Preparazione e test di impedenza a base di biochip fluidici con le cellule RTgill-W1 per valutare rapidamente campioni di acqua potabile per la tossicità

1. Preparazione di materiali di prova NOTA: Per preparare i biochip per il test, diversi palloni confluenti di cellule RTgill-W1 deve essere pronta. Una buona stima del numero di flaconi necessari è uno confluente pallone T175 per 16 biochip per essere seminati. Effettuare le seguenti operazioni in un armadietto II classe biologica di sicurezza (biohood) con tecnica asettica. Utilizzare etanolo al 70% per la disinfezione del biohood e qualunque materiale poste nel cappuccio. Preparare substrato fibronectina per i biochip fluidiche da scongelamento un flaconcino 1 mg di fibronectina e diluendo in 100 ml di sterili L-15 supporti per una concentrazione di 10 ug / ml. Congelare in 40 ml aliquote in 50 ml provette coniche polipropilene sterili a -20 ° C. Scongelare a temperatura ambiente diverse ore prima di semina i biochip. Una volta scongelato, non ricongelare. Preparare mezzi di coltura cellulare aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino, 5 ml di 200 mM un sup L-alanil-L-glutamminacomplemento, e 5 ml di una soluzione di penicillina / streptomicina (10.000 unità di penicillina / ml e / ml 10.000 mg di streptomicina) stock a 500 ml di L-15 media. Questo produrrà 560 ml di terreni di coltura delle cellule che contengono il 9% di siero. Refrigerare. Nota: Questo sarà il supporto completo di coltura cellulare utilizzato per le fiasche di coltura e dei biochip. Polvere media Fiale Preparare prima del tempo fiale 0,1 dram snap-cap contenenti 60 mg ± 0,5% di polvere di L-15ex utilizzando un dosatore di polvere automatizzato. Etichettare le fiale con la data della polvere è stata erogata e fiale refrigerare (in quantità di 50) in poli sacchetti richiudibili metallizzati; ciascuno contenente tre pacchetti essiccazione di gel di silice 1 g. Nota: le fiale L-15ex multimediali in polvere possono essere fatte e conservate per un massimo di 9 mesi di anticipo di test. Fare una soluzione di 100 ml di 20% di candeggina diluendo candeggina con acqua deionizzata (DI). Stima che saranno necessari 5 ml di soluzione di candeggina per ogni biochip. Fare assemblee tubi biochip tagliando 27 sezioni di tubo mm biocompatibile autoclavabile (2 sezioni per ogni biochip per essere seminati) e montare entrambe le estremità del tubo con raccordi luer policarbonato antiscivolo. Mettere assemblaggi di tubi in un sacchetto autoclavabile e autoclave per 8 minuti a 134 ° C. Anche i tappi autoclave biochip (2 per biochip) in un sacchetto a parte con le stesse impostazioni. acqua deionizzata Autoclave per 30 minuti at121 ° C. Nota: Questa acqua verrà utilizzata per il risciacquo biochip dopo la semina. Stimano che saranno necessari 10 ml per ogni biochip. Nota: Il volume effettivo di ciascun canale biochip è di 2 ml, ma 5 ml di acqua sterile viene risciacquato attraverso ciascun canale dopo la rimozione della soluzione di candeggina. Fare assemblee tubi iniezione siringa tagliando 27 sezioni mm di tubi biocompatibile e allegando maschi raccordi slittamento luer ad entrambe le estremità del tubo. Posizionare assiemi tubi in un sacchetto di sterilizzazione carta termosaldabile ed autoclave per 8 minuti a 134 &# 176; C. 2. Procedura Biochip Semina Fluidic Nota: Eseguire tutte le procedure in cui le biochip o dei media è gestito in un armadio di sicurezza biologica di classe II con tecnica asettica. Ventiquattro ore prima della semina in programma, rimuovere i biochip da imballaggio produttore al biohood e mettere in custodie di plastica sterilizzati. Sterilizzare i biochip utilizzando una soluzione di candeggina al 20% come segue Nota: Storicamente, questa procedura di sbiancamento ha impedito la crescita di funghi nei biochip durante la conservazione a lungo termine nel caso in cui la sterilizzazione al plasma dei biochip fatte dal produttore non è stato efficace. Utilizzando a 20 ml siringa sterile con un tubo di iniezione la siringa attaccata e lavorare nella biohood, iniettare 2 ml della soluzione di candeggina 20% in ciascun canale del biochip. Lasciare i biochip a sedere per 1 ora con la soluzione di candeggina. Dopo un'ora, asp vuotoirato la soluzione di candeggina da entrambi i canali utilizzando un montaggio slittamento luer maschio sterile attaccato al tubo di aspirazione a vuoto. Utilizzare uno dei gruppi di tubi biochip come uno scarico quando il risciacquo i biochip. Usando una siringa sterile 20 ml collegata ad un gruppo di iniezione siringa sterile, lavare ogni canale del chip con 5 ml di acqua sterile, permettendo all'acqua in eccesso di defluire in un contenitore in biohood. Poi il vuoto-aspirato l'acqua come appena descritto per la candeggina e posizionare i biochip nuovamente dentro le custodie in plastica e lasciare nel biohood fino seminati con cellule il giorno seguente. Sessanta minuti prima semina i biochip, iniettare 2 ml della / soluzione fibronectina ml 10 mg in ciascun canale del biochip. Lasciare i biochip nella biohood per 60 minuti, e poi aspirare aspirare al largo della fibronectina (come descritto al punto 2.2.3) prima della semina il biochip con le cellule. Mettere due sezioni delle assemblee tubi biochip sterili (vedisezione 1.4) sulle porte dei biochip. Trypsinize un confluenti RTgill-W1 pallone T175 per ogni 16 biochip utilizzando procedure descritte nella American Type Culture Collection (ATCC) prodotto descrizione foglio 16. Aspirare fuori il supporto dal pallone confluenti (s) di cellule. Risciacquare lo strato di cellule con 15 ml di PBS e quindi aspirare via. Aggiungere 6 ml di tripsina / EDTA per lo strato di cellule in ogni contenitore T175 e consentono alle cellule di trypsinize per ~ 5 min. Aggiungere 15 ml di completo supporto L-15 coltura cellulare per ogni pallone per fermare tripsinizzazione. Combinare le sospensioni cellulari in un contenitore sterile monouso. Nota: le dimensioni del contenitore può variare da 150-500 ml, a seconda del numero di biochip essere testa di serie. Stima che saranno necessari 5 ml di sospensione cellulare per biochip. Rimuovere ~ 1 ml di sospensione cellulare e posto in una provetta per il conteggio. Utilizzando un microscopio campo chiaro con una oggettivazione 10Xve e un emocitometro, conteggio un'aliquota 10 microlitri di cellule e calcolare il volume di completa mezzi di coltura delle cellule L-15 necessario per raggiungere una sospensione cellulare di 2,5 x 10 5 cellule / ml. Nota: Se si utilizza la sospensione cellulare alle sementi fiaschi di continuare la cultura, questo sarebbe il punto di farlo. Regolare la concentrazione di sospensione cellulare utilizzando completo supporto L-15 coltura cellulare. Utilizzando una sterile 20 ml syringeattached ad un complesso di tubo di iniezione siringa sterile (vedi paragrafo 1.6), iniettare 2,5 ml di sospensione cellulare nella porta esterna di ciascun canale del biochip (cioè, le porte che non hanno il tubo allegato), permettendo alcuni di sospensione cellulare in più per defluire dal tubo in un contenitore per rifiuti nel biohood. Nota: Questo farà sì che l'intero canale e il tubo attaccato sarà pieno di sospensione cellulare. Creare un ciclo chiuso per ogni canale biochip inserendo l'estremità libera del tubo con le rac luerng nelle porte esterne per ogni canale. Pulire tutti i supporti in eccesso fuori dei circuiti chiusi con un tovagliolo di carta inumidito con etanolo al 70% e posizionare i biochip nella scatola di plastica in un incubatore a 20 °. Dare ad ogni biochip un numero di identificazione univoco. Nei giorni 4 e 7, rimuovere i biochip dalla C incubatore 20 ° e ricostituire i mezzi di comunicazione in tutti i biochip con completa mezzi di coltura cellulare L-15 a temperatura equilibrata. Seguire la stessa procedura descritta nella fase 2.6, tranne l'uso solo L-15 coltura cellulare multimediale, invece (senza sospensione cellulare). Mettere i biochip di nuovo in C incubatore 20 ° dopo l'alimentazione giorno 4. Dopo l'alimentazione giorno 7, rimuovere ed eliminare i tubi dai chip e inserire i tappi di scarico autoclave nei biochip. Mettere i biochip in una scatola in un incubatore a 6 ° fino a quando utilizzato per il test. Nota: I chip possono essere conservati a temperature di refrigerazione per un massimo di 9 mesi e sono ancora vitali per il test in i lettori ICE. 3. Test ECIS con Biochips Preparare i prodotti chimici di test se si utilizza. (Vedere Brennan, et al. 2012 7 per la preparazione di prodotti chimici di prova). Rimuovere il lettore ECIS e forniture di test dalla custodia. Rimuovere un biochip preparata dalla C incubatore 6 °. Posizionare il biochip su un tovagliolo di carta. Accendere il lettore ECIS. Utilizzando 10 ml siringhe, erogare 10 ml di acqua di controllo in un 0,5 once barattolo di controllo di plastica trasparente con etichetta e 10 ml di campione in esame in un 0,5 once barattolo di prova di plastica trasparente con etichetta. Nota: 1) Assicurarsi di rimuovere le bolle per una misurazione accurata. 2) Le siringhe e barattoli sono codificati a colori; blu per il controllo e rosso per test. Rimuovere due fiale di media in polvere dai sacchetti di alluminio. Aprire una delle fiale di media in polvere (strumento multiuso uso, se necessario) e versare tutto il contenuto di una fiala dentro il barattolo con l'acqua di controllo, lasciando cadere l'intero flacone insoluzione pure. Ripetere questa procedura con il vaso di prova. Cap e agitare i vasi per assicurare che la polvere è sciolta. Riempire ciascuno dei colori da 10 ml siringhe con 9 ml di uno di controllo (blu siringa) o il test (siringa rossa) soluzioni di rispettive fiale. Rimuovere le bolle d'aria dalle siringhe. Rimuovere i tappi dai porti biochip e collegare lo scarico. Posizionare il biochip nel vassoio di plastica estraibile nel lettore ECIS e chiudere il coperchio. Fissare riempite alle porte biochip esterni e collegare lo stantuffo della siringa. Dalla schermata principale, selezionare "NEXT" per avviare pre-test. Nota: il software Reader controllerà impedenze. Se impedenze sono nel raggio d'azione impostata dall'utente (in genere tra 1.000 e 3.000 ohm) lo schermo registrerà "Cartuccia Passed" come indicato nella figura 3, e richiedere all'utente di selezionare "Avanti" e il software procedere al punto 3.10). Se le impedenze non rientranola gamma insieme a causa di un biochip difettoso o collegamento difettoso del biochip al lettore (di solito a causa di un disallineamento degli elettrodi), poi lo schermo registrerà "Cartuccia non riuscita" e l'utente avrà la possibilità di uno "Abort" o "Verifica" il test. Selezionare "Abort" per tornare al punto 3.9). Selezionare "Verifica" per passare al punto 3.10) dopo aver ricevuto un messaggio "Cartuccia Passed" e selezionando "Avanti". Nota: Si consiglia di prendere il biochip fuori ed esaminarlo per difetti o perdite se un "Cartuccia non riuscita" messaggio viene ricevuto prima di procedere con un nuovo biochip visivamente. Figura 3:. ECIS Reader Schermata di un biochip con letture di impedenza accettabili La schermata mostra le letture dell'impedenza iniziali in ohm di ciascuno dei 4 coelettrodi ntrol (CE) e 4 elettrodi campione (SE) all'interno del biochip fluidica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Quando viene richiesto da parte del lettore, inserire informazioni campione utilizzando una tastiera virtuale e quindi selezionare "Accetto" quando hai finito. Nota: il software di lettura ECIS si stampare automaticamente ogni insieme di dati con la data, l'ora e altre informazioni inserite dall'utente; quali il numero biochip, e il tipo di chimica e concentrazione. Due minuti di dati di impedenza saranno raccolti dal biochip inserito e il tempo di un timer sullo schermo conterà verso il basso. Dopo due minuti, quando richiesto da istruzioni su schermo che vengono a lampeggiare entro una scatola rossa, premere "Next". Quando viene richiesto da una casella verde lampeggiante a "iniettare campioni ora", iniettare il controllo e mezzi di prova dalle siringhe attaccate contemporaneamente nella chann biochipEls. Lasciare le siringhe in atto sui biochip una volta terminato. Nota: valori di impedenza saranno raccolti una volta al minuto per 60 min. Se il software di lettura ECIS determina che il canale di trattamento è statisticamente diverso dal canale di controllo in qualsiasi punto tra 10 e 60 minuti dopo l'inizio della prova, quindi la visualizzazione su schermo indica che il campione è "contaminato". Se il trattamento non è diverso dal canale di controllo, lo schermo indicherà "No Contaminazione Detected" alla fine della prova. Registra i risultati dei test come contaminati o meno contaminati per ogni campione. Alla fine del test, rimuovere ed eliminare il biochip. Risciacquare e aria asciugare le siringhe, fiale di prova e vassoio di plastica estraibile che ospitava il biochip durante le prove. Nota: Il lettore ECIS dispone di 4 GB di memoria integrata per il software operativo, modelli di controllo ei file di test generati da esecuzione di un test. Ciò consente vari thfile di test ousand per essere memorizzati sul lettore. I file possono essere recuperati con un salto di unità USB e trasferiti a un computer per ulteriori analisi a scopo di ricerca, se desiderato.