Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit

1. Bereiding van testmaterialen Opmerking: Om de biochips bereiden voor het testen, verscheidene confluente flessen van RTgill-W1 cellen moeten klaar staan. Een goede schatting van het aantal flessen nodig is een samenvloeiing T175 kolf gedurende 16 biochips worden gezaaid. Voer de volgende stappen in een klasse II bioveiligheidskast (biohood) met behulp van aseptische techniek. Gebruik 70% ethanol voor het ontsmetten van de biohood en materialen geplaatst in de kap. Bereid fibronectine substraat voor de vloeibare biochips door ontdooien een 1 mg flesje van fibronectine en verdunnen in 100 ml steriel L-15 medium voor een concentratie van 10 ug / ml. Bevriezen in 40 ml aliquots in steriele 50 ml conische polypropyleen buizen bij -20 ° C. Ontdooien bij kamertemperatuur enkele uren vóór het zaaien biochips. Eenmaal ontdooid, niet opnieuw invriezen. Bereid celkweekmedia door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamine supcomplement en 5 ml penicilline / streptomycine-oplossing (10.000 eenheden penicilline / ml en 10.000 pg streptomycine / ml) bouillon aan 500 ml L-15 media. Dit wordt 560 ml celkweekmedium bevattende 9% serum werd verkregen. Koel. Opmerking: Dit zal de volledige celkweek media gebruikt voor de cultuur kolven en biochips zijn. Gepoederde Media Flesjes Bereid van tevoren 0,1 dram snap-cap flacons met 60 mg ± 0,5% van de L-15ex poeder met behulp van een geautomatiseerde poeder dispenser. Label de flesjes met de datum van de poeder werd afgegeven en in de koelkast flesjes (in hoeveelheden van 50) in hersluitbare gemetalliseerde plastic zakken; elk drie 1 g silicagel uitdroging packs. Opmerking: L-15ex poedervormige media flacons kunnen worden gemaakt en bewaard tot 9 maanden voorafgaand aan het testen. Voeg een oplossing van 100 ml 20% bleekmiddel door verdunning bleekmiddel met gedeïoniseerd (DI) water. Schatten dat 5 ml bleekwater oplossing nodig zullen zijn voor elk biochip. Voeg biochip buis samenstellen door snijden 27 mm gedeelten van autoclaveerbare biocompatibele buis (2 delen per biochip wordt gezaaid) en breng de uiteinden van de buis met polycarbonaat slip luer fittings. Plaats tubing samenstellingen in een autoclaveerbare zak en autoclaaf gedurende 8 minuten bij 134 ° C. Ook autoclaaf biochip pluggen (2 per biochip) in een aparte zak bij dezelfde instellingen. Autoclaaf DI water gedurende 30 min at121 ° C. Opmerking: Dit water wordt gebruikt voor het spoelen biochips na zaaien. Schatten dat 10 ml nodig zullen zijn voor elke biochip. Opmerking: Het werkelijke volume van elk biochip kanaal 2 ml, maar 5 ml steriel water wordt gespoeld door middel van elk kanaal na verwijdering van bleekwater-oplossing. Voeg spuitinjectie buis samenstellen door snijden 27 mm gedeelten biocompatibele buizen en bevestigen mannelijke luer slip installatiemateriaal aan beide uiteinden van de buis. Plaats de slang assemblages in een papieren warmte-seal sterilisatie zakje en autoclaaf gedurende 8 minuten bij 134 &# 176; C. 2. Fluidic Biochip Seeding Procedure Opmerking: Voer alle procedures waarin de biochips of de media wordt behandeld in een klasse II bioveiligheidskast met behulp van aseptische techniek. Vierentwintig uur voor de geplande zaaien, verwijder de biochips van de fabrikant verpakking in de biohood en plaats in gesteriliseerde plastic instrument gevallen. Steriliseer het biochips met een 20% bleekmiddeloplossing als volgt Opmerking: Historisch gezien heeft deze procedure bleken schimmelgroei in de biochips voorkomen tijdens langdurige opslag in het geval dat het plasma sterilisatie van de biochips gedaan door de fabrikant was niet effectief. Met behulp van een steriele 20 ml spuit met een injectiespuit injectie buis constructie bevestigd en werken in de biohood injecteren 2 ml van de 20% bleekwater oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips te zitten gedurende 1 uur met de bleekwater oplossing. Na één uur vacuüm aspRazend het bleekmiddel oplossing van beide kanalen met een steriele mannelijke slip luer montage aan de afzuiging slang. Gebruik een van de biochip slang assemblages als een drain bij het spoelen van de biochips. Met behulp van een steriele 20 ml spuit bevestigd aan een steriele injectiespuit inspuitsamenstel Spoel elk kanaal van de chip met 5 ml steriel water, zodat het overtollige water afvoer in een container in de biohood. Dan vacuüm aspireren uit het water als zojuist beschreven voor het bleekmiddel en plaats de biochips terug in de plastic instrument gevallen en laat in de biohood tot ingezaaid met cellen van de volgende dag. Zestig min vóór het zaaien biochips Injecteer 2 ml van 10 ug / ml fibronectine oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips in de biohood gedurende 60 min, en vervolgens vacuüm aspireren van de fibronectine (zoals beschreven in stap 2.2.3) voor het zaaien de biochip met cellen. Plaats twee gedeelten van de biochip steriele buis samenstellen (zieparagraaf 1.4) op de havens van de biochips. Trypsinize een confluente RTgill-W1 T175 kolf voor elke 16 biochips middels procedures in de American Type Culture Collection (ATCC) productbeschrijving plaat 16. Aspireren van de media uit de samenvloeiing fles (s) van de cellen. Spoel de cel laag met 15 ml PBS en vervolgens te zuigen uit. Voeg 6 ml trypsine / EDTA de cellaag in elke T175 kolf en laat cellen trypsinize gedurende ~ 5 min. Voeg 15 ml volledige L-15 media voor celkweek aan elke kolf trypsine te stoppen. Combineer de celsuspensies in een steriele houder. Noot: Tankgrootte varieert 150-500 ml, afhankelijk van het aantal biochips worden gezaaid. Schatten dat 5 ml celsuspensie nodig zal zijn per biochip. Verwijderen ~ 1 ml van de celsuspensie en plaats in een microcentrifugebuis voor het tellen. Met een helderveld microscoop met 10x DOELSTEve en een hemocytometer, behoren een 10 pl aliquot van de cellen en bereken het volume van volledige L-15 celkweekmedium nodig om een celsuspensie van 2,5 x 10 5 cellen / ml bereiken. Opmerking: Bij gebruik van de celsuspensie aan kolven zaad aan de kweek voortgezet, zou dit het punt dat te doen. Pas de celsuspensie concentratie met behulp van volledige L-15 celkweek media. Met behulp van een steriele 20 ml syringeattached een steriele injectiespuit injectie buis constructie (zie paragraaf 1.6), injecteer 2,5 ml van de celsuspensie in de buitenste poort van elk kanaal van de biochip (dwz de poorten die de slang bevestigd hebben), waardoor een deel van de extra celsuspensie uit de buis te stromen in een afvalcontainer in de biohood. Opmerking: Dit zal ervoor zorgen dat het hele kanaal en de bijgevoegde slang vol van de celsuspensie zal zijn. Maak een gesloten lus voor elk biochip kanaal door het invoegen van het vrije uiteinde van de slang met de Luer fitting in de buitenste poorten voor elk kanaal. Veeg overtollig papier uit de gesloten lussen met een papieren doek bevochtigd met 70% ethanol en zet de biochips terug in de plastic box aan een 20 ° C incubator. Geef elke biochip een uniek identificatienummer. Op dag 4 en 7, verwijder de biochips uit de 20 ° C incubator vervult de media in alle biochips met temperatuur geëquilibreerd volledige L-15 celkweekmedium. Volg dezelfde procedure als in stap 2.6 met uitzondering van het gebruik slechts L-15 celkweek media in plaats (geen celsuspensie). Plaats de biochips terug in de 20 ° C incubator na 4 dagen voeden. Na de dag 7 voeden, te verwijderen en gooi de slangen van de chips en steek de geautoclaveerd aftappluggen in de biochips. Plaats de biochips in een doos in een 6 ° C incubator tot gebruik voor het testen. Opmerking: De chips kunnen worden bewaard bij koeltemperaturen tot 9 maanden en nog steeds levensvatbaar voor het testen in de ECIS lezers. 3. ECIS Testen met biochips Bereid analyse chemicaliën als het gebruiken. (Zie Brennan, et al., 2012 7 voor de bereiding van de test chemische stoffen). Verwijder ECIS reader en test leveringen uit de draagtas. Verwijderen van een biochip bereid uit de 6 ° C incubator. Plaats de biochip op een papieren handdoek. Schakel de ECIS lezer. Met behulp van 10 ml spuiten, afzien van 10 ml van de controle water in een gemerkte 0,5 ounce doorzichtige plastic controle pot en 10 ml van het monster in een gemerkte 0,5 ounce doorzichtige plastic-test pot. Opmerking: 1) Zorg ervoor dat u bellen te verwijderen voor een nauwkeurige meting. 2) De spuiten en potten hebben een kleurcode; blauw voor de controle en rood voor de test. Verwijder de twee gepoederde media flacons uit de folie zakken. Open een van de gepoederde media flacons (gebruik multifunctionele tool indien nodig) en giet gehele inhoud van een flesje in de pot met controle water, laten vallen van de gehele flacon inoplossing ook. Herhaal deze procedure met de test pot. Dop en schud de potten zodat het poeder wordt opgelost. Vul elk van de gekleurde 10 ml spuiten met 9 ml van ofwel controle (blauw spuit) of toets (rode spuit) oplossingen van respectievelijke flesjes. Verwijder luchtbellen uit spuiten. Haal de stekkers uit de biochip havens en bevestig de afvoer. Plaats de biochip in de verwijderbare plastic bak in de ECIS lezer en sluit het deksel. Hechten injectiespuiten aan de buitenste biochip havens en bevestig de zuiger. Vanuit het hoofdscherm, selecteer "NEXT" om pre-test te starten. Opmerking: Reader software impedanties controleren. Als impedanties zich binnen het bereik van de gebruiker (meestal tussen 1000 en 3000 ohm) het scherm registreert ingesteld "Cartridge Geslaagd", zoals aangegeven in figuur 3, en instrueer de gebruiker in staat om "Next" te selecteren en de software zal overgaan tot stap 3.10). Als de impedantie niet binnenhet ingestelde bereik als gevolg van een defecte biochip of gebrekkige aansluiting van de biochip om de lezer (meestal te wijten aan een foutieve uitlijning van de elektroden), dan zal het scherm registreren "Cartridge mislukt 'en zal de gebruiker de optie om ofwel" Afbreken "of "Controleer" de test. Selecteer "Afbreken" om terug te gaan naar stap 3.9). Selecteer "Controleer" om door te gaan naar stap 3.10) na ontvangst van een "Cartridge Passed 'boodschap en het selecteren van" Next ". Opmerking: Het beste is om de biochip nemen en visueel inspecteren op gebreken of lekt als een "Cartridge Failed" bericht wordt ontvangen alvorens met een nieuwe biochip. Figuur 3:. ECIS Reader Screenshot van een Biochip met Acceptabel impedantie Readings Het screenshot toont eerste impedantie metingen in ohm van elk van de 4 control elektroden (CE) en 4 proefmonster elektroden (SE) binnen de vloeibare biochip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Wanneer u wordt gevraagd door de lezer, voer monster informatie met behulp van een zachte toetsenbord en selecteer vervolgens "Accepteren" als u klaar bent. Let op: De ECIS reader software zal automatisch elke dataset met de datum, tijd en andere informatie door de gebruiker ingevoerde stempel; zoals de biochip nummer en het soort chemisch en concentratie. Twee min van impedantie gegevens worden verzameld uit de ingevoegde biochip en een timer op het scherm zal count-down tijd. Na twee min als daarom wordt gevraagd door de instructies op het scherm die knipperen binnen een rode doos, klik op "NEXT". Wanneer u wordt gevraagd door een knipperende groene vak 'injecteren samples nu ", injecteer de controle en test media uit de bijgevoegde spuiten gelijktijdig in de biochip channels. Laat de spuiten op zijn plaats op de biochips als u klaar bent. Opmerking: impedantie waarden zullen eenmaal per minuut worden verzameld voor 60 min. Als de ECIS lezer software bepaalt dat de behandeling kanaal is statistisch significant verschillend van de controle-kanaal op elk punt tussen de 10 en 60 minuten na de start van de test, dan is de weergave op het scherm geeft aan dat het monster "Verontreinigde". Als de behandeling is niet anders dan de controle-kanaal, dan is het scherm toont "No Contamination gedetecteerd" aan het einde van de test run. Record testresultaten besmet of niet verontreinigd voor elk monster. Aan het einde van de test uit te voeren, te verwijderen en gooi de biochip. Spoel en air-droog de spuiten, testen flesjes en verwijderbaar plastic bakje waarin de biochip tijdens de tests gehuisvest. Opmerking: De ECIS lezer heeft 4 GB aan opslag aan boord van de operationele software, controle modellen en de testbestanden gegenereerd op basis van een test. Hierdoor kunnen meerdere Thousand testbestanden worden opgeslagen op de lezer. Bestanden kunnen worden opgehaald met een USB sprongaandrijving en overgebracht naar een computer voor verdere analyse voor onderzoeksdoeleinden indien gewenst.