Valutazione della materna vascolare rimodellamento durante la gravidanza in utero mouse
Summary
This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
Abstract
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Introduction
Lo scambio di sostanze nutritive, gas e prodotti di scarto durante la gestazione eutherian è mediato dalla placenta. Nel tratto riproduttivo femminile, le arterie uterine sono i principali condotti di sangue verso l'utero. Dopo l'impianto, questi ramo in vasi specializzati chiamati arterie spirali che avvolgono attraverso le basale decidua verso l'unità fetoplacentare. Diametro e l'elasticità di queste arterie spirali, che sono circondate da leucociti, in particolare uterina natural killer (Unk), le cellule, dettare il volume e la velocità di sangue a disposizione alla placenta 1,2. Modificazioni emodinamiche corretti come risultato di rimodellamento delle arterie spirali sono fondamentali per il successo della gravidanza.
Mentre i meccanismi sottostanti differiscono in dettaglio tra umano e murino gravidanza, il risultato finale del processo di rimodellamento in entrambe le specie è dilatato, alta conduttanza vascolare che perde il suo strato di muscolatura liscia. Nei topi, l'interferone Zio derivato dalle cellule (IFN-) γ è necessario per indurre questi cambiamenti a intorno a metà della gestazione 3-5. I topi che mancano sia le cellule NK o componenti della via di segnalazione di IFN-γ non riescono a subire questi cambiamenti e questo è associato ad una ridotta crescita fetale 6,7, sottolineando l'importanza di un adeguato apporto di sangue per l'unità fetoplacentare. Durante la prima gravidanza umana, l'invasione interstiziale ed endovascolare di trofoblasto extravilloso e la loro interazione con le cellule unk sono importanti per indurre alterazioni vascolari e di promuovere la crescita del feto 8-10. Lo Zio cellule possono orchestrare invasione trofoblasto umano attraverso chemochine e citochine 11, come granulociti e macrofagi – fattore stimolante le colonie (GM-CSF) 12. Shallow invasione trofoblasto è associato con ridotte rimodellamento arteriosa e complicazioni durante la gravidanza come la pre-eclampsia 9.
Questo protocollo si basa sul lavoro pionieristico di Anne Croy che ha descritto l'importanteruolo del sistema immunitario e in particolare NK-IFN-γ derivato per il successo rimodellamento vascolare attraverso immunoistochimica e di trasferimento eleganti esperimenti 5,13. Qui si descrive un modo veloce ed economico per valutare lo stato di rimodellamento delle arterie a spirale. Anche se il nostro laboratorio valuta regolarmente presente a metà della gestazione (giorno di gestazione (GD) 9.5) 14, il processo di rimodellamento avviene tra gd8.5 e 12,5 15. L'avvento di scanner per diapositive automatizzati ha notevolmente facilitato la valutazione delle aree nave e lume dalle sezioni e abbiamo trovato che questo è un approccio più riproducibile di misurare i diametri dei vasi. L'aggiunta di rilevazione immunoistochimica di SMA consente una semplice validazione dei risultati ottenuti dalla valutazione stereologica. Come per tutte le tecniche di stereologici, si raccomanda di eseguire la valutazione come un esperimento in cieco da almeno due esaminatori. A tal fine, un passo randomizzazione può essere introdotto quando serialmente tagliareting i campioni in modo che gli investigatori valutare le diapositive non sanno da quale gruppo sperimentale i campioni provengono.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire uno strumento affidabile per valutare attentamente la ristrutturazione delle arterie spirali nei topi con genotipi materni e paterni definiti, nel contesto di modelli murini per le complicazioni legate alla gravidanza. I risultati sottolineano la dipendenza da cellule Zio di questo processo, che è essenziale per la normale crescita fetale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentata è progettato per fornire un metodo riproducibile che per valutare le modifiche vascolari che sono necessarie per gravidanza. Critico per il successo di questa valutazione è la qualità delle sezioni di tessuto. Sia determinare con precisione l'età gestazionale dei siti di impianto, così come affidabile legando le arterie uterine sono passi cruciali. Le variazioni di parametri quali il tempo di fissazione, protocollo tessuto-processing, ecc possono influire sul risultato. Per una valutazione stereologica imparziale, è importante misurare lo stesso numero di navi in ciascun sito di impianto. Si raccomanda di misurare 5 navi per sito di impianto e ogni sito di impianto in triplice copia. La media di queste misurazioni 15 rappresenta la dimensione media delle 5 più grandi vasi.
A seguito dei dati da Rag2 alymphoid – / – IL2RG – / – mice mostrate qui, abbiamo trovato questo protOcol utile per una serie di modelli di inadeguata funzione immunitaria materna, tra cui una delle cellule NK inibiti 14. Difetti di rimodellamento arterioso hanno anche dimostrato in modelli di alterata trofoblasto dell'invasione 18 e le tecniche qui descritte possono essere utili per valutare la vascolarizzazione in questi casi. Abbiamo ottimizzato e validato questo protocollo per la ricerca di deciduali rimodellamento vascolare a metà della gestazione nel topo, ma è anche ipotizzabile, ad adeguare il protocollo di lavorare in altri sistemi modello (ad esempio ratti) o anche in altri organi. Mentre troviamo che il rimodellamento NK-dipendente può essere robustamente valutata a gd9.5, esso può essere modificato per altri momenti, come gd12.5, quando il sistema vascolare materno è completamente ristrutturato. A questo punto di tempo, trofoblasto endovascolare invasione è profondo 16 e questo punto di tempo potrebbe essere più adatto per le indagini del ruolo di trofoblasto per cambiamenti vascolari. Se si desiderano ulteriori letture quantitativi,gli investigatori possono anche aumentare il numero di sezioni colorate per la SMA e valutare la percentuale di navi parzialmente ristrutturato all'interno di ogni sito dell'impianto.
Un limite di questo protocollo è la natura descrittiva degli esami istologici. Saggi funzionali, tuttavia, sono solo lentamente diventando disponibili (come ecocolordoppler 19). Queste tecniche richiedono competenze tecniche e costi molto più elevati per l'acquisizione e la manutenzione delle apparecchiature, ma hanno il vantaggio di fornire una lettura longitudinale in vivo per l'effetto delle variazioni osservabili istologicamente. Un possibile svantaggio di tutti gli esami stereologici è la soggettività degli investigatori. A tal fine, con due esaminatori indipendenti che analizzano tutti i campioni in modo indipendente può contribuire ad evitare questo problema. Mentre il protocollo descritto qui fornisce una visione in quanto sangue può raggiungere l'interfaccia feto-materna, può essere vantaggioso combinare con il complapproccio ementary di valutare la quantità totale di sangue in un dato momento nel sistema vascolare attraverso la plastica getta 16.
La forza di questo protocollo è che combina due approcci indipendenti. Cambiamento vascolare viene prima quantitativamente valutata stereologia e il risultato viene poi convalidato qualitativa, utilizzando l'immunoistochimica. L'affidabilità dei risultati può essere ulteriormente rafforzata dalla randomizzazione dei campioni. I campioni preparati per questo protocollo può essere facilmente utilizzato per studiare anche altri parametri di gravidanza, come decidualisation, lo sviluppo dell'aggregato linfoide mesometrial di gravidanza (MLAP) o immunolocalizzazione di cellule di interesse, di valutare con rigore un fenotipo gravidanza a midgestation.
Rimodellamento arteriosa è un passaggio fondamentale per le gravidanze senza complicazioni nelle donne e il fallimento di questi cambiamenti è alla base delle grandi sindromi ostetriche (GOS), vale a dire pre-eclampsia, restrizione della crescita fetale enati morti. Vi presentiamo qui le tecniche per valutare attentamente un fenotipo gravidanza in modelli murini che imitano alcune caratteristiche della fisiopatologia del GOS.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
Materials
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
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