This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.
This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.
全体的な目標は、ECISバイオセンサーにおける細胞播種、ストレージおよび流体バイオチップのテストのための方法を開発することでした。このバイオセンサーの開発のための目標は、兵士によって使用されている飲料水供給の汚染の可能性を検出できるフィールドポータブルデバイス用の米軍仕様に適合することがありました。毒性センサーのための要件は、デバイスが、フィールド・ポータブルであること、それは、人間の健康に関連する濃度で(時間以内)急速に有害産業化合物の広いスペクトルを検出することができ、および生物学的成分は、の貯蔵寿命を有することがありました少なくとも9ヶ月。傷みやすい部品の冷凍が、冷凍ではないが、許容できるものでした。
歴史的には、(そのような抗体、酵素、または核酸など)、それらの生物学的成分を持つフィールドポータブル水の検査技術は、検体特異1-3となっています。バイオセンサーのこのタイプの欠点は、ONLことですYは、一度に化学物質の一種を検出します。複数の化学物質が存在することが疑われる場合、複数のセンサが必要とされています。特定のセンサがテストレパートリーにない場合は、水中での化学汚染物質が容易に検出されない可能性があります。
広範な毒性センサが、一方、この技術のギャップを埋める可能性があります。これらは通常、それら4-8に細胞成分を持っています。広範な毒性のバイオセンサの利点は、彼らは時間5,9,10の比較的短い期間で、混合物および未知数を含む化学汚染物質の広い配列の存在を検出することができるということです。
また、電気細胞-基質インピーダンスセンシング(ECIS)として知られている可能性のある毒性センサー、のような細胞単層の電気インピーダンスの測定を使用する概念は、最初イェーヴァー及びKeese 11で説明しました。過去20年間では、細胞viabの敏感な指標であることが示されていますilityと細胞毒性。基本的には、バイオチップ上の電極に接着されている細胞単層は、高周波と低電圧とアンペア数交流信号にさらされます。細胞のコンフルエントな単層が電子の流れを妨げます。細胞単層の完全性(例えば、有毒な化学物質を導入する場合のように)危険にさらされたとき、ECISセンサは、電気インピーダンスの変化を記録する11-14。 図1は、バイオチップ上の細胞単層に対してECISの原理を示します。
図1:単純化ECISリーダー電気回路図とバイオチップ上の細胞単層のECISイラストの原理 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
播種、ストレージ、および含む流体バイオチップのテストのための方法ECISのバイオセンサーにおける流体バイオチップ上のRTgill-W1の細胞の単層は、ここで説明されています。流体バイオチップは、冷蔵状態で最長9ヶ月間保存することができ、別々に出荷され、飲料水のsupplies.The伴うECISリーダー、または試験ユニットの試験のために、冷蔵コンテナで出荷することができます。バイオチップは、彼らに二つの成分を持っています。二つの別々の流体チャネル、およびインピーダンスセンシング用のチャネル毎に4つの電極パッドを含んで、下部電子層と上部ポリカーボネート層。パッドごとに10の作用電極があります。各電極は直径250μmです。組み立てられたバイオチップは、ECISテスト部に挿入されたときのインピーダンス測定値を取得するための金電極接続を有します。 2囲まれた流体のU字型チャネルの各々はRTgill-W1細胞懸濁液2mlのホールド2は、単一の感知電極上のコンフルエント細胞の倍率ECISリーダで流体バイオチップを示します。
<p classFO = "jove_content":キープtogether.withinページ= "1">ECIS技術は、実験室の設定でよく行われ、人間の健康に関連のある濃度での潜在的な水の汚染物質を検出することができました。技術の移植性とパッケージングは、現場での使用にそれを助長させます。
次のように技術の成功のためのプロトコルにおける重要なステップは次のとおりです。1)、文化、播種、及びバイオチップの供給中に無菌状態を維持2)RTgill-W1細胞ので、テストのための準備ができるまで冷蔵条件でシードされたバイオチップをキープ非常に長い彼らは25℃以上の温度にさらされている後に生存しないであろう、3)正確粉末培地バイアル中にL-15exを比較検討し、正確でシフトによって引き起こされる可能性が偽陽性を、生産避けるために、水試料を測定メディアではなく、サンプル毒性の浸透圧は、4)テストを実行するためのECIS画面上でユーザの指示に従ってください。双場合、読者のソフトウェアがユーザーに警告しますバイオチップは、第一のリーダに挿入されたときochipは(初期インピーダンスの読みに基づいて)テストのために受け入れられません。インピーダンス・レベルはテストのために受け入れられない場合、ソフトウェアは、新たなバイオチップが使用されるまで、ユーザーがテストを続行することはできません。容認できないインピーダンス測定値の理由は、通常、ECISリーダーピンまたはバイオチップの接着縁部の一方に沿って流体漏れを持つバイオチップの電極のわずかな位置ずれによるものです。
ECISセンサーのみが飲料水でテストされず、表面水とされているため、この技術にはいくつかの制限があります。バイオチップ上にあるRTgill-W1細胞は長期間凍結またははるかに25℃以上の温度に耐えることができない(時間枠は、時間から温度に依存日にすることができます。バイオチップは、冷蔵への温度範囲で最高の機能室温7。彼らは右のRされた後、しかし、すぐに使用できる状態にあります低温貯蔵からemoved。ポータブル保冷容器は現在、温度感受性の供給のためのフィールドに陸軍担当者によって使用されています。これらの同じ容器は播種バイオチップの輸送のために使用することができます。
この技術に対する別の制限は、それが広帯域毒性センサーであっても、それはそのようないくつかの農薬などのコリンエステラーゼ阻害する化合物を、すべての場合、十分に応答しないということです。この機能のギャップを埋めるために、ECISセンサは、毒性試験のより広い範囲をユーザに提供するために、水試料を試験する場合、市販の迅速な農薬試験アッセイと組み合わせて使用するように設計されています。キットには、30分以内に有機リンおよびカルバメート系農薬を検出するように設計された迅速な酵素アッセイです。
アルセン、現在検出するために軍事予防医学の人員によって使用されるフィールドの水試験システム、 – ECISセンサはWQAS-PM(予防医学水質分析システム)を補完します飲料水試料中のIC、鉛、またはシアン。 ECISセンサは汚染物質が何であるかを特定しないであろうが、特定の金属または有機化合物が存在する場合、その水は人間の消費に適していないかもしれないことを示す、示します。 ECISのテスト結果は、時間内にご利用いただけます。陽性の検査結果がある場合、水試料は、次に、汚染物質を同定するためのさらなる分析のために送信することができます。
上述したように、ECISリーダは、異物検出の広いスペクトルをカバーするために、別個の酵素ACEキットを含むシステムの一部であるように設計されています。これらの読者の両方が兵士によって、フィールドでの使用のためのフィールドの輸送のための頑丈なケースにパッケージされています。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.
Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips. |
PBS, w/o Ca++ or Mg++ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
70 % ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
20 mL syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
1 gram silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C. | |
Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
Microcentrifuge tubes, 0.6 mL | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells. |
Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip. |
Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip. |
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing. |
50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C. |