Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Linda M. Brennan; Mark W. Widder; Michael K. McAleer; Michael W. Mayo; Alex P. Greis; William H. van der Schalie

doi:10.3791/53555

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Environment

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

Published: March 07, 2016

doi:

10.3791/53555

Linda M. Brennan¹, Mark W. Widder¹, Michael K. McAleer², Michael W. Mayo², Alex P. Greis², William H. van der Schalie¹

¹U.S. Army Center for Environmental Health Research, ²Nanohmics, Inc.

Summary

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Abstract

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

Introduction

Das Ziel war es, ein Verfahren für die Zellaussaat, Lagerung und Prüfung von fluidischen Biochips im ECIS Biosensor zu entwickeln. Das Ziel für die Entwicklung dieses Biosensor war US-Armee Spezifikationen für ein Feld tragbares Gerät zu erfüllen, die eine mögliche Kontamination von Trinkwasserversorgung von Soldaten benutzt wird erkennen konnte. Die Anforderungen an die Toxizität Sensor waren, dass sie sich schnell ein breites Spektrum von toxischen Industrie Verbindungen erkennen konnte (innerhalb einer Stunde) in Konzentrationen relevant für die menschliche Gesundheit, dass das Gerät Feld tragbar sein, und die biologischen Komponenten würde eine Haltbarkeit haben, mindestens neun Monate. Kältetechnik, aber nicht das Einfrieren, die von verderblichen Komponenten war akzeptabel.

Historisch gesehen haben, Feld tragbaren Wasser Prüftechnik mit einer biologischen Komponente , um sie (wie Antikörper, Enzyme oder Nucleinsäuren) Analyt-spezifischen ^1-3. Der Nachteil dieser Art von Biosensoren ist, dass sie onl wirdy zu einem Zeitpunkt eine Art der chemischen Erkennung. Mehrere Sensoren benötigt werden, wenn vermutet wird, dass mehr als eine Chemikalie vorhanden ist. Wenn ein bestimmter Sensor nicht im Test Repertoire, chemische Verunreinigungen im Wasser ist, könnte leicht unentdeckt bleiben.

Breit abgestütztes Toxizität Sensoren, auf der anderen Seite, haben das Potenzial, diese Technologielücke zu füllen. Diese haben in der Regel eine zelluläre Komponente , um sie ^4-8. Die Vorteile der breit abgestützten Toxizität Biosensoren sind , dass sie das Vorhandensein einer Vielzahl von chemischen Verunreinigungen erkennen kann, einschließlich Mischungen und Unbekannten, in einem relativ kurzen Zeitraum ^5,9,10.

Das Konzept der Messung der elektrischen Impedanz von Zellmonolayern als mögliche Toxizitätssensor, der auch als elektrische Zell-Substrat – Impedanz – Mess (ECIS), wurde zuerst bekannt ist ¹¹ von Giaever und Keese beschrieben. In den vergangenen zwei Jahrzehnten ein empfindlicher Indikator für Zell VIAB erwiesen wurdeility und Zytotoxizität. Grundsätzlich wird die Zellmonoschicht, die an die Elektroden auf den Biochips anhaftet auf Hochfrequenz ausgesetzt und niedriger Spannung und Stromstärke Wechselstromsignal. Die konfluente Monoschicht von Zellen behindert den Fluss der Elektronen. Wenn die Integrität der Zellmonoschicht beeinträchtigt ist (beispielsweise wenn eine giftige Chemikalie eingebracht wird), zeichnet der ECIS Sensor eine Änderung in der elektrischen Impedanz ^11-14. 1 veranschaulicht das Prinzip der ECIS in Bezug auf die Zellmonoschicht auf dem Biochip .

Abbildung 1:.. Das Prinzip der ECIS Illustration einer Zellschicht auf einem Biochip mit vereinfachten ECIS Leser elektrisches Schema Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<p class="jove_content"> Zunächst wurden Säugerzelllinien in fluidischer Biochips ausgesät und wurden in der ECIS Sensorik hier ¹² beschrieben , verwendet. Diese Zellen waren nicht praktisch für den Feldeinsatz, aber, weil sie häufige Medienwechsel erforderlich ist , hatte eine begrenzte Haltbarkeit und erforderte eine künstliche CO ₂ -Umgebung und 37 ° C Inkubationstemperatur. Es wurde entdeckt , daß ein im Handel erhältlicher Zelllinie , abgeleitet von Regenbogenforellen gill Epithelzellen (RTgill W-1 – Zellen) bei Raumtemperatur bei Umgebungs CO _2, getestet werden, um eine konfluente Monoschicht in den Biochips gebildet, könnte bei Kühltemperaturen gelagert werden, und hatte eine schnelle Reaktion (1 h oder weniger) zu einem breiten Spektrum an Chemikalien bei Konzentrationen relevant für die menschliche Gesundheit ^12. Anwendungen von RTgill-W1 – Zellen in der Toxikologie, sowie in der Grundlagenforschung werden von Lee et al überprüft. ¹⁵

Verfahren für die Aussaat, Lagerung und Prüfung von fluidischen Biochips enthalten,Monoschichten von RTgill-W1 Zellen auf fluidische Biochips in einem Biosensor ECIS werden hier beschrieben. Die fluidische Biochips können für bis zu 9 Monate in einem gekühlten Zustand gelagert werden und kann zum Testen von Trinkwasser supplies.The begleitenden ECIS Leser, oder Testeinheiten werden separat ausgeliefert in einem kalten Lagerbehälter, versendet werden. Die Biochips haben zwei Komponenten zu ihnen; eine obere Polycarbonatschicht mit zwei getrennten Fluidkanäle, und eine untere Schicht, die elektronische vier Elektroden-Pads pro Kanal für die Impedanzabtastung enthält. Es gibt 10 Arbeitselektroden pro Pad; jede Elektrode 250 & mgr; m im Durchmesser. Die versammelten Biochips haben Goldelektrodenanschlüsse zum Erfassen von Messwerten Impedanz, wenn sie in der ECIS Testgerät eingesetzt. Jede der beiden geschlossenen fluidischen U-förmige Kanäle hält 2 ml der RTgill-W1 Zellsuspension. 2 zeigt eine fluidische Biochip in dem ECIS Leser mit einer Vergrößerung von einer konfluenten Zellen auf einer einzelnen Sensorelektrode.

Abbildung 2:.. Fluidic Biochip in ECIS Reader gezoomten Bereich zeigt eine konfluente Monoschicht von RTgill-W1 – Zellen auf einer einzigen Sensorelektrode Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

1. Herstellung von Testmaterialien HINWEIS: Um die Biochips für die Prüfung, mehrere konfluenten Flasche aus RTgill-W1 Zellen vorbereiten müssen bereit sein. Eine gute Schätzung der Anzahl der Flaschen benötigt wird, ist ein konfluenter T175-Kolben für 16 Biochips ausgesät werden. Führen Sie die folgenden Schritte in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank (biohood) unter aseptischen Bedingungen. Verwenden Sie 70% Ethanol für die biohood Desinfektion und alle in der Haube platziert Materialien. Bereiten Fibronektin Substrat für die fluidische Biochips durch eine 1 mg Phiole von Fibronektin Auftau- und in 100 ml sterilem L-15-Medien für eine Konzentration von 10 ug / ml verdünnt. Einfrieren in 40 ml Aliquots in sterilen 50 ml konischen Polypropylen-Röhrchen bei -20 ° C. Bei Raumtemperatur auftauen mehrere Stunden vor der Biochips Aussaat. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren. Bereiten Zellkulturmedien mit 50 ml fötalem Rinderserum Zugabe von 5 ml 200 mM ein L-alanyl-L-glutamin supergänzen, und 5 ml einer Penicillin / Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten Penicillin / ml und 10.000 & mgr; g Streptomycin / ml) Lager zu 500 ml L-15-Medien. Dies wird 560 ml Zellkulturmedien ergeben, enthaltend 9% Serum. Kalt stellen. Hinweis: Dadurch wird die komplette Zellkulturmedien für den Kulturflaschen und die Biochips verwendet werden. Pulverisierte Medien Vials Bereiten Sie vor der Zeit 0,1 Dram-Snap-cap Fläschchen mit 60 mg ± 0,5% L-15ex Pulver eine automatisierte Pulverspender verwenden. Beschriften Sie die Fläschchen mit dem Tag wurde das Pulver abgegeben und im Kühlschrank lagern Fläschchen (in Mengen von 50) in wiederverschließbaren metallisierter Poly-Taschen; die jeweils drei 1 g Kieselgel Austrocknungs Packungen. Anmerkung: L-15ex pulverisierten Medien Phiolen können hergestellt und für bis zu 9 Monate vor der Prüfung aufbewahrt werden. Machen Sie eine Lösung von 100 ml 20% Bleiche von Haushaltsbleiche mit entsalztem Wasser (DI) zu verdünnen. Schätzung, dass 5 ml Bleichlösung für jede bi benötigt werdenochip. Machen Sie Biochip Röhrenanordnungen von 27 mm Abschnitte von autoklavierbaren bioverträglichen Rohrschneiden (2 Abschnitte für jeden Biochip werden ausgesät) und passen die beiden Enden des Rohres mit Polycarbonat-Rutsch Luerverbindungen. Platzieren Röhrenanordnungen in einem autoklavierbaren Beutel und Autoklaven für 8 min bei 134 ° C. Auch Autoklaven Biochip-Stecker (2 pro Biochip) in einem separaten Beutel bei den gleichen Einstellungen. Autoklav DI-Wasser für 30 min at121 ° C. Hinweis: Dieses Wasser wird zum Spülen Biochips nach dem Aussäen verwendet werden. Schätzen, dass 10 ml für jeden Biochip benötigt werden. Anmerkung: Der tatsächliche Volumen jeder Biochip Kanal 2 ml, aber 5 ml sterilem Wasser durch jeden Kanal nach Entfernung der Bleichlösung gespült. Machen Spritzeninjektionsröhrenanordnungen durch Schneiden 27 mm Abschnitte aus biokompatiblem Schläuche und Befestigungs männlichen Luer-Rutscheinrichtungen an beiden Enden des Schlauches. Legen Röhrenanordnungen in einem Papierheißsiegelsterilisationsbeutel und Autoklaven für 8 min bei 134 &# 176; C. 2. Fluidic Biochip Impfvorgangs Hinweis: Führen Sie alle Verfahren, bei denen die Biochips oder die Medien in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank unter aseptischen Bedingungen behandelt wird. Vierundzwanzig Stunden nach geplanten Aussaat vor, entfernen Sie die Biochips Hersteller Verpackung in der biohood und in sterilisierten Kunststoff Instrumentenkoffern. Sterilisieren der Biochips eine 20% -ige Bleichlösung wie folgt Anmerkung: In der Vergangenheit diese Bleichverfahren wurde das Pilzwachstum in der Biochips bei Langzeitlagerung in dem Fall verhindert, dass die Plasmasterilisation der vom Hersteller durchgeführt Biochips nicht wirksam war. Unter Verwendung einer 20 ml sterile Spritze mit einem Spritzeninjektionsrohranordnung befestigt und in der Arbeits biohood injizieren 2 ml der 20% igen Bleichlösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips für 1 Stunde mit der Bleichlösung zu sitzen. Nach einer Stunde Unterdruck aspwütend die Bleichlösung aus beiden Kanälen eines sterilen männlichen Luer Slip Montage an dem Vakuum-Saug-Schlauch verwenden. Verwenden Sie eine der Biochip-Röhrenanordnungen als Drain, wenn die Biochips Spülung. Mit einer sterilen 20-ml-Spritze mit einer sterilen Spritze Einpritzeinheit angebracht, spülen Sie jeden Kanal des Chips mit 5 ml sterilem Wasser, so dass das überschüssige Wasser in einen Behälter zu entleeren im biohood. Dann Vakuum absaugen das Wasser als nur für das Bleichmittel beschrieben und legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Instrumentenkoffern und im biohood verlassen, bis und mit Zellen besiedelt am folgenden Tag. Sechzig Minuten vor der Biochips Animpfen injizieren 2 ml der 10 ug / ml Fibronektin-Lösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips in der biohood für 60 Minuten, und dann absaugen das Fibronektin Vakuum (wie in Schritt 2.2.3 beschrieben), bevor der Biochip mit Zellen Aussaat. Legen Sie zwei Abschnitte der sterilen Biochip Röhrenanordnungen (sieheAbschnitt 1.4) an den Anschlüssen der Biochips. Trypsinize 16 ein konfluenter RTgill-W1 T175 – Kolben für jeweils 16 Biochips beschriebenen Verfahren in dem Blatt American Type Culture Collection (ATCC) Produktbeschreibung verwendet wird . Absaugen Medien aus dem konfluenten Kolben (n) von Zellen. Spülen Sie die Zellschicht mit 15 ml PBS und dann absaugen. In 6 ml Trypsin / EDTA auf die Zellschicht in jedem T175 Kolben und erlauben Zellen für ~ 5 min zu trypsinize. 15 ml komplette L-15-Zellkulturmedien zu jedem Kolben Trypsinierung zu stoppen. Kombinieren die Zellsuspensionen in einem sterilen Einweg-Behälter. Hinweis: Gebindegröße von 150 bis 500 ml, abhängig von der Anzahl von Biochips variieren wird ausgesät. Schätzung, die 5 ml Zellsuspension werden pro Biochips benötigt werden. Entfernen Sie ~ 1 ml der Zellsuspension und in einen Mikrozentrifugenröhrchen für die Zählung. Mit einem Hellfeldmikroskop mit 10-facher objectiVE und einem Hämocytometer, ein 10 ul – Aliquot der Zellen zählen und das Volumen des kompletten L-15 – Zellkulturmedien Berechnung erforderlich , um eine Zellsuspension von 2,5 x 10 5 Zellen / ml zu erreichen. Hinweis: Wenn Sie die Zellsuspension unter Verwendung von Kolben zu impfen, die Kultur fortzusetzen, ist dies der Punkt sein würde, dies zu tun. Stellen Sie die Zellsuspension Konzentration mit kompletten L-15-Zellkulturmedien. Mit einer sterilen 20 ml syringeattached auf eine sterile Spritze Injektionsschlauchleitungsbaugruppe (siehe Abschnitt 1.6), Injizieren von 2,5 ml der Zellsuspension in die Außenöffnung jedes Kanals des Biochips (dh die Anschlüsse, angebracht nicht den Schlauch haben), einige der zusätzlichen Zellsuspension erlaubt in der biohood aus dem Schlauch in einen Abfallbehälter zu fließen. Hinweis: Dadurch wird sichergestellt, dass der gesamte Kanal und die angeschlossenen Schläuche der Zellsuspension wird voll sein. Erstellen Sie eine geschlossene Schleife für jeden Biochip-Kanal durch das freie Ende des Schlauches mit den Luer fitti Einsetzenng in die äußeren Anschlüsse für jeden Kanal. Wischen Sie überschüssige Medien aus der geschlossenen Schleifen mit einem Papiertuch mit 70% Ethanol befeuchtet und legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Box in einem 20 ° C Inkubator. Geben Sie jedem Biochip eine eindeutige Identifikationsnummer. An den Tagen 4 und 7, die Biochips aus dem 20 ° C Inkubator entfernen und die Medien in allen der Biochips mit temperatur äquilibriert vollständigen L-15 Zellkulturmedium aufzufüllen. Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2.6 außer Gebrauch nur L-15-Zellkulturmedien statt (keine Zellsuspension). Legen Sie die Biochips in der 20 ° C-Inkubator zurück nach dem Tag 4 Fütterung. Nach dem Tag 7 Fütterung, zu entfernen und die Schläuche von den Chips zu verwerfen und die autoklaviert Ablassschrauben in den Biochips einlegen. Legen Sie die Biochips in einer Kiste in einem 6 ° C Inkubator bis zum Testen verwendet. Anmerkung: Die Chips können für bis zu 9 Monate bei Kühltemperaturen gelagert werden und sind immer noch lebensfähig zum Testen in die ECIS Leser. 3. ECIS Testen mit Biochips Bereiten Testchemikalien bei der Verwendung. (Siehe Brennan et al., 2012 7 zur Herstellung von Testchemikalien). Entfernen ECIS Leser und Testlieferungen aus dem Koffer. Entfernen Sie eine vorbereitete Biochips aus dem 6 ° C Inkubator. Setzen Sie den Biochip auf einem Papiertuch. Schalten Sie den ECIS Leser. Unter Verwendung von 10 ml Spritzen, verzichtet werden 10 ml Steuer Wasser in eine Unze 0,5 markierten durchsichtigen Kunststoff-Kontrollglas und 10 ml der Testprobe in eine Unze 0,5 markierten durchsichtigen Kunststoff-Messbecher. Anmerkung: 1) Achten Sie darauf, Blasen für eine genaue Messung zu entfernen. 2) Die Spritzen und Gläser sind farbcodiert; Blau für die Steuerung und rot für den Test. Entfernen Sie die zwei pulverisierte Medien Fläschchen aus den Folienbeutel. Öffnen Sie eine der pulverförmigen Medien Fläschchen (Verwendung Mehrzweckwerkzeug, wenn nötig) und gesamte Inhalt einer Flasche in das Glas mit Steuer Wasser gießen, das gesamte Fläschchen fallen inLösung auch. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Testglas. Cap und schütteln Sie die Gläser, um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig gelöst ist. Füllen Sie jedes der farbigen 10 ml Spritzen mit 9 ml entweder Kontrolle (blau Spritze) oder Test (rot Spritze) Lösungen aus den jeweiligen Fläschchen. Entfernen von Luftblasen aus Spritzen. Entfernen Sie die Stecker aus den Biochip-Ports und den Abfluss befestigen. Setzen Sie den Biochip in den abnehmbaren Plastikschale in der ECIS-Leser und den Deckel schließen. Bringen Sie Spritzen an die äußeren Biochip-Ports und den Spritzenkolben befestigen. Aus dem Hauptmenü die Option "NEXT" Pre-Test zu initiieren. Hinweis: Reader-Software Impedanzen überprüfen. Wenn Impedanzen durch den Benutzer innerhalb des Bereichs festgelegt sind ( in der Regel zwischen 1.000 und 3.000 Ohm) wird der Bildschirm Register "Cartridge Bestanden" , wie in Abbildung 3 angegeben ist , und den Benutzer anweisen, wählen Sie "Weiter" und die Software wird weitergehen 3.10 zu Schritt). Wenn die Impedanzen nicht innerhalbdie eingestellten Bereich wegen eines defekten Biochips oder fehlerhafte Verbindung des Biochips für den Leser (in der Regel aufgrund einer Fehlausrichtung der Elektroden), dann wird der Bildschirm Register "Cartridge Failed" und der Benutzer hat die Möglichkeit, entweder auf "Abbrechen" oder "Überprüfen" den Test. Wählen Sie "Abbrechen" zurück 3.9 zu Schritt). Wählen Sie "Überprüfen", um fortzufahren 3.10 Schritt A) nach einem Empfang "Cartridge Bestanden" Nachricht und wählen Sie "Weiter". Hinweis: Es ist am besten, den Biochip zu nehmen und visuell untersuchen Sie ihn auf Mängel oder undicht, wenn eine "Cartridge fehlgeschlagen" Nachricht, bevor Sie mit einem neuen Biochip empfangen wird. Abbildung 3:. ECIS Reader Screenshot eines Biochips mit Acceptable Impedanzmessungen Der Screenshot zeigt Anfangsimpedanzmessungen in Ohm jeder der vier Control Elektroden (CE) und 4 Testprobe Elektroden (SE) im fluidischen Biochip. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Wenn der Leser aufgefordert, geben Sie Probeninformationen eine Soft-Tastatur verwenden und wählen Sie dann auf "Akzeptieren", wenn Sie fertig. Hinweis: Die ECIS-Reader-Software automatisch bei jedem Datensatz mit dem Datumsstempel wird, Zeit und andere Informationen, die von dem Benutzer eingegeben; wie die Biochip-Nummer und die Art der chemischen und Konzentration. Zwei Minuten von Impedanzdaten werden aus dem eingesetzten Biochips gesammelt werden und ein On-Screen-Timer Countdown-Zeit. Nach zwei Minuten, wenn sie durch Anweisungen auf dem Bildschirm aufgefordert, die in einem roten Feld blinken, klicken Sie auf "Weiter". Wenn durch Blinken der grünen Box aufgefordert, "Proben injizieren jetzt", injizieren, um die Kontroll- und Testmedien aus den beigefügten Spritzen gleichzeitig in den Biochip channels. Lassen Sie die Spritzen an Ort und Stelle auf den Biochips, wenn Sie fertig. Hinweis: Impedanzwerte werden einmal pro Minute für 60 Minuten gesammelt werden. Wenn der Leser Software ECIS bestimmt, dass der Behandlungskanal von dem Steuerkanal an einer beliebigen Stelle zwischen 10 und 60 Minuten nach Testbeginn, dann ist die On-Screen-Display zeigt an, dass die Probe "verseucht" statistisch unterschiedlich ist. Wenn die Behandlung nicht verschieden von dem Steuerkanal ist, dann wird der Bildschirm die Meldung "Keine Kontamination erkannt" am Ende des Testlaufs. Nehmen Sie die Testergebnisse als kontaminiert oder nicht für jede Probe verunreinigt. Am Ende des Testlaufs, zu entfernen und den Biochip zu verwerfen. Spülen und der Luft trocknen die Spritzen, Teströhrchen und herausnehmbaren Plastikschale, die den Biochip während der Tests untergebracht. Hinweis: Die ECIS Leser verfügt über 4 GB Onboard-Speicher für die Betriebssoftware, Steuerungsmodelle und die Testdateien generiert aus einem Test ausgeführt wird. Dies ermöglicht mehrere thousand Testdateien auf dem Lesegerät gespeichert werden. Die Dateien können mit einem USB-Sprung-Antrieb abgerufen werden und für weitere Analysen zu Forschungszwecken auf einen Computer übertragen, falls gewünscht.

Representative Results

Die ECIS Technologie in diesem Papier beschrieben unterzog Prüfung bei der US Environmental Protection Agency (US-EPA) -sponsored Technik Prüf- und Evaluation Program (TTEP). Dreizehn Chemikalien wurden für die Prüfung als Vertreter eines breiten Spektrums von toxischen Industrie Verbindungen ausgewählt, die mögliche Verunreinigungen von Trinkwasser sein könnte. Während des Tests, 9 der 13 durch ECIS innerhalb einer Stunde bei Konzentrationen nachgewiesen wurden , die für die menschliche Gesundheit relevant sind 8. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Verunreinigungsprüfung. 4 Figur ist repräsentativ , was ein "verseucht" Ergebnis wie auf aussehen der ECIS Leser Bildschirm. Zum größten Teil, verminderte zelluläre Impedanzen für kontaminierte Proben im Vergleich zu Kontrollen. Gelegentlich können bestimmte Verbindungen, die eine Erhöhung der Impedanz verursachen. Auch in Tabelle 1 zusammengefasst </strong> ist die saubere Wasserprüfung. Vierzig saubere Wasserproben wurden durchgeführt und keine Verunreinigung wurde in keiner der Proben (siehe Abbildung 5) für einen repräsentativen Screenshot von "No Verunreinigung festgestellt" erkannt. Abbildung 4: ECIS Reader Screenshot einer "verseucht" Wasserprobe Ein Beispiel für eine normalisierte Impedanz Grafiken und Ergebnisse aus einer Wasserprobe , die verunreinigt war.. Blaue Linien stellen normalisierte Impedanzen von jeder der Steuerelektroden; roten Linien stellen normalisierte Impedanzen jedes der Testprobe Elektroden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5: ECIS Reader Screenshot einer "No Verunreinigung festgestellt" Wasserprobe Ein Beispiel für eine normalisierte Impedanz Grafiken und Ergebnisse aus einer Wasserprobe , die nicht verunreinigt war.. Blaue Linien stellen normalisierte Impedanzen von jeder der Steuerelektroden; roten Linien stellen normalisierte Impedanzen jedes der Testprobe Elektroden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Kategorie Contaminant Getestete Konzentration (mg / L) 1 Erkannt ≤1 Stunde n = 4/4 Chips Pestizide Aldicarb 0,17 Nein Arsen ic (Natriumarsenit) 4.5 ja Azid (Natriumazid) 46.7 ja Fenamiphos 0,56 Nein Methamidophos 1.4 Nein methyl Parathion 33.6 ja Paraquat (dichlorid) 4.6 Nein Pentachlorophenate (Natrium) 71,9 ja Industriechemikalien Ammoniak 924 ja Kupfer (Kupfer-II-Sulfat) 103 ja Cyanid (Natrium) 3 "> 14 ja Mercury (Chlorid) 24.7 ja Toluol 444 ja Clean Water 2 keiner N / A Nein 1 getesteten Konzentrationen sind die gleichen wie in dem Manuskript von Widder, et al. (2014). 2 40 saubere Wasserproben wurden ohne Kontamination führen. Tabelle 1: Schadstoffe in Wasserproben durch ECIS erkannt.

Discussion

Die ECIS Technologie eine gute Leistung in einer Laborumgebung und war in der Lage mögliche Wasser Verunreinigungen in Konzentrationen zu ermitteln, die für die menschliche Gesundheit relevant sind. Die Portabilität und Verpackung der Technologie macht es auf den Feldeinsatz förderlich.

Kritische Schritte in dem Protokoll für den Erfolg der Technik sind wie folgt: 1) Halten Sie aseptischen Bedingungen während der Kultur, Säen und Fütterung der Biochips, 2) Halten Sie die ausgesäten Biochips in gekühlten Bedingungen bis zum Testen bereit, da die RTgill-W1-Zellen wird nicht sehr lange überleben, wenn sie auf Temperaturen über 25 ° C ausgesetzt sind, 3) wird genau das L-15ex in den pulverförmigen Phiolen Medien und genau die Wasserproben Fehlalarme zu vermeiden messen Herstellung, die durch eine Verschiebung der verursacht werden kann Osmolalität von Medien eher als Probe Toxizität, 4) zum Ausführen der Tests Gebrauchsanweisungen auf der ECIS Bildschirm. Die Software in dem Lesegerät alarmiert den Benutzer, wenn eine biochip ist nicht akzeptabel für die Prüfung (bezogen auf den anfänglichen Impedanzmessungen), wenn der Biochip zuerst in das Lesegerät eingeführt wird. Wenn die Impedanzniveaus nicht akzeptabel für die Prüfung sind, wird die Software nicht zulassen, dass der Benutzer mit der Prüfung fortfahren, bis ein neuer Biochip verwendet wird. Gründe für nicht akzeptabel Impedanzmessungen sind in der Regel aufgrund einer leichten Versatz der Biochip-Elektroden mit den ECIS Leser Stifte oder Flüssigkeitsleckage an einer der Verklebung Kanten des Biochips.

Es gibt einige Grenzen dieser Technologie, da der ECIS Sensor nur mit Trinkwasser und nicht mit Oberflächenwasser getestet. Die RTgill-W1-Zellen, die auf dem Biochip sind, können nicht das Einfrieren oder die Temperaturen weit über 25 ° C für längere Zeit (Zeitrahmen abhängig von Stunden bis Tagen sein kann, von der Temperatur tolerieren. Die Biochips am besten funktionieren in einem Temperaturbereich von gekühlt Raumtemperatur ^7. Sie sind sofort einsatzbereit, jedoch direkt nach r zu seinemoved von kalten Lagerung. Tragbare Kühlraumbehälter werden derzeit von Armeepersonal im Bereich für temperaturempfindliche Versorgungen verwendet. Diese gleichen Behälter können für geimpfte Biochip Transport verwendet werden.

Eine weitere Beschränkung dieser Technik besteht darin, dass, obwohl es ein Breitbandsensor Toxizität ist, ist es nicht gut reagiert, wenn überhaupt, auf die Cholinesterase-hemmenden Verbindungen, wie einige Pestizide. Um diese Fähigkeit Lücke zu füllen, wird der ECIS-Sensor entwickelt, um mit einem im Handel erhältlichen schnellen Pestizid-Test-Test in Verbindung verwendet werden, wenn Wasserproben, um die Prüfung der Benutzer mit einem breiteren Spektrum von Toxizitätstests zur Verfügung zu stellen. Das Kit ist eine schnelle enzymatische Assays entwickelt, um Organophosphat und Carbamatpestiziden innerhalb von 30 Minuten zu erkennen.

Die ECIS Sensor ergänzt das WQAS-PM (Water Quality Analysis System – Präventive Medizin) Bereich Wasser-Testsystem, das derzeit von militärischen Präventivmedizin Personal zur Erkennung, arsenic, Blei oder Zyanid in einer Trinkwasserprobe. Obwohl der ECIS Sensor nicht erkennen, was die Verunreinigung ist, zeigt es, wenn bestimmte Metalle oder organische Verbindungen vorhanden sind, was darauf hinweist, dass das Wasser nicht für den menschlichen Verzehr geeignet sind. Die ECIS Testergebnisse sind innerhalb einer Stunde zur Verfügung. Die Wasserproben können dann zur Identifizierung der kontaminierenden gesendet für eine weitere Analyse, wenn es ein positives Testergebnis.

Wie oben beschrieben, wird der ECIS Leser ausgelegt ist Teil eines Systems sein, die eine separate enzymatische ACE-Kit, um ein breites Spektrum an Fremdkörperdetektion zur Deckung umfasst. Beide Leser werden in einem robusten Gehäuse verpackt für Feldtransport für den Feldeinsatz von Soldaten.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.

Materials

Fetal bovine serum	Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com	16000-085	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).
Fibronectin, bovine plasma	EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com	341631-1 mg	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips.
L-15 media without L-glutamine	Lonza www.lonzabioscience.com	12-700F	Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C.
L-15ex powdered media with phenol red	US Biological www.usbio.net	L1501	Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips.
PBS, w/o Ca++ or Mg++	Lonza www.lonzabioscience.com	17-516F	Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.
Trypsin, EDTA	Lonza www.lonzabioscience.com	CC-5012	Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks.
T175 culture flasks	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-30	Used for culturing RTgill-W1 cells.
Bleach	Chlorox www.chlorox.com		Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.
70 % ethyl alcohol			For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)	American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org	CRL-2523	Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM	Lonza www.lonzabioscience.com	35050-061	Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K	Lonza www.lonzabioscience.com	17-602E	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Pharmed BPT tubing	U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com	57317	Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies	Value Plastics	MTLS210-9	Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.
20 mL syringes, slip-tip	VWR Scientific us.vwr.com	BD302831	Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials	Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com	30600	Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"	Medi-Dose EPS medidose.com	IB701	Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips.
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13”	CardinalHealth www.cardinalhealth.com	90713	Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.
Quantos automated powder dispenser	Mettler Toledo www.mt.com	QB5	Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.
ECIS reader	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.
3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags	Uline www.uline.com	S-16893	Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.
Leatherman squirt ps4	Amazon www.Amazon.com		Used to open powdered media vials.
1 gram silica gel desiccant packets	Uline www.uline.com	S-3902	Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.
Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles	Fisher Scientific www.fishersci.com	09-740-25C or E	Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.
Plugs for biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C.
Drains for ECIS biochips	Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections.
Hemocytometer	Fisher Scientific www.fishersci.com	S17040	Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.
Brightfield microscope w/ 10X objective	Leitz Labovert		Any brightfield microscope is acceptable.
Class II biological safety cabinet			Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.
Microcentrifuge tubes, 0.6 mL	Fisher Scientific www.fishersci.com	02-681-311	Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells.
Slip 10 cc red syringes	Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com	S/49S 30-R	Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip.
Slip 10 cc blue syringes	Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com	S/49S 30-B	Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip.
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps	SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com	0605-30	Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing.
50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-269	Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C.

References

Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , 1-25 (2008).
van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
O’Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
. RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , (2015).

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Brennan, L. M., Widder, M. W., McAleer, M. K., Mayo, M. W., Greis, A. P., van der Schalie, W. H. Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity. J. Vis. Exp. (109), e53555, doi:10.3791/53555 (2016).

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