Quantificare Pesce Nuoto Comportamento in risposta all'esposizione acuta acquosa di rame utilizzando Computer Assisted Video e Digital Image Analysis
Summary
Misurare l'impatto dei contaminanti ambientali sul comportamento del pesce è spesso soggettiva e impegnativo soprattutto quando si tratta di endpoint subletali. Descriviamo metodi tra cui la tecnologia video per quantificare il comportamento di nuoto della vita fase iniziale bianco storione (Acipenser transmontanus) durante e dopo 96 ore esposizioni acute a varie concentrazioni di rame.
Abstract
Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.
Introduction
Capire come l'esposizione contaminante può influenzare il comportamento a volte è molto difficile e soggettiva. Comportamento è tipicamente definito come una serie di attività palesi, osservabili, corpo intero che operano attraverso il sistema nervoso centrale e consentono un organismo di sopravvivere, crescere e riprodursi. Cambiamenti nel comportamento a causa di esposizione a una sostanza tossica sono tra gli indicatori più sensibili di stress ambientale spesso tra 10-100 volte più sensibile rispetto alla sopravvivenza 1. La maggior parte di questi studi ha esaminato il nuoto attività, ventilazione e del comportamento alimentare di 2,3,4 pesci. Nuoto attività è la più utilizzata endpoint subletali determinare un cambiamento comportamentale in risposta ad un contaminante nel test di tossicità 5. variabili nuoto includono la frequenza e la durata del movimento, la velocità e la distanza percorsa, la frequenza e l'angolo di giri, la posizione nella colonna d'acqua e il modello di nuoto. Il nuoto è l'attivitàuna misura efficace di comportamento di nuoto nel valutare la sensibilità di una sostanza tossica sulla base dei criteri proposti nel capitolo 9 da Rand 6 nei fondamenti del libro di Aquatic Toxicology.
Questo documento presenta uno studio tossicologico come un esempio di come la tossicità del rame di storione bianco presto la vita allo stadio (Acipenser transmontanus) nelle varie fasi di sviluppo precoce in acqua solo esposizioni relative al storione comportamento di nuoto è stato valutato e illustra i metodi per quantificare il nuoto comportamento.
In studi precedenti, le risposte comportamentali avversi sono stati evidenti con esordio precoce durante i primi giorni di esposizioni acute e croniche di rame e sono diventati progressivamente più grave lungo la durata dell'esposizione e 7,8,9 concentrazione. L'entità e la tempistica di insorgenza di queste risposte comportamentali sono suscettibili sufficienti a limitare la sopravvivenza a lungo termine e quindi sono fonte di preoccupazione date le implicazioni per recruitment fallimento 10. Per interpretare accuratamente il significato di questa sensibilità ai metodi e procedure esposizione metallici sono stati sviluppati per quantificare l'andamento temporale e l'entità di disturbi comportamentali relativi alle concentrazioni di rame.
protocolli di test per la funzione del comportamento e lo sviluppo sono stati stabiliti analizzando campioni di video generali di storione in camere di esposizione. I video campioni forniti valutazione qualitativa di sviluppo e di funzione tra i trattamenti di rame durante il periodo di esposizione. Comportamento e riparo in cerca di attività sono state valutate durante le esposizioni a concentrazioni di rame acquose per determinare il tempo necessario per effettuare e per caratterizzare la sequenza temporale di deterioramento che colpisce in cerca di rifugio, letargia, il nuoto coordinazione, equilibrio, e la respirazione. Inoltre, registrazioni video sono state fatte di storione subsampled da ciascuna replica allo scopo di documentare quantitativamente acti nuoto spontaneavità. Questi endpoint inclusi misure di durata o il tempo trascorso in movimento, il nuoto la velocità e la distanza percorsa 5,11 utilizzando un pacchetto software per l'analisi di immagini digitali disponibili in commercio. Questo software definisce il contorno di ciascuna immagine all'interno di un campo di vista e da questa, definisce il centroide per ogni immagine. Il software quindi in grado di monitorare la posizione di ciascun baricentro in un fotogramma per fotogramma successione per determinare i percorsi di movimento.
Questo studio ha rispettato tutte le sezioni applicabili delle Regole Definitive dei regolamenti Animal Welfare Act (9 CFR) e con tutte le linee guida istituzionali per il trattamento umano degli organismi di prova durante la coltura e la sperimentazione. Al termine dello studio, tutti i pesci sono stati eutanasia secondo le linee guida appropriate, come approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso di animali per la US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cambiamenti nel comportamento a causa di esposizione a un contaminante sono spesso utilizzati come endpoint per la tossicità sub-letali, ma possono essere difficili da misurare. In generale, le risposte comportamentali sono misurati con osservazioni visive e analisi manuale dei dati che richiede un sacco di tempo per elaborare. Tuttavia, con l'avanzare della tecnologia, i metodi per quantificare l'attività di nuoto si sono concentrati sull'utilizzo di videografia 18 e analisi del movimento o il software di monitoraggio digitale che riduce il tempo di elaborazione e di analisi. Durante l'analisi del video catturato dati, quantificare le variabili di nuoto manualmente sarebbe stato molto tempo quindi l'uso di registrazioni di dati video e software di monitoraggio pesce fornito un modo più efficace ed efficiente per analizzare il comportamento di storione nuoto. Anche se la procedura ha evidenziato il nuoto comportamento di un pesce, la personalizzazione di altri organismi come anfibi e invertebrati acquatici richiederebbero semplici modifiche. A seconda di cosa Punto finale comportamentalets sono affrontati, sistemi di progettazione e di telecamere sperimentali possono essere sviluppate per l'utilizzo con qualsiasi pacchetto software di monitoraggio disponibile in commercio.
Il metodo è dimostrata utilizzando rame disciolto, ma è applicabile ad altri contaminanti o caratteristiche come la temperatura o il contenuto di ossigeno acquosi. I protocolli sviluppati e presentati in questo documento utilizzato un semplice videocamera digitale come dispositivo di registrazione. I file digitali possono essere facilmente trasferiti su un computer e caricati al software di analisi del movimento. I metodi sono costantemente modificato e perfezionato per semplificare il processo di quantificazione. È indispensabile che la qualità video sia in alta definizione in modo che il software di analisi per identificare ogni singolo pesce per il monitoraggio. Qualsiasi sfondo che non contrasta con il pesce può causare problemi quando si cerca di elaborare i file di dati. Un altro problema comune con due video tracking tridimensionale è individui che identificanoquando i percorsi si incrociano nuoto. Questo può essere corretto manualmente identificando ogni pesce durante la traversata percorso e che collega i segmenti di percorso all'interno del software. In alternativa, l'attività totale può essere determinata da ciascuna camera di replica come media gruppo. Diverse camere individuali con ognuno contenente un pesce possono essere girati nello stesso campo visivo per calcolare i movimenti di singoli pesci.
Attualmente abbiamo aggiornato per utilizzare una serie di telecamere di sorveglianza in testa sopra le camere di esposizione che sono collegati a un dispositivo di registrazione video digitale ad alta definizione (HD-DVR). Tuttavia, l'uso di qualsiasi sistema di telecamere in grado di registrare ad alta definizione MPEG-4 video funzionerà. L'HD-DVR può essere impostato per registrare in un momento specifico e programmato per un massimo di 7 giorni. Questo hands-off approccio automatizzato permette la cattura di diversi video contemporaneamente di mantenere la coerenza minimizzando disturbi esterni che potrebbero compromettere comportamento dei pesci. Il siste HD-DVRms sono collegati ad una rete interna così il trasferimento di file è relativamente semplice. Mentre il sistema di telecamere automatizzato è una tecnica molto migliorata per quantificare il comportamento di nuoto, è ancora utile per effettuare osservazioni visive per servire come informazioni di supporto aggiuntive per documentare deterioramento del comportamento durante i test di tossicità.
C'è una lunga storia della letteratura che documentano il comportamento dei pesci alterato derivante dall'esposizione a metalli risalenti ai primi anni del 1960 19,20,21. Il rame ha dimostrato di causare cambiamenti nei livelli di attività, come ipoattività a persico sole 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) e le variazioni delle locomotoria e l'attività di alimentazione della trota di ruscello 23 (Salvelinus fontinalis). Almeno alcuni novellame contare sul loro senso dell'olfatto per rilevare ed evitare i predatori, e rame-indotta chemosensory privazione può avere un impatto comportamenti legati al rilevamento di sostanze chimiche di allarme 24,25,26 </sup>. L'epitelio olfattivo è danneggiata a causa di esposizione di rame che ciò pregiudichi meccanismi sensoriali che potrebbe tradursi in disorientamento, evitamento del comportamento, l'alimentazione ridotta e tutti gli altri comportamenti che sono guidate da all'olfatto 27. Questi comportamenti alterati erano coerenti con quanto osservato durante le esposizioni.
Il comportamento di nuoto di storione bianco è stato notevolmente influenzato durante l'esposizione subletale a concentrazioni di rame acquose .. Questi risultati illustrano come il comportamento è influenzato a concentrazioni subletali di rame e può essere usata come indicatore di stress tossici. L'analisi basato il video si è rivelato efficace nel quantificare il comportamento di nuoto e serviva anche come qualitativa documentazione visiva dei gravi impatti sulla storione esposti al rame. Il software di analisi è anche in grado di quantificare altri vari endpoint comportamentali. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 per una lista. Il sistema di esposizione può essere modificato per indirizzare ciascun endpointmodalità in tempo reale e può essere utilizzato per quantificare le differenze di comportamento associato all'esposizione a vari contaminanti di interesse.
L'uso di endpoint di comportamento nella ricerca tossicologica acquatico è sempre più impiegato e dovrebbe essere considerato al momento di valutare gli effetti dei contaminanti perché la funzione del comportamento adattivo è cruciale nella determinazione del danno ambientale 9. Gli impatti dei contaminanti ambientali per il comportamento dei pesci è spesso soggettiva e impegnativo soprattutto quando si tratta di endpoint subletali in assenza di metodi standard ..
Nuoto attività quantificato utilizzando questi metodi possono essere rigorosamente monitorati, è non distruttivo con il minimo stress per l'organismo e può essere ripetuto. Nuoto comportamento è un indice valido e coerente di tossicità subletale che dovrebbe essere incorporato in protocolli di prova ad ampliare la sensibilità dei test di tossicità standard di 5.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the staff in the Ecology Branch, Toxicology Branch and Environmental Chemistry Branch of the U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center for technical and analytical assistance. Funding provided in part by Teck American Incorporated through an agreement with the US Environmental Protection Agency (USEPA) Region 10 with funds provided by USEPA to US Geological Survey (USGS) through the Department of Interior Central Hazmat Fund.
Materials
| copper II sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | contaminant of concern | |
| syringe dispenser | Hamilton MicroLab 600 Series | apparatus to spike chemical | |
| 2-L volumetric flask | container for holding stock solution | ||
| 24-1.5 L glass jars | test chamber for 2 dph sturgeon | ||
| video camera | Sony Handycam HDR-CX550V | ||
| digital tracking software | Noldus Ethovision | ||
| 3-17" flat screen monitors | |||
| 24 surveillance cameras | Model CL101 | ||
| 3-16 channel digital recording devices | |||
| DO meter | YSI | ||
| pH meter | Orion 940 | ||
| ph probe | Orion | ||
| ammonia meter | |||
| ammonia probe | Orion | ||
| chiller unit | |||
| recirculating water pump |
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