Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi
Summary
This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
Abstract
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Introduction
Eutherian Gebelikte besin, gaz ve atık ürünlerin değişimi plasenta aracılık eder. Kadın üreme sisteminde, uterin arterler rahim kan ana kanallar vardır. Yerleştirildikten sonra özel gemiler içine bu şube fetoplasental üniteye doğru desidua bazalisin aracılığıyla kangal spiral arterler denir. Çap ve özellikle rahim doğal öldürücü (UNK) hücrelerinde, lökositler çevrili olan bu spiral arterlerin, esnekliği, plasenta 1,2 hacim ve mevcut kan hızını dikte. Spiral arterlerin yeniden bir sonucu olarak doğru hemodinamik değişiklikler gebelik başarısı için kritik öneme sahiptir.
Altında yatan mekanizmalar insan ve fare gebelik arasındaki detaylı farklılık olsa da, her iki türün de yeniden şekillenme sürecinin nihai sonucu kendi düz kas tabakasını kaybeder dilate, yüksek iletkenlik damar olduğunu. Farelerde, Unk (IF interferon hücresinden türetilmişN-) γ yaklaşık orta gebelik 3-5, bu değişiklikler uyarması gereklidir. NK hücreleri veya IFN-γ sinyal yolunun bileşenlerini ya yoksun fareler bu değişiklikleri geçmesi başarısız ve bu fetoplasental üniteye yeterli kan akımının önemini vurgulayarak, azalmış fetal büyüme 6,7 ile ilişkilidir. Erken insan Gebelik sırasında, interstisyel ve endovasküler trofoblast extravillous işgali ve Unk hücreleri ile etkileşimi damar değişiklikleri uyaran ve fetal büyüme 8-10 teşvik etmek için önemlidir. Unk hücreleri, granülosit makrofaj gibi kemokinler ve sitokinler 11 aracılığıyla insan trofoblast invazyonu orkestra olabilir – koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) 12. Sığ trofoblast invazyonu gibi pre-eklampsi 9 olarak azaltılmış arter remodeling ve gebelik komplikasyonları ile ilişkilidir.
Bu protokol önemli açıklanan Anne Croy öncü çalışmalar dayanmaktadırimmunhistokimya ve zarif transfer deneyleri 5,13 ile başarılı vasküler remodeling için bağışıklık sistemi ve özellikle NK-türevli IFN-y rolü. Burada spiral arterlerin yeniden şekillenme durumunu değerlendirmek için hızlı ve ekonomik bir şekilde açıklayın. Bizim laboratuvar rutin orta gebelik (gebelik gününde (gd) 9.5) 14 bu değerlendirmektedir rağmen, yeniden şekillenme süreci gd8.5 12,5 15 arasında yer alır. Otomatik slayt tarayıcıları gelişiyle büyük ölçüde kesimlerinden damar ve lümen alanlarının değerlendirilmesi kolaylaştırmıştır ve bu damar çaplarını ölçmek daha tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak bulundu. SMA immünohistokimyasal tespiti eklenmesi stereolojik değerlendirmesinden elde edilen sonuçların basit bir doğrulama için izin verir. Tüm Stereolojik tekniklerin olduğu gibi, en az iki sınav görevlisi tarafından bir kör deney olarak değerlendirmeyi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Seri kesme, bu amaçla, bir rastgele adımı dahil edilebilirting örnekleri slaytları değerlendiren araştırmacılar örneklerin geldiği deney grubu arasından bilmiyorum ki.
Bu protokolün genel amacı dikkatle gebelikle ilgili komplikasyonlar için fare modelleri bağlamında tanımlanmış anne ve baba genotipleri ile farelerde spiral arterlerin biçimlenme değerlendirmek için güvenilir bir araç sağlamaktır. Sonuçları normal fetal büyüme için gerekli olan bu sürecin Unk hücreleri bağımlılığı stres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokolü başarılı gebelik için gerekli olan damar değişiklikleri değerlendirmek için bir tekrarlanabilir bir yöntem sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu değerlendirme başarısı için kritik doku bölümleri kalitesidir. Her ikisi de doğru güvenilir uterin arterler önemli adımlardır bağlanarak yanı sıra implantasyon sitelerinin gebelik yaşını belirleyen. Vb tespitin zamanında, doku işleme protokolü gibi parametrelerde değişiklikler de sonucu etkileyebilir. Tarafsız bir stereolojik değerlendirme için, her implantasyon sitede gemilerin aynı sayıda ölçmek için önemlidir. Bu implantasyon yeri ve üç kez her implantasyon bölge başına 5 damarları ölçülmesi tavsiye edilir. Bu 15 ölçümün ortalama 5 büyük gemilerin ortalama boyutunu gösterir.
/ – – IL2rg – Daha fazla alymphoid Rag2 verilerine / – fareler Burada gösterilen, biz bu Prot bulunduinhibe NK hücreleri 14 dahil bir vasat maternal bağışıklık fonksiyonunun bir model, bir dizi için yararlı ocol. Arteryel yeniden bozuklukları da bozulmuş trofoblast invazyonu 18 modellerinde gösterilmiştir ve burada tarif edilen teknikler bu durumlarda damar değerlendirmek için yararlı olabilir. Bu optimize edilmiş ve fare orta-gebelikte desidual vasküler yeniden incelenmesi için bu protokolü geçerliliği, fakat diğer model sistemlerinde (örneğin sıçan) ya da diğer organlarda çalışmak için bu protokolü adapte de düşünülebilir. Biz NK-bağımlı biçimlenme sağlam gd9.5 değerlendirilebilir edilebilir bulurken, bu tür anne damar tamamen yenilenmiş olan gd12.5 gibi diğer zaman noktaları için tadil edilebilir. Bu zaman noktasında, trofoblastik istilası 16 daha derin ve bu zaman noktası, damar değişimlerinin trofoblast rolü araştırmalar için daha uygun olabilir. Ek niceliksel okumalar istenirse,Araştırmacılar ayrıca SMA için boyanan kesitler sayısını artırmak ve her implantasyon site içinde kısmen yenilenmiş damarların yüzdesini değerlendirmek olabilir.
Bu protokolün bir sınırlama histolojik muayene açıklayıcı doğasıdır. Fonksiyonel tahliller, ancak, sadece yavaş yavaş (örneğin Doppler ultrasonografi 19 gibi) kullanılabilir hale gelmektedir. Bu teknikler, teknik uzmanlık ve edinme ve ekipmanları korumak için çok daha yüksek masraflar gerektirir, ancak histolojik olarak görülebilir değişikliklerin etkisi için in vivo okuma bir Boyuna sağlama avantajına sahiptir. Tüm stereolojik sınavlar olası bir dezavantajı araştırmacıların öznellik olduğunu. Bu amaçla, bağımsız tüm numuneleri analiz iki bağımsız denetçilerini kullanarak bu sorunu önlemek için yardımcı olabilir. Burada özetlenen protokol fazla kan Fetomaternal arayüzü ulaşabilir nasıl fikir verir iken, bunu compl ile birleştirmek avantajlı olabilirplastik üzerinden damar herhangi bir zamanda kan miktarını değerlendirmek ementary yaklaşımı 16 düşürdü.
Bu protokolün gücü, bağımsız iki yaklaşım birleştirmesidir. Vasküler değişim ilk olarak niceliksel stereology tarafından değerlendirilir ve sonuç daha sonra immünohistokimya kullanılarak nitel doğrulanır. Sonuçların güvenilirliği daha da örnekleri rastgele güçlenmiştir edilebilir. Bu protokol için hazırlanan numuneler de kolayca titizlikle midgestation bir hamilelik fenotip değerlendirmek için, bu tür decidualisation, gebelik (MLAp) veya ilgi hücrelerin İmmuno mesometrial lenfoid agrega gelişme olarak gebeliğin diğer parametreleri incelemek için kullanılabilir.
Arter remodeling kadın ve bu değişikliklerin başarısızlık komplike gebeliklerde önemli bir adımdır harika obstetrik sendromlar (GOS), yani pre-eklampsi, fetal büyüme kısıtlaması ve temelini iseölü doğum. Biz dikkatle GOS patofizyolojisi bazı özelliklerini taklit fare modellerinde bir hamilelik fenotip değerlendirmek için burada teknikleri sunuyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
Materials
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
- Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
- Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
- Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. Deep placentation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).
- Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
- Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
- Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
- Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
- Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
- Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
- Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
- Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).
