تقييم الأم الأوعية الدموية إعادة عرض أثناء الحمل في الرحم ماوس
Summary
This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
Abstract
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Introduction
وتوسط في تبادل المواد الغذائية والغازات والنفايات أثناء الحمل eutherian عن طريق المشيمة. في الجهاز التناسلي للأنثى، وشرايين الرحم هي القنوات الرئيسية من الدم إلى الرحم. بعد الزرع، هذه الفروع إلى سفن متخصصة تسمى الشرايين الحلزونية التي فائف من خلال القاعدي الساقط نحو وحدة جنيني مشيمي. قطر ومرونة هذه الشرايين الحلزونية، التي تحيط بها الكريات البيض، وبخاصة القاتلة الطبيعية الرحم (UNK) الخلايا، تملي حجم وسرعة الدم المتاح للالمشيمة 1،2. تغييرات الدورة الدموية الصحيحة نتيجة لإعادة الشرايين الحلزونية هي حاسمة لنجاح الحمل.
في حين أن الآليات الكامنة وراء تختلف في التفاصيل بين الإنسان والحمل الفئران، والنتيجة النهائية لعملية إعادة عرض في كلا النوعين هي المتوسعة، وارتفاع الأوعية الدموية تصرف أن يفقد طبقة من العضلات الملساء. في الفئران، UNK الإنترفيرون الخلايا المشتقة من (IFN-) γ ضروري للحث على هذه التغييرات في حوالي منتصف الحمل 3-5. الفئران التي تفتقر إما خلايا NK أو مكونات IFN-γ يشير مسار تفشل للخضوع لهذه التغييرات وهذا يترافق مع انخفاض 6،7 نمو الجنين، مشددا على أهمية وجود تدفق الدم الكافي إلى وحدة جنيني مشيمي. خلال فترة الحمل البشري في وقت مبكر، وغزو الخلالي واللف من الأرومة الغاذية extravillous وتفاعلها مع الخلايا UNK مهمة لإحداث تغييرات الأوعية الدموية وتعزيز 10/8 نمو الجنين. خلايا UNK يمكن أن تنسق غزو الأرومة الغاذية البشري من خلال كيموكينات 11 والسيتوكينات مثل محببة بلعم – مستعمرة عامل تحفيز (GM-CSF) 12. ويرتبط غزو الأرومة الغاذية الضحلة مع انخفاض إعادة الشرايين ومضاعفات الحمل مثل تسمم الحمل 9.
ويستند هذا البروتوكول على العمل الرائد آن كروي الذي وصف مهمةدور جهاز المناعة، وبخاصة NK المستمدة من IFN-γ لنجاح إعادة الأوعية الدموية من خلال المناعية ونقل التجارب أنيقة 5،13. نحن هنا وصف طريقة سريعة واقتصادية لتقييم حالة إعادة الشرايين الحلزونية. على الرغم من مختبرنا يقيم هذا بشكل روتيني في منتصف الحمل (الحمل اليوم (GD) 9.5) 14، فإن عملية إعادة تجري بين gd8.5 و 12.5 15. ظهور الماسحات الضوئية الشريحة الآلي سهلت كثيرا عملية تقييم المناطق السفينة والتجويف من أقسام ووجدنا أن يكون نهجا أكثر استنساخه من قياس أقطار السفينة. إضافة كشف المناعى من SMA تسمح التحقق من صحة واضحة للنتائج التي تم الحصول عليها من تقييم stereological. كما هو الحال مع جميع التقنيات stereological، فمن المستحسن لأداء تقييم كتجربة أعمى من قبل اثنين على الأقل الممتحنين. تحقيقا لهذه الغاية، ويمكن إدخال خطوة العشوائي عندما اخترق متسلسلتينغ العينات بحيث المحققين تقييم الشرائح لا يعرفون من الذي المجموعة التجريبية العينات تأتي.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير أداة يمكن الاعتماد عليها لتقييم دقيق لإعادة الشرايين الحلزونية في الفئران مع تعريف الأنماط الجينية الأم والأب، في سياق نماذج الماوس لمضاعفات متعلقة بالحمل. النتائج تؤكد الاعتماد على الخلايا UNK من هذه العملية، وهو أمر ضروري لنمو الجنين الطبيعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم بروتوكول المعروضة هنا لتوفير طريقة استنساخه التي يمكن من خلالها تقييم التغيرات الأوعية الدموية والتي هي ضرورية لنجاح الحمل. حاسمة لنجاح هذا التقييم هو نوعية المقاطع الأنسجة. كل من تحديد دقيق لعمر الحمل من المواقع الزرع وكذلك ligating موثوق شرايين الرحم هي خطوات حاسمة. التغييرات في المعلمات مثل وقت التثبيت، وبروتوكول معالجة الأنسجة، وما إلى ذلك قد يؤثر أيضا على النتيجة. لتقييم stereological غير منحازة، فمن المهم لقياس نفس العدد من السفن في كل موقع الزرع. فمن المستحسن لقياس 5 سفن في موقع غرس وزرع كل موقع في ثلاث نسخ. وتعني هذه القياسات 15 يمثل حجم متوسط من أكبر 5 سفن.
وبالإضافة إلى البيانات من Rag2 alymphoid – / – IL2rg – / – الفئران المعروضة هنا، وجدنا هذا البروتوكول الاضافيocol مفيدا لعدد من نماذج عدم كفاية الوظيفة المناعية الأمهات، بما في ذلك واحد من الخلايا تحول دون NK 14. كما تبين وجود عيوب في إعادة الشرايين في نماذج من ضعاف غزو الأرومة الغاذية 18 و الأساليب المذكورة هنا قد تكون مفيدة لتقييم الأوعية الدموية في هذه الحالات. نحن الأمثل والتحقق من صحة هذا البروتوكول للتحقيق في ساقطي إعادة الأوعية الدموية في منتصف الحمل في الماوس، وإنما هو أيضا تصور للتكيف مع هذا البروتوكول للعمل في أنظمة أخرى نموذج (مثل الفئران) أو حتى في غيرها من الأجهزة. في حين نجد أن إعادة NK-تعتمد يمكن تقييمها بقوة في gd9.5، فإنه يجوز تعديل للحصول على نقاط زمنية أخرى مثل gd12.5، عندما يتم تشكيلها الأوعية الدموية الأمهات تماما. عند هذه النقطة الزمن، غزو الأرومة الغاذية اللف هو أعمق 16 و قد تكون هذه النقطة وقت أكثر مناسبة للتحقيق في دور الأرومة الغاذية للتغيرات في الأوعية الدموية. وإذا رغبت قراءات كمية إضافية،يمكن للمحققين أيضا أن يزيد من عدد الأقسام الملون لSMA وتقييم نسبة السفن تشكيلها جزئيا داخل كل موقع الزرع.
وجود قيود على هذا البروتوكول هو طبيعة وصفية الامتحانات النسيجية. المقايسات الفنية، ومع ذلك، يتم فقط أصبحت ببطء المتاحة (مثل دوبلر بالموجات فوق الصوتية 19). هذه التقنيات تتطلب خبرة فنية ونفقات أعلى بكثير للحصول على المعدات وصيانتها، ولكن لديها ميزة توفير طولية في الجسم الحي قراءات لتأثير التغيرات التي يمكن ملاحظتها تشريحيا. والعيب ممكن لجميع الامتحانات stereological هو الذاتية للمحققين. تحقيقا لهذه الغاية، وذلك باستخدام اثنين من الممتحنين مستقل لتحليل جميع العينات بشكل مستقل يمكن أن تساعد على تجنب هذه المشكلة. في حين أن البروتوكول المذكورة هنا يعطي نظرة ثاقبة كيف الكثير من الدماء يمكن أن تصل إلى واجهة الدم الجنيني للأم، قد يكون من المفيد أن الجمع بين ذلك مع مجمعات للنهج ementary تقييم المبلغ الإجمالي من الدم في أي وقت من الأوقات في الأوعية الدموية من خلال البلاستيك يلقي 16.
قوة من هذا البروتوكول هو أنه يجمع بين نهجين مستقلة. وأول تقييم التغيير الأوعية الدموية كميا بواسطة التجسيم ومن ثم يتم التحقق من صحة نتيجة نوعيا باستخدام المناعية. موثوقية النتائج التي يمكن زيادة تعزيز العشوائي للعينات. يمكن بسهولة العينات التي أعدت لهذا البروتوكول أن تستخدم أيضا للتحقيق في غيرها من المعالم الحمل مثل decidualisation والتنمية من مجموع اللمفاوية mesometrial من الحمل (MLAp) أو مناعي من خلايا الفائدة، لتقييم صارم النمط الظاهري الحمل في midgestation.
إعادة الشرياني هو خطوة حاسمة لحالات الحمل غير معقدة في النساء وفشل هذه التغييرات هي أساس المتلازمات كبيرة التوليد (السودانية)، وهي ما قبل تسمم الحمل، وتقييد نمو الجنين وولادة جنين ميت. نقدم هنا تقنيات لتقييم بعناية النمط الظاهري الحمل في نماذج الماوس التي تحاكي بعض خصائص الفيزيولوجيا المرضية لحكومة السودان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
Materials
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
- Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
- Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
- Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. Deep placentation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).
- Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
- Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
- Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
- Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
- Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
- Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
- Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
- Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).
