신생아 마우스 척수 압축 부상 모델
Summary
This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
Abstract
척수 손상 (SCI)는 일반적으로 특히 척수는 뇌에서 내려 섬유에 손상을 통해 파괴적인 신경 학적 결손이 발생합니다. 연구의 주요 전류 영역은 SCI 다음과 같은 자연 또는 유도 기능 회복의 기초가 적응 가소성의 메커니즘에 초점을 맞추고 있습니다. 자연 기능 회복은 척수가 개발로 어떻게 적응 가소성의 변화에 대한 흥미로운 문제를 제기, 인생에서 더 이른 것으로보고있다. 이 역동적의 조사를 용이하게하기 위해, 우리는 신생 마우스의 SCI 모델을 개발 하였다. 이 모델은 너무 적은 연구되고 소아 SCI에 대한 관련성을 가지고있다. 성인의 신경 가소성은 어린 시절 일에 신경 가소성과 같은 메커니즘의 일부를 포함하기 때문에,이 모델은 잠재적으로 성인 SCI에 대한 일부 관련이있을 수 있습니다. 여기에서 우리는 신생아 마우스에 재현 척수 압축 (SCC) 부상을 생성하는 전체 과정을 설명일찍 출생 후의 (P) 날로 1. SCC가 주어진 척추 수준에서 추궁 절제술을 수행함으로써 달성된다 빠르게 압축 및 척수의 압축을 수정 Yasargil 동맥류 미니 클립을 사용하여 다음과 (여기 흉부 레벨 9-11에서 설명) . 전술 한 바와 같이, 부상 신생 생쥐 행동 결손 시험 또는 전기 생리 학적 및 높은 처리량 광 기록 기술을 사용하여 하나의 시냅스 연결의 생체 생리 학적 분석을 위해 희생 될 수있다. 행동 및 생리 학적 평가를 사용하여 이전 및 지속적인 연구 2 주 이내에 완전한 기능 회복 다음에 사지의 운동의 극적인 급성 손상 및 시냅스 연결 한 내림차순 식별 된 수준에서 기능 회로의 변화의 첫 번째 증거를 증명하고있다.
Introduction
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 P1 마우스의 클립 생성 된 SCC 부상에 대한 절차를 설명한다. 동일한 방법은 후기 단계에서 수행 될 수있다. 압축 부상 P5, P7, P9 및 P12 (Züchner, 등., 준비 원고)에서 성공적으로 수행 하였다. 모든 출생 후의 단계에서, 전신 마취는 순수한 산소에서 기화 이소 플루 란으로 얻을 수 있지만, 마취 결과는 나이에 크게 의존한다. 국소 마취를 프로토콜에 도입되기 전에 P1-P4의 초기 시도에있어서, 그 부족의 진정 및 과다 간의 좁은 투여 효과 창 깊고 장기간 진정을 얻기 어려웠다. 또한, 신생아 동물의 이소 플루 란의 신경 독성 효과에 관한 우려가 27-30 제기되고있다. 이소 플루 란의 조합 깊고 더 안정 마취에서 국소 마취제 부피 바카 인 결과 2-3의 인자에 의한 이소 플루 용량 감소를 허용하면서. anesthe의 종류SIA는 31,32 cryoanesthesia 포함 신생아 설치류 설명되었지만 cryoanesthesia 하나 전위 불편 효율적이고 재현 손상의 발생을 어렵게 할 수 (33,34 검토)의 신경 보호 효과가있다. 바르비 투르 산염 계 마취 인해 성인의 35, 36에 비해 혈청 알부민 및 체지방의 낮은 수준으로 신생아 마우스에서 낮은 효율을 갖는 것으로 간주된다.
매우 침습적 외상성 비록 수술 절차 동안 사망률 설정되면 낮다. 그러나, 운영 마우스의 회복과 생존을 개선하기 위해 특별한주의가 필요한 절차를 수행하는 동안 중요한 단계가 있습니다. 한 가지 중요한 문제는 수술을 살아남을 수있는 가장 좋은 기회를 가질 것입니다 새끼를 선택하는 것입니다. 쓰레기가 크면 개별 새끼의 영양 상태가 변한다. 수술시에 발생하는 불가피한 출혈에 더하여, 동작 새끼는 시간을 소비멀리 어머니에요, 그들은 종종 다음날 아침 전에 우유를 마시지 않는다. 따라서 그것은 이미 위에서 우유의 특정 양이 새끼를 선택할 수있는 장점이다. 이 P0에서 P7에 복부 피부를 통해 쉽게 볼 수 있습니다.
첫 번째 밤 동안 운영 강아지는 어머니에 의해 잠식되는 큰 위험에 있습니다. 더 조작 쥐의 절반 이상이 모델의 초기 개발 과정 케이지 혈액의 명확한 징후, 다음 아침에 실종되었다. 설치류에서 Necrophagy, 식인 풍습과 영아 살해는 수십 년 37-40에 대한 연구되어왔다. 본 연구에서는 식인 풍습은 한 번만 목격했지만, 케이지에 반환 된 새끼가 밤 동안 자연적인 원인에 의한 사망이 불가능한 듯 같은 좋은 형태로 일반적으로 있었기 때문에 necrophagy보다 더 그럴듯한 설명으로 간주되었다. 이 불안과 공격성 나 감소 등 디아제팜으로 가역적 약학 제를 사용하는 아이디어를 프롬프트N ((41)에 의해 검토) 어머니. 다이아 제팜의 복강 내 주사는 크게 20 % 미만에 60 % 이상에서 첫 밤 사망률을 떨어 뜨리고, 상황을 개선.
수술 후 복귀를 다음 컬링 가능한 쓰레기가 적게 방해에 의해 쓰레기 크기 축소 조작 된 동물을 혜택을 누릴 수 있습니다 추가 요소입니다. 그러나 어머니 만 작동 새끼를 떠나는 것은 도움이되지 않습니다. / 운영 작동이되지 않는 새끼의 최적의 균형 라인에 따라 다양하지만, 3-4 작동이되지 않는 새끼와 함께 4-5 운영 새끼 (부상 또는 가짜)를 떠나 ICR 및 SCID-ICR 마우스에 가장 적합한 결과를 제공 할 수 있습니다.
일반적인 의미에서,이 신생아 SCI 모델의 주요 한계는 신생아 척수 성인 SCI 모델로부터 얻어진 것과 비교할 실험 결과를 제공 할 수있다, 따라서 성인 척수에서 많은 점에서 상이하고 있다는 것이다. 이러한 차이는 전체 크기를 포함척수의 부피, 세포 수, 언더 표현 같은 희소 돌기 아교 세포, 미성숙 면역 반응 미성숙 신경 회로와 같은 특정 세포 유형. 이 모델 실험에서 도출 결론 따라서 신중하게 고려되어야한다. 한편,이 모델은 소아 SCI의 상대적 조사 시나리오에 적합하다. 또한, 성인 SCI 모델에 대하여 명백한 약점은 복원 경우 성인 척수 최소 남아 있지만 치료 기질을 나타낼 수 소성 메커니즘의 해명 할 수 있으므로 잠재적 강도도이다. 신생아 또는 배아 상태의 회복이 덜 개발 된 세포 나 조직의 이식을 통해 이전의 발달 특성 성인 조직을 낳다 시약 치료에 의해 구현 될 수 있다고 생각할 수있다. perineuronal 그물을 제거하는 효소를 사용하여 42, 43 후자의 방법의 일례이다.
<p class="jove_content"> SCI에 대한 동물 모델을 확립하는 중요한 문제는 표준화 부상을 얻는 것이다. 이것은 다수의 SCI 모델에서 해결 된 예는, 절개가, 반 절단은, impactors, 장치에 영향을 미치지에 대하여 등 풍선 압축, 집게 호감, 정적 무게 압축,이 방향으로 노력에서 SCI 모델 초래 한 중요한 측면이다 ((44)에 의해 검토) 등의 속도, 힘과 시간 등의 영향 여러 매개 변수를 조작 할 수있는 성인 설치류. 또 다른 방법은, 더 적은 장비를 포함하는, 커 -로 히드 동맥류 클립 (45,46)의 변형을 이용한다. 충돌체 클립을 모방 동시 허혈 어느 정도의와 압축 부상 반면 타박상 부상을 모방 이러한 두 방식은 상호 보완 적이다. 때문에 상당한 크기 제약 및 신생아 생쥐보다 취약성, 높은 사망률이 길어 수술뿐만 아니라 (STABLE)의 비용과 연관된소규모 설비 도상국이를 임팩터 생성 타박상 방식보다는 클립 생성 압축을 개발하기 위해 선택되었다. 이 신생 쥐 1의 척주의 크기를 수용하기 위해 시판 동맥류 미니 클립을 채택함으로써 달성되었다. 스토퍼를 추가하는 것은 표준 압축 폭을 보장하고 긴 클립의 장력이 상기 스토퍼의 한계까지 압축으로 최소 폭의 고정 단계에서 압축의 힘이 약간 다를 것이다. 이 수명을 통해 클립 장력의 변화에 따라 달라질 수 있기 때문에 무엇 표준화되지 않은 것은, 동적 단계에서 압축의 속도입니다. 압축의 정적 위상 동적 위상보다 더 오래 지속되고 척수 조직 미니 클립 블레이드 대하여 반력 많이 미치는 것을 제안 거의 존재하므로, 그 부상의 정도가 가장 의존하는 것으로 보인다 정적 단계입니다. 그러나, 이것은 실험 일이다. 해심각도 정적 압축력 및 지속 시간, 압축 및 압축 해제의 속도, 미니 클립의 위치와 동일한 위치에서 수행되는 압축의 개수 등 다양한 요인에 의존 할 가능성이 높다. 따라서, 이러한 매개 변수의 조합 변화는 약한에서 심각한 부상의 심각도의 스펙트럼의 발생 될 수 있습니다. 변화의 가능성에도 불구하고, 우리의 이전에 게시 된 연구 1에서 우리는 조직 학적, 생리 학적 및 행동 수준에서 일관된 결과를 얻을 수 있으므로 허용 표준화 달성하기 어려운 제안 거의가있다. 우리는 연구에서 우리는도 5에 도시 된 바와 같이 공기 스테핑 같은 행동 검사를 포함한 각 레벨에서 검증을 여러 방법을 사용했다.이 신생아 SCI 모델에서 부상이 축삭의 일정 비율을 예비하여 재 modelin을 통해 적응 가소성을 유도하기위한 유리한 상황을 제공합니다스페어 연결 g 및 새로운 회로의 형성. 신생아 마우스가 아니라 많은 실험적인 방법으로 조사에 적합하기 때문에 또한, 행동 검사, 역행 및 선행 성 축삭 추적, 면역 조직 화학, 전기 생리학 및 높은 포함하는 통합적인 접근 방식과 기능 회복 및 적응 가소성을 연구하기 위해이 모델을 사용하는 것이 가능하다 -throughput 광 기록 1. 예를 들어, 우리는 생체 wholemount 뇌간의 제제 및 손상된 척수 1 높은 처리량 칼슘 이미징을 사용하여 특정 하강 입력의 레벨에서 네트워크 재 모델링을 설명이 통합 접근법을 이용했다. 이것은 척수 뉴런의 특정 개체군 중 시냅스 연결의 재 형성을 평가하기 위해 신경 optogenetic 및 optogenetic 약학 도구를 사용하여 상기 가압 할 수있다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Materials
| Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
| Plastic petri dish (150x25mm) | |||
| Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
| Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
| Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
| Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
| Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
| Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
| Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
| Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
| Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
| Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
| Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
| Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
| Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
| Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
| Pedamix | Fresenius Kabi | ||
| Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |
References
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