כוונון טור מקוטע זרימה מקבילה והפעלת איתור Multiplexed
Summary
Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.
Abstract
Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.
Introduction
עמודות זרימת טכנולוגיה פעילה
עמודות כרומטוגרפיה טכנולוגית זרימה פעילה (AFT) פותחו לאחרונה להתגבר חוסר יעילות בהפרדות הקשורים זרימת ההטרוגניות 1-6 וגם כדי לאפשר זיהוי מרובב. בפירוט שתקשורת מסוים זה התהליך התפעולי של המקביל מפולח זרימת טור (PSF) עם זיהוי מרובב. היתרונות הפונקציונליים המפתח של טור כוחות הביטחון הפלסטיניים הם: (1) התזרים מאזור המרכז הרדיאלי של מיטת העמודה מבודד מאזור הפריפריה או קיר של זרימה, (2) הנפח של שלב נייד שחייבים להיות מעובד על ידי זיהוי מקור מצטמצם, וניתן multiplexed מקורות (3) זיהוי להרחיב מידע מדגם ללא הקניית עיכובי זיהוי פני כל תהליך זיהוי, או לאחר מכן מחייבים את הפיצול של זרימת זרם פוסט עמודת 7,8. התכונה המרכזית בעיצוב של עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים, המאפשרת לdvantage של זיהוי מרובב היא ההרכבה הראויה וfrit לשקע רומן. איור 1 הוא תצלום של טור AFT בהשוואה לטור קונבנציונלי. חשוב להבין כי תהליך הפיצול הושג באמצעות זרימה מפולחת עמודות מקבילות הוא לא אותו הדבר כמו פיצול זרימת הודעה טור זרם. בזרימה הודעה טור זרם לפצל את הלהקה כולה מדגם מהמוביל הקצה לגפיים של הזנב נדגם באותה מידה (כלומר, צירי), ובכך, כל תזרים זרם שווה ביחס ליעילות ורגישות; סדר הגודל של הרגישות ובכך הם מחולקים במספר הפיצולים. בכוחות הביטחון הפלסטיניים, לעומת זאת, דגימות תהליך פיצול הלהקה רדיאלית, לא צירי. ככזה, הדגימות המרכזיות נמל שיא השיא – האזור מרוכז ביותר של השיא. לפיכך, הרגישות כאן היא גבוהה ביותר כשיא אינו מדולל על ידי האזור המפוזר עוקב. מדגם משחררי מהנמלים ההיקפיים הוא לא יעיל כמו בCENTRAאזור l, אבל, מאז הלהקה נדגם רדיאלית, ולא צירי, הרוחב של השיא הוא צר יותר יהיה המקרה לתהליך דגימה שחלק השיא בכיוון הצירי, כלומר, פיצול הודעה עמודה. מכאן הרגישות עם גלאים תלויים ריכוז לא מצטמצמת.
בעמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים, ראוי לשקע כולל יציאות יציאה מרובות ועל החלק הפנימי של סוף זה מתאים לשם שוכן frit טבעתי. החלק הפנימי של ערוצי frit טבעתיים זה לזרום החוצה מהטור דרך יציאת השקע המרכזית רדיאלי, ואילו החלק החיצוני של רדיאלי ערוצי frit לשקע לזרום החוצה של העמודה באמצעות הזרימה לשקע יציאות היקפי או קיר אזור. החלקים הפנימיים וחיצוניים של frit לשקע מופרדים על ידי מחסום בלתי חדיר המונע זרימה צולבת בין זרימת האזורים אלה 2. כתוצאה מעיצוב זה זרימת רדיאלי הזרם המרכזי במיטת העמודה מופרד מזרימת תוספות קיר האזורהחביא את הטור. החלק היחסי של זרימה משני אזורים אלה יכול להיות מגוון כמעט לכל יחס רצוי באמצעות ניהול לחץ כדי לייעל את ההיבטים שונים פונקציונליים של טכנולוגית העמודה, כגון יעילות הפרדה או רגישות זיהוי. במהותה, העיצוב הזה ביעילות קובע במסגרת טור הפורמט הגדול עמודה "וירטואלית", שקוטר פנימי צר, ולכן פונקציות טור כעמודת קיר-פחות נכונה, להתגבר על ההטרוגניות מיטת טור וקיר ההשפעות 9,10.
היתרונות העיקריים של כוחות הביטחון הפלסטיניים עמודות שיפורים ביעילות טור, מזעור עיבוד הממס למקור זיהוי (ים) ומאפשר זיהוי מרובב. עם זאת, יתרון נוסף הוא שמאז tailing והאזורים בחזית של כל להקה יוסרו מelution הכולל פרופיל המומס בelution או זיהוי נמצא בריכוז גבוה יותר מאשר היה להיות שנצפה לאותו יםolute הזרקה ועומס ריכוז על עמודה קונבנציונלית, בהתאם ליחס הפילוח המועסק. כתוצאה מכך יש הוא נצפה לעתים קרובות רווח בעוצמת אות להפרדות שנערכו בטורי כוחות הביטחון הפלסטיניים 2. למעשה, אם יחס הפילוח מותאם כך שעל 25% מתזרים יציאות מכל אחת מארבע יציאות היציאה, עוצמת האות שנצפתה באמצעות זיהוי Ultra-סגולה (UV) מראה כמעט זהה עוצמת האות המדויקת כלכאורה באמצעות קונבנציונלי טור שבו כל (100%) של השלב הנייד מנותח 7. יתר על כן, כוונון עדין של היחס בין שקע זרימת האזורים המרכזיים וקיר מאפשר את יעילות הטור להיות מותאמת. הרווחים ביעילות טור נצפו באמצעות עמודות AFT לא ניתן לומר לערך יחיד, מאז רווחים יעילות אלה הם פונקציה של שלושה גורמים: (1) קצב הזרימה, (2) יחס הפילוח, ו- (3) גורם השימור המומס . עם זאת, עלייה ביעילות בהשוואה למרהעמודות entional כמעט תמיד הם נצפו, ולפעמים רווחים אלה במספר הצלחות התיאורטיות 1,2 יותר מ -100%. היכולת לכוון את יחס הפילוח מאפשר למטפל להתאים את הקוטר של הטור "הווירטואלי" ביעילות, ואת זה הוא גורם חשוב ביחס לתהליך זיהוי. לדוגמא, קוטר עמודה וירטואלית 2.1 מ"מ פנימית (ID) הוקמה מעמודת id 4.6 מ"מ פיזי כאשר יחס הפילוח הוא 21% משלב נייד משחררי מנמל היציאה המרכזי רדיאלי. בתנאים אלה, עמודת id 2.1 מ"מ הווירטואלי מבצעת עם יעילות שעשויה להיות יותר מ -70% יותר מעמודת id 2.1 מ"מ הקונבנציונלי, בהתאם לקצב זרימה, וגורם שימור מומס 10.
עיצוב עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים הנוכחי המשמש לגילוי ריבוב משלב 4 יציאות לשקע מתאימות, אבל הטור יכול להיות מצויד עם 2 יציאות מתאימות גם הסוף, עם זאת, זה לא מגביל את זיהויo רק שני גלאים. הפעולה הבסיסית של עמודות אלה, עם זאת, אותו, מלבד יכולים להיות יחד כי ארבעת גלאים במקביל לטור כוחות הביטחון הפלסטיניים שקע 4 יציאות הרחבת ההיקף לאיתור מרובב. מלבד צינורות חיבור טור לפני ואחרי, הדרישות נוספות רק לפעול עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים הוא צינור שיכול להיות מחובר ליציאות לשקע ההיקפיים, ואמצעים שבם הסכום של שלב נייד עובר צינור אחד ניתן למדוד, בדרך כלל גם מדידת מסה או מדידת נפח. על מנת להקל על כוונון, הקוטר הפנימי של כל הזרימה לשקע צינורות צריך להיות זהה. זרימת היחס בין יציאות יציאה המרכזיות ההיקפית ורדיאלי אז מגוון באמצעות ניהול לחץ, פשוט על ידי שינוי האורך של הצינור ממוקם בשקע ההיקפי המתאים, או האורך של הודעה צינורות גלאי בפתח היציאה המרכזית רדיאלי.
מרובב איתור שימוש בעמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים </strong>
יתרון חשוב של עמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים הוא שכל אחד מנמלי יציאת השקע יכול להיות מחובר למקור איתור ישירות, ובכך לאפשר זיהוי מרובב. במערכת איתור מעוצבת היטב ניתוח יחיד עם זיהוי מרובב יכול לספק מידע משמעותי בכל הקשור לטבע של הרכיבים בתוך המדגם. חשוב לציין, ניתן לבצע בדיקות הרסניות ולא הרסניות בדיוק באותו הזמן, ללא דיחוי זיהוי. זה מאפשר הקצאה המוחלטת של, למשל, נוגדי חמצון באמצעות מגיב DPPH •, עם רכיבים שנצפו לelute עם UV ו / או תגובות זיהוי ספקטרוסקופיית מסות (MS) 7,11. לכן, יכולים להיות מופעלים על ארבעה גלאים עצמאיים בו זמנית עם חלקים מתאימים של זרימה מופנים לכל גלאי באמצעות כל אחת מארבע היציאות לשקע. מאז את הזרימה דרך יציאות אלה יכול להיות מותאמות כמות מומסת להגיע כל הגלאים בקלות יכולה להיות מותאם לחליפההרגישות של מקור הגלאי נתון. יש לציין, עם זאת, כי ההגירה מומסת היעילה ביותר שנצפתה דרך פתח היציאה המרכזית רדיאלי. כל אחד מהנמלים ההיקפיים מציע יעילות הפרדה שווה ערך, שכאשר נקבעו ל- 25% בכל יציאה, היא רק מעט פחות יעיל מאשר טור קונבנציונלי. ככזה, חשוב שהגלאים כמותיים להיות מוגדרים לנתח דגימה מנמל היציאה המרכזית רדיאלי.
בעת הגדרת עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים לצורך זיהוי ריבוב יש מספר השיקולים שצריכים להיעשות כדי להשיג תוצאות יעילה ואיכותיות; שממדי צינור לכל יציאה, בחירה של שיציאה לסוג של גלאי וזרימת התאמה.
מימדי צינור לכל יציאה
בכרומטוגרפיה האורך של צינורות הודעה עמודה ממלא תפקיד מכריע ביעילות וביצועים של ההפרדה. DEA הגדולד-נפח כתוצאה מצינורות id ארוכים או רחבים משקע עמודה לגלאים יגרום להפסד של יעילות, רזולוציה ורגישות. כך, ממדי צינורות מתאימים חייבים להיות מנוצלים בעת הגדרת עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים כדי להשיג את הפוטנציאל המרבי במתן הפרדה יעילה תוך מתן היתרונות של ריבוב.
נמל לגלאים
איור 2 הוא דוגמה להתקנת דוגמא של גילוי ריבוב (ויולט-גלוי Ultra (U-Vis), ספקטרומטר המסה (MS) ו2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) זיהוי). האיור מציג את הנמל המרכזי מחובר לגלאי MS, ואילו • DPPH וגלאי UV-Vis מחוברים ליציאות ההיקפיים. מאז MS הוא הגלאי רגיש ביותר של שלוש, תזרום לגלאי זה הופנה מנמל היציאה המרכזי. כגילוי DPPH • הוא סלקטיבית לpresencדואר של נוגדי חמצון, ורגיש לפחות וסובלני ביותר להרחבת להקה, תזרום לגלאי זה הופנה מנמל היקפי. UV-Vis היה גלאי 'גנריות "משניים, כך יזרום לגלאי זה הופנה מנמל היקפי שני.
זרימת התאמה
ברגע שהצינור המתאים כבר מחובר מיציאה לגלאי, זרימת יציאה מכל אחד מהגלאים יכולה להיות מותאמת לסכום הנדרש. דרך פשוטה למדוד את כמות זרימת יציאה מכל גלאי היא לשקול את הסכום של שלב נייד שelutes דרך כל יציאה על תקופת זמן נתונה. זרימת אחוז ובכך ניתן לקבוע, ויכולים להיות מותאם זרימת היחסים או על ידי קיצור או הארכת צינורות המחוברים לקו לשקע בגלאים בהתאם כדי שיתאים לדרישות של הגלאים של בחירה. יש גלאים שונים יש דרישות שונים של זרימה, למשל, תא הזרימה שלגלאי הקרינה (FLD) אינו קצב הזרימה מוגבל, אך יש להקפיד להימנע על-שמירת לחץ של תא הזרימה. מכאן השליטה של זרימה דרך FLD בדרך כלל השיגה על ידי התאמת הירידה בלחץ על פני הגלאים האחרים ואת יתרת הזרימה אז עוברת דרך FLD. גלאי שרגיש לכמות הזרימה שמועברת הוא הטרשת הנפוצה. בדרך כלל, ספקטרומטרים המוניים סוף גבוה הנוכחיים יכולים בקלות לעבד סביב 1 עד 1.5 מיליליטר / דקה של שלב המימי בינוני נייד. מעל קצב זרימה זו, הצפה של המקור עלולה להפוך את MS שמיש. עם זאת, רגישות זיהוי ברוב ספקטרומטרים מסה נהנתה באמצעות ספיקות נמוכות יותר; ומכאן יכולות פיצול זרימת כוחות הביטחון הפלסטיניים הן מאוד שימושיות עבור יישומים הכוללים איתור טרשת נפוצה. יכולות להיות מנוצלת עמודה גבוהה ספיקות נפח, אבל עם המון נפח נמוך הועברו לגלאי MS. כוונון הזרימה לגלאי MS, לעומת זאת, חייבת להתבצע על ידי התאמת הירידה בלחץ לפניגלאי MS, MS ולא הודעה. כאן, השימוש בצינורות צרים נשא (id 0.1 מ"מ) הוא מאוד שימושי, כמו הלחץ יכול להיות מותאם בקלות מבלי להוסיף נפח מת שאינו הולם.
בהתאם לסוג של גלאי ההתאמה של יחס הפילוח ניתן לעשות גלאי או לפני או אחרי. אם גלאי אינו הרסני, כגון משמש UV-Vis, זרימת אחוז יהיה מדוד ומכוון פוסט גלאי. אם גלאי הרסני אחת משמש בקומפלקס להגדיר את זרימת אחוז נקבע על ידי החישוב לאחור ביחס לזרימת נמל האחוזים אחרים. אם גלאי מבוסס מגיב משמש כגון DPPH •, זרימת אחוז נמדד הודעה גלאי ללא התוספת של מגיב; ואם שניים או יותר הרסני גלאים משמשים, אז זרימת היחס נמדד מראש גלאי. איתור מערכות שעשויות לדרוש מכשור נוסף, DPPH • כאמור, יהיה לחץ מערכת נוסף שעשויות לשנות את הזרימהאחוז מצורף פעם אחת למערכת האיתור. לכן, שיקול דעת צריכה להיות משולם על לחץ במערכת של גלאים הרסניים, מראש גלאי בעת כוונון זרימת אחוז. ללא קשר ליחס הזרימה שמוגדר דרך כל היציאות, יש לקבל מידע כמותי באמצעות תקינה מתאימה. ברגע שזרימת היחסים מוגדרים, לעומת זאת, הם חזקים, והם לא ישתנו גם בתנאי elution שיפוע 7,
פרוטוקול וידאו מפורט המלווה את כתב היד הזה נועד להראות כיצד להשתמש ומנגינת תפקוד עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים במצב ריבוב של זיהוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה כלל האפיון ואפיון של קפה באמצעות HPLC עם גילוי ריבוב העסקת עמודה מקבילה זרימה מפולחת (כוחות הביטחון הפלסטיניים). המרובב HPLC באמצעות עמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים מאפשר אפיון וזיהוי של גורמים כימיים מפתח על ידי הפחתת מורכבות נתוני המדגם תוך קבלת מידה רבה יותר ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35 (3), 410-415 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a ‘virtual’ narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
