Samtidig Två-foton<em> In Vivo</em> Avbildning av synaptiska inmatningar och postsynaptiska mål i mus Retrosplenial Cortex
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
Två-foton mikroskopi revolutionerade observation av hjärnans aktivitet i levande och beter djur. Sedan introduktionen 1990 snabbt vunnit popularitet och är nu genomförs som ett av de mest intressanta och innovativa strategier för undersökning av många aspekter av hjärnaktivitet in vivo 1,2. Dessa applikationer inkluderar blodflödesmätningar, neuronal aktivering (t.ex. med hjälp av indikatorer kalcium nivå eller omedelbara tidiga gener uttryck) och morfologi av neuronala celler. Ett ökande antal laboratorier använder två-photon mikroskop för genomförande av tekniken i hela den vetenskapliga världen som en ny standard för in vivo hjärnavbildning.
Standardförfarandet innebär implantation av hjärn fönster (ett runt hål i kraniet täckt med ett täckglas) över tunnan eller syncentrum av mushjärna 3. Nästa, beroende på det experimentella protokollet, MOUSE genomgår en serie av visualisering och beteende träningspass, gör det möjligt att övervaka förändringar i hjärnans aktivitet och neuronal morfologi över tid 4,5. I båda fallen endast kraniotomi påverkar hjässben, utan att passera suturerna. Det är till stor del antas att den huvudsakliga nackdelen med tekniken är dess begränsade tillämpning på lättillgängliga cortexes såsom eldröret eller syncentrum. Implantation av kraniala fönstret över andra regioner utgör en hel del svårigheter, på grund av kraftig blödning och / eller rumsliga hinder.
I detta dokument föreslår vi implantation av kraniala fönstret ovanför retrosplenial cortex (RSC) som en annan möjlig region av intresse för två-foton-in vivo-mikroskopi 6. RSC är en viktig del av hjärnan kretsen med ansvar för fysisk minnesbildning. Anatomiskt är RSC en del av en neuronal nätverk som förbinder kortikala, hippocampus, och talamiska områden 7. Det ärstarkt engagerad i en rad olika beteenden, såsom spatial inlärning och utrotning samt spatial navigering sex.
För att visualisera de morfologiska förändringarna av neuronerna använder vi en transgen mus som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under thy1 promotorn. I dessa möss, är GFP uttrycks i ca 10% av neuronerna i hjärnan som möjliggör tydlig visualisering av de kortikala axoner och dendriter som använder två-foton-mikroskopi 8. En annan nyhet som vi föreslår är injektion av ett rekombinant adenoassocierat virus serotyp 2/1 (rAAV2 / 1) som kodar en röd fluorescerande protein (mCherry) under ett neuronspecifikt CaMKII promotor 9 in i de djupare strukturer i hjärnan som skjuter ut till RSC , såsom hippocampus. Uttrycket av rAAV2 / 1 mCherry i hippocampus hos Thy1-GFP mus möjliggör samtidig visualisering av pre-och postsynaptiska element i Hippocampo-cortical synapser 10. RAAV-drivna uttrycket av mCherry kräver två till tre veckor för proteinet att nå tillräcklig nivå i axonal terminaler. Denna period är förenligt med den vanliga tid som krävs för återhämtning från kraniotomi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det nuvarande papperspresenterar vi ett protokoll för samtidig två-photon in vivo avbildning av synaptiska ingångar och postsynaptiska mål i RSC genom en kraniell fönster. Implanteringsproceduren består av flera viktiga steg. Först djuret djupt sövda och fixeras i den stereotaktiska ramen, då skallen över RSC förtunnas med en borr längs de markerade cirkulära linjer och den cirkulära benet avlägsnas. Efter blödningen stoppas, den rAAV2 / 1 mCherry injiceras i hippocampus, och täckg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka M. Steczkowski för röstinspelningar, M. Borczyk för ritningar, A. Trąbczyńska för virusproduktion, M. Ziókowska för genotypning och A. Mirgos för att få hjälp med att filma. KR erkänner vänlig gåva från det rekombinanta adeno-associerat virus (rAAV) som uttrycker fluorescerande protein mCherry under kontroll av CaMK promotorn från K. Deisseroth. Detta projekt genomfördes vid kärnanläggningar för laboratoriedjurmodeller och Laboratoriet för vävnadsstruktur och funktion, Centrum för neurobiologi, Nencki Institute of Experimental Biology, med användning av CEPT infrastruktur som finansieras av Europeiska unionen – Europeiska regionala utvecklingsfonden inom det operativa programmet "Innovativ ekonomi" för 2007-2013. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00.691 till KR och Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 till RC
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
