Biochips فلويديك مع خلايا RTgill-W1 لرابيد تقييم عينات مياه الشرب لسمية إعداد واختبار المقاومة المستندة إلى
Summary
This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.
Abstract
This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.
Introduction
وكان الهدف العام لتطوير طريقة للخلية البذر والتخزين واختبار biochips الموائعية في جهاز الاستشعار البيولوجي ECIS. وكان الهدف من أجل تطوير هذا المستشعر لتلبية مواصفات الجيش الأمريكي لجهاز محمول الحقل الذي يمكن الكشف عن تلوث محتمل لامدادات مياه الشرب التي يستخدمها الجنود. وكانت متطلبات استشعار سمية أنه يمكن الكشف عن مجموعة واسعة من المركبات الصناعية السامة بسرعة (في غضون ساعة) في تركيزات ذات الصلة بصحة الإنسان، أن الجهاز سيكون الميدان المحمولة، كما أن المكونات البيولوجية لديهم العمر الافتراضي لل تسعة أشهر على الأقل. التبريد، ولكن ليس تجميد، من المكونات القابلة للتلف مقبول.
تاريخيا، كان الحقل المحمولة تقنيات اختبار الماء مع المكون البيولوجي لهم (مثل الأجسام المضادة، والإنزيمات، والأحماض النووية) تحليلها محددة 1-3. العيب إلى هذه الأنواع من أجهزة الاستشعار هو أنها سوف ONLذ كشف نوع واحد من المواد الكيميائية في وقت واحد. هناك حاجة إلى أجهزة استشعار متعددة إذا كان يشتبه في أن مادة كيميائية أكثر من موجود. إذا كان جهاز استشعار معين ليس في جعبته الاختبار، يمكن الملوثات الكيميائية في المياه تذهب بسهولة لم يتم كشفها.
أجهزة الاستشعار سمية على نطاق واسع، من ناحية أخرى، لديها القدرة على سد هذه الثغرة التكنولوجيا. لديك هذه عادة ما يكون عنصر الخلوي لهم 4-8. مزايا هذه الأجهزة سمية على نطاق واسع هي أنها يمكن الكشف عن وجود مجموعة واسعة من الملوثات الكيميائية، بما في ذلك الخلائط والمجهولة، في فترة قصيرة نسبيا من الزمن 5،9،10.
مفهوم استخدام قياس معاوقة من الطبقات الوحيدة الخلية كجهاز استشعار سمية الممكن، والذي يعرف أيضا باسم كهربائي خلية الركيزة مقاومة الاستشعار (ECIS)، وقد وصفت لأول مرة من قبل Giaever وKeese 11. على مدى العقدين الماضيين وقد تبين أن يكون مؤشرا حساسا من viab خلية ility والسمية الخلوية. أساسا، ما يتعرض له أحادي الطبقة الخلية التي انضمت إلى أقطاب كهربائية على biochips إلى التردد العالية والمنخفضة الجهد والتيار المتردد إشارة الحالية. أحادي الطبقة متموجة من الخلايا تعوق تدفق الإلكترونات. عندما يتم المساس سلامة أحادي الطبقة الخلية (مثل عندما يتم إدخال مادة كيميائية سامة)، وأجهزة الاستشعار ECIS يسجل تغييرا في معاوقة 11-14. ويوضح الشكل (1) مبدأ ECIS فيما يتعلق أحادي الطبقة خلية على بيوشيب .
الشكل 1:.. مبدأ ECIS توضيح لأحادي الطبقة خلية على بيوشيب مع مبسطة القارئ ECIS التخطيطي الكهربائية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
طرق لزرع البذور وتخزينها واختبار biochips الموائعية تحتوي على ووصف الطبقات الوحيدة الخلايا RTgill-W1 على biochips الموائعية في جهاز الاستشعار البيولوجي ECIS هنا. وbiochips الموائعية يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 9 أشهر في حالة مبردة ويمكن شحنها في حاوية التخزين البارد، لاختبار مياه الشرب supplies.The المرافق القراء ECIS، أو وحدات الاختبار، يتم شحنها بشكل منفصل. وbiochips من عنصرين لهم. طبقة البولي العلوي مع قناتين السوائل منفصلة، وطبقة الإلكترونية أقل يحتوي على أربعة منصات الكهربائي في قناة للاستشعار عن مقاومة. هناك 10 أقطاب العمل في وسادة. كل قطب كهربائي هو 250 ميكرون في القطر. وbiochips تجميعها لديهم اتصالات الذهب الكهربائي للحصول على قراءات مقاومة عند إدراجها في وحدة اختبار ECIS. سيكون على كل من القناتين على شكل U الموائعية المغلقة تعقد 2 مل من تعليق خلية RTgill-W1. ويبين الشكل 2 (أ) بيوشيب فلويديك في القارئ ECIS مع التكبير من خلايا متكدسة على القطب الاستشعار واحد.
<p class= "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 2:.. بيوشيب فلويديك في ECIS قارئ معارض منطقة تضخيم أحادي الطبقة متموجة من الخلايا RTgill-W1 على القطب الاستشعار واحد الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكنولوجيا ECIS أداء جيدا في إعداد مختبر وتمكنت من الكشف عن الملوثات المائية المحتملة في تركيزات ذات الصلة بصحة الإنسان. قابلية والتعبئة والتغليف والتكنولوجيا يجعلها تفضي إلى استخدام الميداني.
الخطوات الحاسمة في بروتوكول لنجاح هذه التكنولوجيا هي كما يلي: 1) الحفاظ على ظروف معقمة خلال الثقافة والبذر، وإطعام biochips، 2) حافظ على biochips المصنفة في ظروف المبردة لتصبح جاهزة للاختبار منذ الخلايا RTgill-W1 لن البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة جدا مرة واحدة يتعرضون لدرجات حرارة تتجاوز 25 درجة مئوية، 3) تزن بدقة L-15ex في قارورة وسائل الاعلام مسحوق وقياس دقيق لعينات من المياه لتجنب إنتاج المغلوطة، والتي يمكن أن يكون ناجما عن تحول في الأسمولية من وسائل الإعلام بدلا من سمية عينة، 4) متابعة تعليمات المستخدم على الشاشة ECIS لتشغيل الاختبارات. يقوم البرنامج في القارئ تنبيه المستخدم إذا كان ثنائيochip غير مقبول لاختبار (بناء على قراءات مقاومة الأولية) عند إدخال بيوشيب لأول مرة في القارئ. إذا كانت مستويات مقاومة غير مقبولة للاختبار، فإن البرنامج لا تسمح للمستخدم المضي قدما في الاختبار حتى يتم استخدام بيوشيب الجديد. أسباب قراءات مقاومة غير مقبولة وعادة ما تكون نتيجة لاختلال طفيف من الأقطاب بيوشيب مع دبابيس القارئ ECIS أو تسرب السوائل على طول واحد من حواف الإلتصاق من بيوشيب.
هناك بعض القيود على هذه التكنولوجيا لأن استشعار ECIS فقط تم اختباره مع مياه الشرب وليس مع المياه السطحية. الخلايا RTgill-W1 التي هي على بيوشيب لا يمكن أن يتسامح مع تجميد أو درجات الحرارة كثيرا فوق 25 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن (فترة زمنية يمكن أن يكون من ساعات إلى أيام تعتمد على درجة الحرارة. وbiochips تعمل بشكل أفضل في درجة حرارة تتراوح من المبردة ل درجة حرارة الغرفة 7، وهي جاهزة للاستخدام الفوري، ولكن، والحق بعد أن صemoved من التخزين البارد. وتستخدم المحمولة حاويات التخزين الباردة حاليا من قبل أفراد الجيش في الميدان لإمدادات حساسة للحرارة. هذه الحاويات نفسها يمكن أن تستخدم لنقل بيوشيب المصنف.
حد آخر لهذه التقنية هو أنه على الرغم من أنه هو جهاز استشعار سمية اسع النطاق، فإنه لا تستجيب بشكل جيد، على كل حال، إلى مركبات تثبيط الكولين، مثل بعض المبيدات. ولسد هذه الفجوة في القدرات، تم تصميم جهاز استشعار ECIS لاستخدامها جنبا إلى جنب مع متوفرة تجاريا اختبار فحص المبيدات السريع عند اختبار عينات من المياه من أجل توفير المستخدم مع مجموعة واسعة من اختبار السمية. وهذه المجموعة هي فحص الأنزيمية السريع تهدف إلى الكشف عن الفوسفات العضوي والكرباماتية المبيدات في غضون 30 دقيقة.
أجهزة الاستشعار ECIS يكمل WQAS-PM (نوعية المياه تحليل النظام – الطب الوقائي) نظام اختبار المياه الحقل، الذي يستخدم حاليا من قبل موظفي الطب الوقائي العسكري للكشف أرسينجيم، والرصاص، أو السيانيد في عينة مياه الشرب. على الرغم من أن أجهزة الاستشعار ECIS لا تعرف ما هو ملوث، فإنه سيشير إذا كان بعض المعادن أو المركبات العضوية موجودة، مشيرا إلى أن المياه قد لا تكون صالحة للاستهلاك البشري. تتوفر نتائج الاختبار ECIS داخل ساعة. ويمكن بعد ذلك سيتم ارسال عينات المياه من لمزيد من التحليل لتحديد الملوثات إذا كان هناك نتيجة الاختبار إيجابية.
كما هو موضح أعلاه، تم تصميم القارئ ECIS أن تكون جزءا من النظام الذي يشمل مجموعة ACE الأنزيمية منفصلة من أجل تغطية واسعة للكشف عن الملوثات. يتم تعبئتها كل من هؤلاء القراء في قضية قوي للنقل المجال للاستخدام الميداني من قبل الجنود.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
| Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
| L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
| L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips. |
| PBS, w/o Ca++ or Mg++ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
| Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
| T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
| Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
| 70 % ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
| Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
| GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
| Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
| 20 mL syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
| 0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
| 60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
| Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
| Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
| Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
| ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
| 3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
| Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
| 1 gram silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
| Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
| Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C. | |
| Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
| Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
| Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
| Microcentrifuge tubes, 0.6 mL | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells. |
| Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip. |
| Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip. |
| ½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing. |
| 50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C. |
References
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
- States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
- Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , 1-25 (2008).
- van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
- Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
- Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
- Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
- Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
- O’Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
- Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
- Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
- Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
- Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
- . RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , (2015).
