность клеточного монослоя скомпрометирована (например, когда вводится токсичный химикат), датчик ЕСНГ регистрирует изменение электрического импеданса ^11-14. На рисунке 1 показан принцип ЕСНГ по отношению к монослое клеток на биочипа ,

Рисунок 1:.. Принцип ЕСНГ Иллюстрация монослоя клеток на биочип с упрощена читателем ЕСНГ электрической схеме Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

<p class="jove_content"> Первоначально клеточные линии млекопитающих были высеяны в жидкостных биочипов и использовались в сенсорной технологии ВЕ , описанной здесь ^12. Эти клетки были не практичны для использования в полевых условиях , однако, поскольку они требовали изменения частые СМИ, имели ограниченный срок годности, и требует искусственного CO ₂ окружающей среды и температуры инкубации C 37 °. Было обнаружено , что коммерчески доступная клеточная линия получена из радужной форели жаберной эпителиальных клеток (RTgill W-1 клетки) могут быть испытаны при комнатной температуре при атмосферном СО _2, образуется сливающийся монослой в биочипов, можно было бы хранить при пониженных температурах, и был быстрый ответ (1 час или менее) к широкому спектру химических веществ в концентрациях , имеющих отношение к здоровью человека ^12. Применение клеток RTgill-W1 в токсикологии, а также в области фундаментальных исследований, рассматриваются Ли и др. ¹⁵

Способы сева, хранения и испытания жидкостных биочипов, содержащихмонослои RTgill-W1 клеток на жидкостных биочипов в качестве ЕСНГ биосенсора описаны здесь. Жидкостный биочипы могут храниться до 9 месяцев в охлажденном состоянии и могут быть отправлены в контейнере хранения в холодильнике, для тестирования питьевой воды supplies.The сопровождающих читателей ЕСНГ или зачетных единиц, поставляются отдельно. Биочипы имеют два компонента на них; верхний слой из поликарбоната с двумя отдельными проточные каналы, а нижний электронный слой, который содержит четыре пусковые площадки электрода на канал для зондирования импеданса. Есть 10 рабочих электродов на площадку; каждый из электродов составляет 250 мкм в диаметре. Собранные биочипы имеют золотой электрод соединения для приобретения показаний импеданса при вставке в тест ЕСНГ блока. Каждый из двух закрытых жидкостных U-образный каналов будет содержать 2 мл клеточной суспензии RTgill-W1. На рисунке 2 показана жидкостный биочипа в считывающее ВЕ с увеличением сливающийся клеток на одном чувствительного электрода.

Рисунок 2:.. Жидкостная биочипа в ВЕ чтения Увеличенная область показывает сливающийся монослой клеток RTgill-W1 на одном чувствительного электрода Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Protocol

1. Подготовка тестовых материалов Примечание: Для того, чтобы подготовить биочипов для тестирования несколько сливающихся колбах клеток RTgill-W1 должны быть готовы. Хорошая оценка количества колб необходимых один сливающийся T175 колбу на 16 биочипы, чтобы быть посеяны. Выполните следующие действия в классе II кабинете биологической безопасности (biohood) с использованием асептической техники. Используйте 70% этанола для дезинфекции biohood и любые материалы, размещенные в капюшоне. Готовят фибронектина субстрат для струйного биочипов таянием 1 мг флакона фибронектина в и разбавляя в 100 мл стерильной L-15 средств массовой информации для концентрации 10 мкг / мл. Замораживание в 40 мл аликвоты в стерильные 50 мл конические полипропиленовые пробирки при -20 ° C. Разморозить при комнатной температуре несколько часов до посева биочипов. После оттаивания, не замораживать. Подготовка среды для культивирования клеток путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки, 5 мл 200 мМ L-аланил-L-глутамин SUPдополняют, и 5 мл раствора пенициллина / стрептомицина (10000 единиц пенициллина / мл и 10000 мкг стрептомицина / мл) запас до 500 мл L-15 средств массовой информации. Это даст 560 мл среды для культивирования клеток, содержащих 9% сыворотки. Охладить. Примечание: Это будет полная среды для культивирования клеток использовали для колб культуры и биочипов. Порошковые СМИ Флаконы Приготовьте заранее 0,1 Драм оснастке колпачковые флаконах, содержащих 60 мг ± 0,5% L-15ex порошка с использованием автоматического порошкового дозатора. Этикетка флаконов с датой порошок был разлит и охладите в флаконах (в количестве 50) в Recloseable металлизированные поли мешками; каждая из которых содержит три 1 г силикагеля усыхания пакеты. Примечание: L-15ex порошкообразные средства массовой информации флаконы могут быть сделаны и храниться до 9 месяцев до начала тестирования. Приготовьте раствор из 100 мл 20% хлорной извести путем разбавления бытового отбеливателя деионизированной (ДИ) воды. Подсчитали, что 5 мл раствора хлорной извести будут необходимы для каждого биochip. Сделайте биочип насосно-компрессорных агрегатов путем разрезания 27 мм секций автоклавируемого биосовместимого труб (2 секции для каждого биочипа быть посеяна) и подходят для обоих концов трубки с поликарбонатной скольжения Luer фитингов. Установите трубные узлы в автоклавируемом мешок и автоклаве в течение 8 минут при 134 ° C. Также автоклав пробки биочип (2 на биочип) в отдельном пакете при тех же настройках. DI вода автоклава в течение 30 мин at121 ° C. Примечание: Эта вода будет использоваться для промывки биочипов после высева. Подсчитали, что 10 мл потребуется для каждого биочипа. Примечание: Фактический объем каждого биочипа канала составляет 2 мл, а в 5 мл стерильной воды смывают через каждый канал после удаления раствора хлорной извести. Сделайте инъекции шприц насосно-компрессорных агрегатов путем разрезания 27 мм секций биосовместимого трубки и крепления мужчин скольжения Luer фитинги к обоим концам трубки. Поместите трубные сборки в бумажной термосвариваемого стерилизации мешок и автоклаве в течение 8 мин при 134 &# 176; C. 2. Жидкостная Процедура биочипа Посев Примечание: Выполнить все процедуры, где биочипов или средств массовой информации осуществляется в кабинете биологической безопасности класса II с использованием асептической техники. Двадцать четыре часа до запланированного посева, удалите биочипов от производителя упаковки в biohood и место в стерилизованные пластиковые ящики для инструментов. Стерилизовать биочипов с использованием 20% -ного раствора хлорной извести следующим образом Примечание: Исторически сложилось так, эта процедура отбеливания предотвратило рост грибка в биочипов при длительном хранении в том случае, если плазма стерилизация биочипов выполнены изготовителем не было эффективным. Используя 20 мл стерильного шприца с инъекционной трубки шприца в сборе прилагается и работает в biohood, вводят 2 мл 20% раствора хлорной извести в каждый канал биочипа. Разрешить биочипы сидеть в течение 1 часа с отбеливающим раствором. Через один час, вакуумный осиныРазгневанные отбеливателя раствора из обоих каналов с использованием стерильных самцов скольжения Люэра узел, присоединенный к всасывающей трубке вакуум. Используйте один из биочипа труб сборок в качестве дренажа при ополаскивании биочипов. С помощью стерильной 20 мл шприц, присоединенный к стерильным шприцем сборки, промывать каждый канал чипа с помощью 5 мл стерильной воды, что позволяет избыток воды стечь в емкость в biohood. Затем вакуум-аспирата от воды, как описано выше для отбеливателя и поместите биочипов обратно в пластиковые ящики для инструментов и оставить в biohood пока не засевали клетками на следующий день. Шестьдесят мин перед посевом биочипы, вводят 2 мл 10 мкг / мл фибронектина раствора в каждый канал биочипа. Оставьте биочипов в biohood в течение 60 минут, а затем вакуум аспирация от фибронектина (как описано на стадии 2.2.3) перед посевом биочип с клетками. Поместите две секции стерильных биочип насосно-компрессорных агрегатов (смраздел 1.4) на портах биочипов. Trypsinize один сливающийся RTgill-W1 T175 колбу на каждые 16 биочипов с использованием процедур , описанных в Американской коллекции типовых культур (АТСС) продукта Описание листа 16. Аспирируйте от средств массовой информации из вырожденного колбы (ы) клеток. Ополосните слой клеток с 15 мл PBS и затем аспирата прочь. Добавить 6 мл трипсин / ЭДТА к слою клеток в каждой колбе Т175 и позволяют клеткам Trypsinize в течение ~ 5 мин. Добавьте 15 мл полной L-15 среды для культивирования клеток в каждую колбу, чтобы остановить трипсинизации. Смешайте суспензии клеток в стерильной одноразовой емкости. Примечание: Размер контейнера может варьироваться от 150-500 мл, в зависимости от количества биочипов будучи посеяны. Подсчитали, что 5 мл суспензии клеток будут необходимы в биочипа. Удалить ~ 1 мл клеточной суспензии и поместить в пробирку микроцентрифужных для подсчета. С помощью микроскопа с светлого в ObjectI 10Xве и гемоцитометра, подсчитывать 10 мкл аликвоты клеток и вычислить объем полной L-15 среды для культивирования клеток , необходимых для достижения клеточной суспензии в 2,5 х 10 5 клеток / мл. Примечание: При использовании суспензии клеток семян колб продолжать культуру, это будет точка, чтобы сделать это. Отрегулируйте концентрацию клеточной суспензии, используя полный L-15 среды для культивирования клеток. Используя стерильный 20 мл syringeattached к узлу впрыска трубки стерильный шприц (смотри раздел 1.6), вводят 2,5 мл клеточной суспензии во внешний порт каждого канала биочипа (то есть порты , которые не имеют трубки , присоединенные), позволяя некоторые дополнительные клеточной суспензии вытекать из трубки в контейнер для отходов в biohood. Примечание: Это будет гарантировать, что весь канал и присоединен трубопровод будет полна клеточной суспензии. Создание замкнутого цикла для каждого канала биочипов, вставив свободный конец шланга с Luer Fittiнг во внешние порты для каждого канала. Сотрите лишние носители от закрытых петель с бумажным полотенцем, смоченным 70% -ным этанолом и помещают биочипов обратно в пластиковой коробке в 20 ° C инкубатора. Дайте каждому биочипа уникальный идентификационный номер. В дни, 4 и 7, удалите из биочипов C инкубаторе 20 ° и пополнять средства массовой информации во всех биочипов с температурой уравновешенную полной L-15 среды для культивирования клеток. Выполните ту же процедуру, что и в шаге 2.6, за исключением использования только L-15 среды для культивирования клеток, вместо (отсутствие клеточной суспензии). Поместите биочипов обратно в инкубатор C 20 ° после кормления в 4-й день. После кормления 7-й день, снимите и выбросьте шланги от чипсов и вставьте автоклавного сливные пробки в биочипов. Поместите биочипов в коробку в C инкубаторе 6 ° С до использования для тестирования. Примечание: Чипы можно хранить при температурах в течение охлажденных до 9 месяцев и по-прежнему жизнеспособной для тестирования яп читателей ECIS. 3. Тестирование ECIS с биочипов Подготовка испытаний химических веществ при использовании. (См Бреннан и др., 2012 7 для приготовления исследуемых химических веществ). Удалить ECIS читателя и тестовые поставки из футляра. Удалить подготовленный биочип от 6 ° C инкубатора. Поместите биочипа на бумажное полотенце. Включите считыватель ВЕ. С помощью 10 мл шприцы, дозировать 10 мл контрольной воды в меченым 0,5 унции прозрачного пластика контрольной банку и 10 мл испытуемого образца в меченых 0,5 унции прозрачной пластмассы, тест-банку. Примечание: 1) Не забудьте удалить пузырьки для точного измерения. 2) Шприцы и банки имеют цветовую маркировку; синий для контроля и красный для испытания. Удалите два порошкообразных средств массовой флаконах из мешков из фольги. Откройте один из порошкообразных флаконах СМИ (используйте многоцелевой инструмент, если это необходимо) и вылить все содержимое одного флакона в банку с водой управления, сбросив весь флакон вРешение, а также. Повторите эту процедуру с помощью тестового банку. Cap и встряхните банки, чтобы гарантировать, что порошок растворяется. Заполните каждую из цветных 10 мл шприцы с 9 мл либо контроля (синий шприц) или растворов из соответствующих ампул теста (красный шприц). Удалить пузырьки воздуха из шприца. Удалите заглушки из портов биочипа и прикрепить слив. Поместите биочип в съемном пластиковый лоток в считывающее устройство ВЕ и закройте крышку. Прикрепите заполненные шприцы к внешним портам биочипа и прикрепить поршень шприца. На главном экране, выберите "NEXT", чтобы начать предварительный тест. Примечание: программа чтения будет проверять импедансов. Если полные сопротивления находятся в пределах диапазона , установленного пользователем (обычно от 1000 до 3000 Ом) на экране будет регистрировать "Патрон Зачет" , как показано на рисунке 3, и поручить пользователю выбрать "Next" и программное обеспечение будет перейти к этапу 3.10). Если полные сопротивления не находится в пределахзаданный диапазон из-за дефектного биочипа или неисправного подключения биочипа к читателю (как правило, из-за несовпадение электродов), то на экран будет регистрировать "Патрон Failed", и пользователь будет иметь возможность либо "Прервать" или "Проверка" тест. Выберите "Прервать", чтобы вернуться к шагу 3.9). Выберите "Подтвердить", чтобы перейти к этапу 3.10) после получения "Патрон" Пройдена сообщение и выбрав пункт "Next". Примечание: Лучше всего взять биочип, и визуально осмотрите его на предмет дефектов или утечки, если "Cartridge Failed" сообщение получено перед началом работы с новым биочипа. Рис . 3: ЕСНГ Читатель Скриншот биочипа с Приемлемые импедансных чтений Скриншот показывает начальные значения импеданса в Ом каждого из 4 соЭлектроды (управляете CE) и 4 тестируемый образец электроды (SE) в пределах струйного биочипа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. В ответ на запрос читателя, ввести информацию об образце с помощью экранной клавиатуры, а затем выберите "Принять", когда закончите. Примечание: программное обеспечение для чтения ЕСНГ автоматически штамповать каждый набор данных с указанием даты, времени и другой информации, введенной пользователем; таких как число биочипов, а также от типа химических и концентрации. Два мин данных импеданса будет собрана из вставленного биочипа и таймер на экране будет обратного отсчета времени. Через две минуты, когда будет предложено на экране инструкции, которые мигают в красном поле, нажмите кнопку "NEXT". При появлении мигающего зеленого ящика на "INJECT образцы в настоящее время", вводят контроль и тест-носитель из прилагаемых шприцев одновременно в биочипов ChannELS. Оставьте шприцы на месте на биочипов, когда закончите. Примечание: значения полного сопротивления будет собираться один раз в минуту в течение 60 мин. Если программное обеспечение для чтения ЕСНГ определяет, что канал лечения статистически отличается от канала управления в любой точке между 10 и 60 мин после начала теста, а затем на дисплее на экране будет указано, что образец "загрязненная". Если лечение не отличается от канала управления, то на экране появится надпись "не загрязняются Обнаруженные" в конце тестового прогона. Результаты испытаний Запись как загрязненные или не загрязнены для каждого образца. В конце теста, удалить и уничтожить биочип. Промыть и высушить на воздухе шприцы, тест-ампул и съемный пластиковый лоток в которых была размещена биочип во время испытаний. Примечание: Читатель ЕСНГ имеет 4 Гб встроенной памяти для оперативного программного обеспечения, модели управления и тестовые файлы, полученные от выполнения теста. Это позволяет в течение нескольких тысousand тестовые файлы, которые будут храниться на читателя. Файлы могут быть извлечены с прыгать диск USB и передается в компьютер для дальнейшего анализа в исследовательских целях, если это необходимо.

Representative Results

Технология ЕСНГ описанная в этой статье проходил испытания при Агентстве по охране окружающей среды США (USEPA) технологии тестирования полету АМС и программы оценки (TTEP). Тринадцать химических веществ были отобраны для тестирования в качестве представителей широкого спектра токсичных промышленных соединений, которые могут быть возможными загрязнителями питьевой воды. Во время тестирования, 9 из 13 были обнаружены ЕСНГ в пределах часа при концентрациях , которые имеют отношение к здоровью человека 8. В таблице 1 представлены результаты данного загрязняющего тестирования. Фиг.4 представляет то , что результат А "загрязненный" будет выглядеть читатель экрана ECIS. По большей части, клеточные импедансы уменьшилось на контаминированных образцов по сравнению с контрольной группой. Время от времени, некоторые соединения могут привести к увеличению импеданса. Кроме того, приведены в таблице 1 </sЧонг> является тестирование чистой воды. Сорок проб чистой воды проводились и никакого загрязнения не было обнаружено ни в одном из образцов (рисунок 5) для типичного снимка экрана "не загрязняются , не обнаружено". Рисунок 4: ЕСНГ Считыватель Скриншот из "гнойной" Проба воды Пример нормированных графики импеданса и результатов пробы воды , которая была загрязнена.. Синие линии представляют собой нормированные импедансы каждого из управляющих электродов; красные линии представляют собой нормированные импедансы каждого испытуемого образца электродов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5: ЕСНГ Читатель Скриншот из "не загрязняются , не обнаружено" Проба воды Пример нормированных графики импеданса и результатов пробы воды , которая не была загрязнена.. Синие линии представляют собой нормированные импедансы каждого из управляющих электродов; красные линии представляют собой нормированные импедансы каждого испытуемого образца электродов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. категория загрязнитель Испытанной концентрации (мг / л) 1 Обнаружен ≤1 час п = 4/4 чипы Пестициды Алдикарб 0,17 нет Арсен IC (Арсенит натрия) 4.5 да Азид (азид натрия) 46,7 да фенамифос 0,56 нет Метамидофос 1.4 нет Метилпаратион 33,6 да Paraquat (дихлорид) 4.6 нет Pentachlorophenate (натрия) 71,9 да Промышленные химикаты аммоний 924 да Медь (медь II сульфат) 103 да Цианид (натрия) 3 "> 14 да Ртуть (хлорид) 24,7 да Толуол 444 да Чистая вода 2 никто Не Доступно нет 1 тестированных концентрациях такие же , как в рукописи Widder и др. (2014). 2 40 чистых проб воды были работать без загрязнения. Таблица 1: Загрязнения в пробах воды , обнаруженную ECIS.

Discussion

Технология ЕСНГ хорошо зарекомендовал себя в лабораторных условиях и был в состоянии обнаружить потенциальные загрязнители воды в концентрациях, которые имеют отношение к здоровью человека. Переносимость и упаковка технологии делает ее более благоприятной для использования в полевых условиях.

Критические шаги в протоколе для успеха технологии заключаются в следующем: 1) поддержание асептических условий во время культивирования, посева, посадки и кормление биочипов, 2) Держите затравочный биочипов в охлажденных условиях до готовности для тестирования, так как клетки RTgill-W1 не переживет очень долго, когда они подвергаются воздействию температур выше 25 ° C, 3) аккуратно взвесьте L-15ex в порошкообразных флаконах СМИ и точно измерять образцы воды, чтобы избежать получения ложных срабатываний, которые могут быть вызваны сдвигом в осмоляльность средств массовой информации, а не токсичности образца, 4) Следуйте инструкции пользователя на экране ЕСНГ для запуска тестов. Программное обеспечение в считыватель будет предупреждать пользователя, если биochip неприемлемо для тестирования (на основе первоначальных показаний импеданса), когда биочип сначала вставляется в считывающее устройство. Если уровни импеданса неприемлемы для тестирования, программа не позволит пользователю продолжить тестирование до тех пор, пока используется новый биочип. Причины неприемлемых показаний импеданса, как правило, из-за небольшого перекоса биочипа электродов с читателем штифтами ЕСНГ или утечки жидкости вдоль одной из склейки краев биочипа.

Есть некоторые ограничения этой технологии, так как датчик ЕСНГ был протестирован только с питьевой водой, а не с поверхностными водами. Клетки RTgill-W1, которые находятся на биочипа не переносит заморозков или температуры гораздо выше 25 ° C в течение длительных периодов времени (временные рамки могут быть от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от величины температуры. Биочипы лучше всего функционируют в диапазоне температур от охлажденного до при комнатной температуре ^7. Они готовы к немедленному использованию, однако, сразу же после того , как гemoved из холодного хранения. Портативные контейнеры для хранения холодных в настоящее время используются персоналом армии в полевых условиях для чувствительных к температуре материалов. Эти же контейнеры могут быть использованы для ракетке биочипа транспорта.

Другой предел этой технологии заключается в том, что несмотря на то, что датчик токсичности широкого диапазона, он не реагирует хорошо, если вообще, к холинэстеразы ингибирующих соединений, таких как некоторые пестициды. Чтобы восполнить этот пробел функциональных возможностей, датчик ЕСНГ предназначен для использования в сочетании с коммерчески доступным тест анализа быстрым пестицида при испытании образцов воды для того, чтобы предоставить пользователю более широкий спектр испытаний на токсичность. Комплект представляет собой быстрый ферментативный тест предназначен для обнаружения фосфорорганическими и карбамата пестицидов в течение 30 мин.

Датчик ЕСНГ дополняет WQAS-ПМ (Система водоснабжения анализа качества – Профилактическое лечение) полевое испытание воды системы, в настоящее время используется военнослужащими профилактической медицины для обнаружения, ArsenIC, свинец, или цианида в образце питьевой воды. Хотя датчик ЕСНГ не определит, что загрязняющее вещество, оно будет указывать, если определенные металлы или органические соединения присутствуют, указывая, что вода не может быть пригодным для потребления человеком. Результаты испытаний ЕСНГ доступны в пределах часа. Пробы воды затем могут быть отправлены для дальнейшего анализа для идентификации загрязнителя, если есть положительный результат теста.

Как было описано выше, считыватель ЕСНГ предназначен, чтобы быть частью системы, которая включает в себя отдельный набор ферментативного ACE для того, чтобы охватить широкий спектр обнаружения загрязняющего. Оба этих читателей упаковываются в прочный кейс для транспортировки поля для использования в полевых условиях солдаты.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.

Materials

Fetal bovine serum	Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com	16000-085	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).
Fibronectin, bovine plasma	EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com	341631-1 mg	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips.
L-15 media without L-glutamine	Lonza www.lonzabioscience.com	12-700F	Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C.
L-15ex powdered media with phenol red	US Biological www.usbio.net	L1501	Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips.
PBS, w/o Ca++ or Mg++	Lonza www.lonzabioscience.com	17-516F	Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.
Trypsin, EDTA	Lonza www.lonzabioscience.com	CC-5012	Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks.
T175 culture flasks	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-30	Used for culturing RTgill-W1 cells.
Bleach	Chlorox www.chlorox.com		Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.
70 % ethyl alcohol			For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)	American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org	CRL-2523	Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM	Lonza www.lonzabioscience.com	35050-061	Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K	Lonza www.lonzabioscience.com	17-602E	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Pharmed BPT tubing	U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com	57317	Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies	Value Plastics	MTLS210-9	Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.
20 mL syringes, slip-tip	VWR Scientific us.vwr.com	BD302831	Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials	Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com	30600	Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"	Medi-Dose EPS medidose.com	IB701	Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips.
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13”	CardinalHealth www.cardinalhealth.com	90713	Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.
Quantos automated powder dispenser	Mettler Toledo www.mt.com	QB5	Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.
ECIS reader	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.
3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags	Uline www.uline.com	S-16893	Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.
Leatherman squirt ps4	Amazon www.Amazon.com		Used to open powdered media vials.
1 gram silica gel desiccant packets	Uline www.uline.com	S-3902	Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.
Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles	Fisher Scientific www.fishersci.com	09-740-25C or E	Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.
Plugs for biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C.
Drains for ECIS biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections.
Hemocytometer	Fisher Scientific www.fishersci.com	S17040	Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.
Brightfield microscope w/ 10X objective	Leitz Labovert		Any brightfield microscope is acceptable.
Class II biological safety cabinet			Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.
Microcentrifuge tubes, 0.6 mL	Fisher Scientific www.fishersci.com	02-681-311	Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells.
Slip 10 cc red syringes	Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com	S/49S 30-R	Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip.
Slip 10 cc blue syringes	Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com	S/49S 30-B	Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip.
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps	SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com	0605-30	Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing.
50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-269	Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C.

References

Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , 1-25 (2008).
van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
O’Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
. RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Brennan, L. M., Widder, M. W., McAleer, M. K., Mayo, M. W., Greis, A. P., van der Schalie, W. H. Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity. J. Vis. Exp. (109), e53555, doi:10.3791/53555 (2016).

Automatically Generated