Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Linda M. Brennan; Mark W. Widder; Michael K. McAleer; Michael W. Mayo; Alex P. Greis; William H. van der Schalie

doi:10.3791/53555

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Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

Published: March 07, 2016

doi:

10.3791/53555

Linda M. Brennan¹, Mark W. Widder¹, Michael K. McAleer², Michael W. Mayo², Alex P. Greis², William H. van der Schalie¹

¹U.S. Army Center for Environmental Health Research, ²Nanohmics, Inc.

Summary

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Abstract

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

Introduction

O objectivo global foi o de desenvolver um método para a sementeira de células, de armazenamento e ensaio de biochips fluídicos no biossensor ICE. A meta para o desenvolvimento deste biossensor foi para atender às especificações do Exército dos Estados Unidos para um dispositivo portátil de campo que poderia detectar uma possível contaminação do abastecimento de água potável sendo usado por soldados. Os requisitos para o sensor de toxicidade foram que poderia detectar um amplo espectro de compostos industriais tóxicos rapidamente (dentro de uma hora) em concentrações relevantes para a saúde humana, que o dispositivo ser campo-portátil, e os componentes biológicos que têm um prazo de validade de pelo menos, nove meses. Refrigeração, mas não de congelamento, de componentes perecíveis era aceitável.

Historicamente, tecnologias de teste de campo de água portátil com um componente biológico para eles (tais como anticorpos, enzimas, ou ácidos nucleicos) têm sido ^1-3 específico para a substância analisável. A desvantagem com estes tipos de biossensores é que eles vão ONLY detectar um tipo de química de cada vez. Vários sensores são necessários se suspeita-se que mais de um produto químico está presente. Se um sensor específico não é no repertório de teste, contaminantes químicos na água pode facilmente passar despercebido.

sensores de toxicidade de base ampla, por outro lado, têm o potencial para preencher esta lacuna tecnologia. Estes normalmente têm um componente celular para eles ^4-8. As vantagens de toxicidade biossensores baseados em larga são de que eles podem detectar a presença de uma grande variedade de contaminantes químicos, incluindo misturas e desconhecidos, num período relativamente curto de tempo ^5,9,10.

O conceito de utilizar a medição da impedância eléctrica de monocamadas de células como um sensor de toxicidade possível, o que também é conhecido como substrato de células eletro-impedância de detecção (ECIS), foi descrita pela primeira vez por Giaever e Keese ^11. Ao longo das últimas duas décadas tem sido demonstrado ser um indicador sensível da célula VIABility e citotoxicidade. Basicamente, a monocamada de células que é aderida aos eléctrodos nos biochips é exposta a alta frequência e de baixa voltagem e amperagem do sinal de corrente alternada. A monocamada confluente de células impede o fluxo de electrões. Quando a integridade da monocamada de células fica comprometida (por exemplo, quando uma substância química tóxica é introduzida), o sensor ECIS grava uma alteração na impedância eléctrica ^11-14. A Figura 1 ilustra o princípio das ICE em relação à monocamada de células no biochip .

Figura 1:.. Princípio da ECIS Ilustração de uma monocamada de células em um biochip com simplificado leitor ECIS esquema elétrico Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<p class="jove_content"> Inicialmente, as linhas celulares de mamífero foram semeadas em biochips fluídicos e foram usadas na tecnologia de sensor de ECIS aqui descrito ^12. Estas células não estavam prático para o uso no campo, no entanto, porque necessárias alterações frequentes do suporte, teve um período de vida útil limitada, e necessário um ambiente de CO ₂ artificial e uma temperatura de 37 ° C de incubação. Descobriu-se que uma linha celular comercialmente disponível derivada de células epiteliais truta arco-íris de emalhar (RTgill W-1 de células) podem ser testados à temperatura ambiente a CO ambiente _2, formaram uma monocamada confluente nas biochips, pode ser armazenado a temperaturas de refrigeração, e teve uma resposta rápida (1 hora ou menos) para um largo espectro de produtos químicos, em concentrações relevantes para a saúde humana ^12. Aplicações das células RTgill-W1 em toxicologia, bem como em pesquisa básica, são revistos por Lee et al ^15.

Os métodos para a semeadura, armazenamento e ao controlo dos biochips fluídicas que contêmmonocamadas de células RTgill-W1 sobre biochips fluídicos em um biossensor ECIS são descritos aqui. Os biochips fluídicos pode ser armazenado por até 9 meses em um estado refrigerado e pode ser enviado em um recipiente de armazenamento a frio, para testes de beber água SUPPLIES.THE acompanham leitores ECIS, ou unidades de teste, são enviados separadamente. Os biochips têm dois componentes para eles; uma camada de policarbonato superiores com dois canais de fluido separadas, e uma camada inferior electrónico que contém quatro almofadas do eléctrodo por canal para detecção da impedância. Há 10 eletrodos de trabalho por pad; cada um dos eléctrodos é 250 um de diâmetro. Os biochips montados têm conexões de eletrodos de ouro para a aquisição de leituras de impedância, quando inserido na unidade de teste ECIS. Cada um dos dois canais em forma de U fluídicos fechados realizará 2 ml da suspensão de células RTgill-W1. A Figura 2 mostra um biochip fluídica no leitor ECIS com uma ampliação de células confluentes em um único eléctrodo de detecção.

Figura 2:.. Biochip Fluidic em ECIS Leitor área ampliada mostra uma monocamada confluente de células RTgill-W1 em um único eléctrodo de detecção por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Preparação dos materiais de teste NOTA: A fim de preparar os biochips para testes, vários frascos confluentes de células RTgill-W1 precisa estar pronto. Uma boa estimativa do número de frascos necessários é um confluente T175 frasco durante 16 biochips para ser semeado. Execute as seguintes etapas em um gabinete II classe biológica de segurança (biohood), utilizando técnica asséptica. Use etanol a 70% para desinfecção do biohood e quaisquer materiais colocados no exaustor. Preparar substrato fibronectina para os fluídicos biochips descongelando um frasco de 1 mg de fibronectina e diluindo em 100 ml de solução estéril de meio L-15 para uma concentração de 10 ug / ml. Congelar em alíquotas de 40 ml estéreis em tubos de 50 ml de polipropileno cónicos à temperatura de -20 ° C. Descongelar à temperatura ambiente, várias horas antes de semear as biochips. Uma vez descongelado, não voltar a congelar. Preparar meios de cultura de células por adição de 50 ml de soro bovino fetal, 5 ml de 200 mM de um sup de L-alanil-L-glutaminaplemento, e 5 ml de uma solução de penicilina / estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / mL e / ml 10.000 ug de estreptomicina) a 500 ml de meio L-15. Isto irá produzir 560 ml de meio de cultura de células que contêm 9% de soro. Refrigerar. Nota: Este será o meio de cultura celular completo usado para os frascos de cultura e os biochips. Em pó Frascos de mídia Preparar antes do tempo frascos 0,1 dram snap-tampão contendo 60 mg ± 0,5% de pó de L-15ex utilizando um dispensador de pó automatizado. Rotular os frascos com a data em que o pó foi dispensado e frascos refrigerar (em quantidades de 50) em Recloseable sacos de polietileno metalizadas; cada um contendo três 1 g de dessecação pacotes de gel de sílica. Nota: frascos L-15ex mídia em pó pode ser feito e armazenado por até 9 meses de antecedência dos testes. Adicione uma solução de 100 ml de 20% de lixívia por diluição de lixívia doméstica com água desionizada (Dl). Estimado que 5 ml de solução de lixívia serão necessários para cada biochip. Faça conjuntos de tubos biochip cortando secções de 27 mm de tubo biocompatível autoclave (2 secções para cada biochip para ser semeado) e encaixe as duas extremidades do tubo com acessórios luer policarbonato deslizamento. Coloque os conjuntos de tubos em um saco de autoclave e autoclave durante 8 minutos a 134 ° C. Também plugues autoclave biochip (2 por biochip) em um saco separado com as mesmas configurações. água Dl autoclave durante 30 min at121 ° C. Nota: Esta água irá ser usado para enxaguar biochips após a sementeira. Estimamos que 10 ml serão necessários para cada biochip. Nota: O volume efectivo de cada canal biochip é de 2 ml, mas 5 ml de água esterilizada é enxaguado através de cada canal após a remoção da solução de lixívia. Faça conjuntos de tubos de injeção seringa, cortando secções de 27 mm de tubo biocompatível e anexando acessórios deslizamento luer machos para ambas as extremidades da tubulação. Coloque os conjuntos de tubos em uma bolsa de esterilização papel de selagem térmica e autoclave durante 8 minutos a 134 &# 176; C. 2. Fluidic Procedimento Biochip Sementeira Nota: Execute todos os procedimentos em que os biochips ou os meios de comunicação é manuseado em uma cabine de segurança biológica classe II, utilizando técnica asséptica. Vinte e quatro horas antes da semeadura programada, retire os biochips de embalagem fabricante no biohood e coloque em casos de instrumento de plástico esterilizados. Esterilizar os biochips usando uma solução de água sanitária 20% como se segue Nota: Historicamente, este processo de branqueamento tem impedido o crescimento de fungos nos biochips durante o armazenamento a longo prazo em caso de que a esterilização do plasma dos biochips feito pelo fabricante não foi eficaz. Usando uma seringa de 20 ml esterilizado, com um tubo de injecção da seringa montagem ligado e trabalhando no biohood, injectar 2 ml da solução de lixívia a 20% em cada canal do biochip. Permitir que os biochips para sentar-se durante 1 hora com a solução de água sanitária. Após uma hora, asp vácuoirados a solução de lixívia a partir de ambos os canais usando um conjunto de luer slip macho estéril ligada ao tubo de sucção de vácuo. Use um dos conjuntos de tubos biochip como um dreno quando enxaguar os biochips. Usando uma seringa esterilizada de 20 ml ligado a um conjunto de injecção da seringa estéril, lave cada canal do chip com 5 ml de água estéril, permitindo que o excesso de água seja drenado para um recipiente na biohood. Então vácuo aspirado fora da água como descrito para a lixívia e colocar os biochips de volta para os casos de instrumento de plástico e deixe na biohood até semeado com células no dia seguinte. Sessenta minutos antes de semear as biochips, injectar 2 ml do / solução de fibronectina ml de 10 ug em cada canal do biochip. Deixar os biochips no biohood durante 60 minutos, e, em seguida, aspirado de vácuo fora da fibronectina (como descrito no passo 2.2.3) antes de semear o biochip com células. Coloque duas seções dos conjuntos de tubos biochip estéreis (consultesecção 1.4) nas portas dos biochips. Trypsinize um confluentes RTgill-W1 balão T175 para cada 16 biochips usando procedimentos descritos na American Type Culture Collection (ATCC) descrição do produto de folha 16. Aspirar fora da mídia do frasco confluente (s) de células. Lavar a camada de células com 15 ml de PBS e depois aspirar fora. Adicionar 6 ml de tripsina / EDTA para a camada de células em cada frasco T175 e permitir que as células trypsinize durante ~ 5 min. Adicionar 15 ml de meio de cultura celular completo L-15 a cada frasco para parar a tripsinização. Combinam-se as suspensões de células num recipiente descartável estéril. Nota: O tamanho do recipiente pode variar de 150-500 ml, dependentes do número de biochips sendo semeada. Estimado que 5 ml de suspensão de células será necessária por biochip. Remover ~ 1 ml da suspensão de células e colocar num tubo de microcentrífuga para contagem. Usando um microscópio de campo claro com um objecti 10Xve e um hemocitómetro, contam-se uma alíquota de 10 ul das células e calcular o volume de meios completo L-15 de cultura de células necessárias para atingir uma suspensão de células de 2,5 x 10 5 culas / ml. Nota: Se utilizar a suspensão de células para semear frascos para continuar a cultura, este seria o ponto de o fazer. Ajustar a concentração de suspensão de células utilizando meios de cultura celular completo L-15. Usando uma agulha estéril 20 ml syringeattached para um conjunto de tubo de injecção da seringa estéril (ver secção 1.6), injectar 2,5 ml da suspensão de células para a porta exterior de cada canal da biochip (ou seja, as portas que não têm o tubo ligado), permitindo alguma da suspensão de células extra para fluir para fora do tubo dentro de um recipiente de resíduos no biohood. Nota: Isto irá assegurar que todo o canal e o tubo ligado será cheio da suspensão de células. Criar um loop fechado para cada canal biochip, inserindo a extremidade livre da mangueira com os Fitti luerng nas portas exteriores de cada canal. Limpar qualquer excesso de materiais fora das laçadas fechadas com uma toalha de papel, humedecido com 70% de etanol e colocar os biochips de volta na caixa de plástico em uma incubadora a 20 ° C. Dê a cada biochip um número de identificação único. Nos dias 4 e 7, retire os biochips do C incubadora de 20 ° e reabastecer os meios de comunicação em todos os biochips com total meios de cultura celular equilibrada temperatura L-15. Seguir o mesmo procedimento como no passo 2.6, excepto o uso apenas G-15 de meio de cultura celular, em vez (sem suspensão de células). Coloque os biochips de volta no C incubadora de 20 ° após a alimentação dia 4. Após a alimentação dia 7, remover e descartar as mangueiras de os chips e inserir os bujões de drenagem autoclavados nos biochips. Coloque as biochips numa caixa numa incubadora C 6 ° até serem utilizadas para os testes. Nota: Os chips podem ser armazenados em temperaturas refrigeradas para até 9 meses e ainda são viáveis para testes in os leitores ICE. 3. ECIS Testing com Biochips Prepare produtos químicos de teste se estiver usando. (Ver Brennan, et al., 2012 7, para a preparação de produtos químicos de teste). Remover leitor ECIS e material de teste a partir da caixa de transporte. Remover um biochip preparado a partir do 6 ° C incubadora. Coloque o biochip numa toalha de papel. Ligue o leitor ECIS. Usando 10 ml seringas, dispensar 10 ml de água de controle em um frasco de 0,5 oz controle de plástico transparente marcados e 10 ml da amostra de teste em um 0,5 oz jar test plástico transparente rotulados. Nota: 1) Certifique-se de remover as bolhas para uma medição precisa. 2) As seringas e frascos são codificados por cores; azul para controle e vermelho para o teste. Retire os dois frascos de mídia em pó a partir dos sacos de plástico. Abra um dos frascos de mídia em pó (uso de ferramenta multiuso se necessário) e despeje todo o conteúdo de um frasco dentro do frasco com água controle, soltando todo o frasco parasolução bem. Repita este procedimento com o frasco de teste. Tampão e agitar os frascos para garantir que o pó esteja dissolvido. Encher cada um dos coloridos seringas de 10 ml com 9 ml de um ou outro controlo (seringa azul) ou a partir de soluções respectivos frascos de teste (vermelho de seringa). Retirar as bolhas de ar a partir de seringas. Remova os plugues dos portos biochip e anexar o dreno. Coloque o biochip na bandeja de plástico removível no leitor ECIS e feche a tampa. Anexar seringas cheias para os portos biochip exteriores e anexar o êmbolo da seringa. Na tela principal, selecione "Next" para iniciar a pré-teste. Nota: O software leitor irá verificar impedâncias. Se impedâncias estão dentro do intervalo definido pelo usuário (geralmente entre 1.000 e 3.000 ohms) a tela irá registar "Cartucho Aprovado" como indicado na Figura 3, e instruir o usuário selecione "Next" eo software vai avançar para o passo 3.10). Se as impedâncias não estão dentroo intervalo definido por causa de um biochip com defeito ou conexão defeituosa do biochip para o leitor (geralmente devido a um desalinhamento dos eletrodos), em seguida, a tela irá registar "Cartucho Falha" e o usuário terá a opção de "Abortar" ou "Verificar" o teste. Selecione "Abortar" para voltar para o passo 3.9). Selecione "Verificar" para avançar para o passo 3.10) depois de receber um "cartucho Aprovado" mensagem e selecionando "Next". Nota: É melhor tomar a biochip para fora e inspecionar visualmente-lo por defeitos ou vazamento se um "cartucho falhou" mensagem é recebida antes de prosseguir com um novo biochip. Figura 3:. ECIS leitor de tela de um Biochip com leituras de impedância aceitáveis A captura de tela mostra as leituras de impedância iniciais em ohms de cada um dos quatro coeletrodos ntrol (CE) e 4 eletrodos da amostra de ensaio (SE) no interior do biochip fluídico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Quando solicitado pelo leitor, insira as informações de amostra usando um teclado virtual e selecione "Aceitar" quando terminar. Nota: O software leitor ECIS irá carimbar automaticamente cada conjunto de dados com a data, hora e outras informações inseridas pelo usuário; tais como o número biochip, e o tipo de química e concentração. Dois minutos de dados de impedância serão recolhidos a partir do biochip inserido e um temporizador no ecrã, vai contar-down tempo. Depois de dois minutos, quando solicitado por instruções na tela que estão piscando dentro de uma caixa vermelha, clique em "Avançar". Quando solicitado por uma caixa verde piscando para "Injetar amostras agora", injetar o controle e meios de teste das seringas ligados simultaneamente no elá biochipels. Deixar as seringas no lugar sobre os biochips quando terminar. Nota: Os valores de impedância serão recolhidos uma vez por minuto para 60 min. Se o software de leitura ECIS determina que o canal de tratamento é estatisticamente diferente do canal de controlo, em qualquer ponto entre 10 e 60 min após o início do teste, em seguida, a apresentação no ecrã indicará que a amostra é "contaminado". Se o tratamento não é diferente do canal de controlo, em seguida, a tela irá indicar "nenhuma contaminação detectada" no final da execução do teste. os resultados dos testes dos recordes como contaminados ou não contaminados para cada amostra. No final do ensaio, remover e descartar o biochip. Enxágüe e deixe secar as seringas, frascos de teste e bandeja de plástico removível que abrigava o biochip durante os testes. Nota: O leitor ECIS tem 4 GB de armazenamento a bordo para o software operacional, modelos de controlo e os arquivos de teste gerado a execução de um teste. Isto permite que vários thousand arquivos de teste para ser armazenado para o leitor. Os arquivos podem ser recuperados com uma unidade de salto USB e transferidos para um computador para análise posterior para fins de pesquisa, se desejar.

Representative Results

A tecnologia ECIS descritas neste documento foram submetidos a testes da Agência de Proteção Ambiental dos EUA (USEPA) -sponsored Testing Tecnologia e Programa de Avaliação (TTEP). Treze produtos químicos foram selecionados para testar como representantes de um amplo espectro de compostos industriais tóxicos que poderiam ser possíveis contaminantes da água potável. Durante o teste, 9 dos 13 foram detectados por ECIS dentro de uma hora a concentrações que são relevantes para a saúde humana 8. A tabela 1 ilustra os resultados deste teste contaminante. A Figura 4 é representativo do que um resultado "contaminadas" ficaria em a tela leitor ECIS. Para a maior parte, impedâncias celulares diminuiu para amostras contaminadas em comparação aos controles. Ocasionalmente, certos compostos podem causar um aumento na impedância. Também resumidos na Tabela 1 </strong> é o teste de água limpa. Quarenta amostras de água potável foram executados e nenhuma contaminação foi detectada em nenhuma das amostras (ver Figura 5) para uma captura de tela representante da "nenhuma contaminação detectado". Figura 4: ECIS leitor de tela de um "contaminadas" Amostra de Água Um exemplo normalizados impedância gráficos e os resultados de uma amostra de água que foi contaminada.. As linhas azuis representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos de controlo; linhas vermelhas representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos da amostra de teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: ECIS leitor de tela de um "nenhuma contaminação detectado" Amostra de Água Um exemplo normalizados impedância gráficos e os resultados de uma amostra de água que não foi contaminada.. As linhas azuis representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos de controlo; linhas vermelhas representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos da amostra de teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Categoria contaminante Concentração testada (mg / L) 1 Detectado ≤1 hora n = 4/4 fichas pesticidas aldicarbe 0,17 não Arsen IC (arsenito de sódio) 4,5 sim A azida (azida de sódio) 46,7 sim fenamifos 0,56 não metamidofos 1.4 não metilparatião 33,6 sim Paraquat (dicloreto) 4.6 não Pentaclorofenato (de sódio) 71,9 sim Químicos industriais Amônia 924 sim De cobre (sulfato de cobre II) 103 sim Cyanide (sódio) 3 "> 14 sim Mercúrio (cloreto) 24,7 sim Tolueno 444 sim Clean Water 2 Nenhum N / D não 1 concentrações testadas são as mesmas que no manuscrito por Widder, et ai. (2014). 2 40 amostras de água potável foram executados sem contaminação. Tabela 1: Os contaminantes em amostras de água detectado pelo ECIS.

Discussion

A tecnologia ECIS teve um bom desempenho em um ambiente de laboratório e foi capaz de detectar contaminantes da água potenciais em concentrações que são relevantes para a saúde humana. A portabilidade e embalagem da tecnologia torna mais propício para uso no campo.

etapas críticas do protocolo para o sucesso da tecnologia são as seguintes: 1) Manter as condições de assepsia durante a cultura, sementeira, ea alimentação dos biochips, 2) Manter os biochips semeados em condições de refrigeração até que esteja pronto para o teste uma vez que as células RTgill-W1 não sobreviverá muito tempo, uma vez que eles são submetidos a temperaturas acima de 25 ° C, 3) pesar com precisão o G-15ex nos frascos media em pó e medir com precisão as amostras de água para evitar a produção de falsos positivos, o que pode ser causado por uma mudança na osmolaridade dos meios de comunicação em vez de toxicidade da amostra, 4) Siga as instruções de utilização no ecrã do ECIS para a execução dos testes. O software no leitor irá alertar o usuário se um biochip é inaceitável para ensaios (com base nas leituras de impedância inicial) quando o biochip é primeiro inserido no leitor. Se os níveis de impedância são inaceitáveis para o teste, o software não vai permitir que o utilizador prossiga com o teste até que um novo biochip é usado. Razões para leituras de impedância inaceitáveis são geralmente devido a um ligeiro desalinhamento dos eléctrodos biochip com os pinos de leitor de LCE ou fuga de fluido ao longo de uma das bordas de colagem do biochip.

Existem alguns limites para essa tecnologia, porque o sensor ECIS só foi testado com água potável e não com água de superfície. As células RTgill-W1 que estão no biochip não podem tolerar o congelamento ou a temperaturas muito acima dos 25 ° C durante períodos prolongados de tempo (intervalo de tempo pode ser de horas a dias dependendo da temperatura. Os biochips funcionar melhor numa gama de temperatura de refrigeração a temperatura ambiente ^7. Eles estão prontos para uso imediato, no entanto, logo depois de ser removed de armazenamento a frio. Portáteis recipientes de armazenamento a frio são usadas atualmente por pessoal do Exército no campo de suprimentos sensíveis à temperatura. Estes mesmos recipientes podem ser usados para o transporte biochip semeado.

Outro limite para esta tecnologia é que mesmo que seja um sensor de toxicidade de banda larga, não respondem bem, se de todo, a compostos inibidores de colinesterase, tais como alguns pesticidas. Para preencher esta lacuna capacidade, o sensor de ICE concebido para ser usado em conjunto com um ensaio de teste rápido de pesticidas disponíveis comercialmente ao testar amostras de água a fim de proporcionar ao utilizador uma gama mais ampla de ensaios de toxicidade. O kit é um ensaio enzimático rápida concebido para detectar pesticidas organofosforados e carbamatos no prazo de 30 min.

O sensor ECIS complementa o wqas-PM (Water Quality System Analysis – Medicina Preventiva) Sistema de teste de água campo, atualmente usado por militares medicina preventiva para detectar, arsenic, chumbo, ou cianeto numa amostra de água potável. Embora o sensor ECIS não identificará o que o contaminante é, ele irá indicar se certos metais ou compostos orgânicos estão presentes, o que indica que a água pode não ser adequado para o consumo humano. Os resultados do teste ECIS estão disponíveis dentro de uma hora. As amostras de água podem ser enviados para análises ulteriores para a identificação do contaminante, se houver um resultado de teste positivo.

Como descrito acima, o leitor ICE concebido para ser parte de um sistema que inclui um kit de ACE enzimático separado, a fim de cobrir um largo espectro de detecção de contaminantes. Ambos os leitores estão a ser embalado em um caso resistente para o transporte de campo para uso em campo por soldados.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.

Materials

Fetal bovine serum	Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com	16000-085	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).
Fibronectin, bovine plasma	EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com	341631-1 mg	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips.
L-15 media without L-glutamine	Lonza www.lonzabioscience.com	12-700F	Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C.
L-15ex powdered media with phenol red	US Biological www.usbio.net	L1501	Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips.
PBS, w/o Ca++ or Mg++	Lonza www.lonzabioscience.com	17-516F	Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.
Trypsin, EDTA	Lonza www.lonzabioscience.com	CC-5012	Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks.
T175 culture flasks	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-30	Used for culturing RTgill-W1 cells.
Bleach	Chlorox www.chlorox.com		Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.
70 % ethyl alcohol			For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)	American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org	CRL-2523	Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM	Lonza www.lonzabioscience.com	35050-061	Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K	Lonza www.lonzabioscience.com	17-602E	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Pharmed BPT tubing	U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com	57317	Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies	Value Plastics	MTLS210-9	Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.
20 mL syringes, slip-tip	VWR Scientific us.vwr.com	BD302831	Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials	Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com	30600	Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"	Medi-Dose EPS medidose.com	IB701	Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips.
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13”	CardinalHealth www.cardinalhealth.com	90713	Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.
Quantos automated powder dispenser	Mettler Toledo www.mt.com	QB5	Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.
ECIS reader	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.
3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags	Uline www.uline.com	S-16893	Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.
Leatherman squirt ps4	Amazon www.Amazon.com		Used to open powdered media vials.
1 gram silica gel desiccant packets	Uline www.uline.com	S-3902	Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.
Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles	Fisher Scientific www.fishersci.com	09-740-25C or E	Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.
Plugs for biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C.
Drains for ECIS biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections.
Hemocytometer	Fisher Scientific www.fishersci.com	S17040	Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.
Brightfield microscope w/ 10X objective	Leitz Labovert		Any brightfield microscope is acceptable.
Class II biological safety cabinet			Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.
Microcentrifuge tubes, 0.6 mL	Fisher Scientific www.fishersci.com	02-681-311	Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells.
Slip 10 cc red syringes	Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com	S/49S 30-R	Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip.
Slip 10 cc blue syringes	Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com	S/49S 30-B	Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip.
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps	SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com	0605-30	Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing.
50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-269	Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C.

References

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Brennan, L. M., Widder, M. W., McAleer, M. K., Mayo, M. W., Greis, A. P., van der Schalie, W. H. Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity. J. Vis. Exp. (109), e53555, doi:10.3791/53555 (2016).

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