ضبط عمود مقطع التدفق الموازي وتمكين الكشف المضاعفة
Summary
Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.
Abstract
Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.
Introduction
أعمدة تكنولوجيا تدفق النشطة
تم تطوير تكنولوجيا تدفق النشطة (AFT) الأعمدة اللوني مؤخرا للتغلب على عدم الكفاءة في فصل المرتبطة تدفق التجانس 1-6، وكذلك لتمكين الكشف المضاعفة. في هذا بعينه نحن الاتصالات بالتفصيل عملية التشغيلية للبالتوازي مجزأة تدفق (PSF) عمود مع الكشف عن المضاعفة. المزايا الوظيفية الرئيسية للعمود PSF هي: (1) يتم عزل التدفق من المنطقة الوسطى شعاعي من السرير العمود من المنطقة الطرفية أو جدار التدفق، (2) حجم الطور المتحرك التي يجب معالجتها بواسطة الكشف يتم تقليل المصدر، ويمكن المضاعفة مصادر (3) كشف لتوسيع المعلومات عينة من دون غرس التأخير كشف عبر كل عملية الكشف، أو في وقت لاحق يستلزم تقسيم عمود آخر تيار تدفق 7،8. السمة الرئيسية في تصميم العمود PSF تمكن لdvantage الكشف المضاعفة هي منفذ التجمع المناسب وفريت رواية الشكل 1 هو صورة من العمود الخلف مقارنة العمود التقليدي. من المهم أن نفهم أن عملية تقسيم الحصول عليها باستخدام أعمدة تدفق مجزأة موازية ليست هي نفسها كما تدفق تيار عمود آخر تقسيم. في تيار تدفق عمود آخر تقسيم كامل الفرقة عينة من حافة الرائدة إلى الحدود القصوى من الذيل وعينات بالتساوي (أي محوريا)، وبالتالي، كل تيار تدفق يساوي فيما يتعلق الكفاءة وحساسية. حجم حساسية مما يجري مقسوما على عدد الانشقاقات. في قوات الأمن الفلسطينية، ومع ذلك، فإن العينات عملية تقسيم الفرقة شعاعيا، وليس محوريا. على هذا النحو، وعينات الساحلية بوسط ذروة قمة – المنطقة الأكثر تركيزا من الذروة. وهكذا، فإن حساسية هنا هي أعلى كما لا تضعف الذروة التي كتبها المنطقة منتشر المخلفات. عينة يبلغ حجمه من الموانئ الطرفية ليست فعالة كما هو الحال في سنترامنطقة لتر، ولكن، منذ يتم أخذ عينات الفرقة شعاعيا، وليس محوريا، عرض ذروة أضيق مما هو الحال بالنسبة لعملية أخذ العينات التي تقسم الذروة في الاتجاه المحوري، أي انشقاق العمود آخر. وبالتالي لا يتم تقليل حساسية مع كاشف تعتمد التركيز.
في العمود قوات الأمن الفلسطينية، ويشمل تركيب منفذ منافذ الخروج متعددة وعلى داخل هذه الغاية المناسب ويقع هناك فريت الحلقي. الجزء الداخلي من هذه القنوات فريت الحلقي تتدفق من عمود شعاعي عبر منفذ ميناء المركزي، في حين أن الجزء شعاعي الخارجي للقنوات منفذ فريت تتدفق من العمود عن طريق الموانئ تدفق منفذ الطرفية أو منطقة الجدار. يتم فصل الأجزاء الداخلية والخارجية للفريت منفذ بجدار كتيمة تمنع تدفق المتبادل بين هذه المناطق تدفق 2. ونتيجة لهذا التصميم يتم فصل التيار تدفق شعاعي المركزي من خلال السرير عمود من خصوصيات تدفق منطقة الجداربيئة تطوير متكاملة العمود. الجزء النسبي للتدفق من هاتين المنطقتين يمكن أن تختلف على أي نسبة المطلوبة تقريبا من خلال إدارة الضغط من أجل تحسين مختلف الجوانب الفنية للتكنولوجيا العمود، مثل كفاءة الانفصال أو حساسية الكشف. في جوهرها، وهذا التصميم وتحدد بشكل فعال ضمن أكبر العمود شكل عمود "الظاهري"، التي يبلغ قطرها الداخلي الضيق، وبالتالي وظائف العمود كعمود الجدار أقل صحيح، والتغلب على عمود التجانس السرير وآثار الجدار 9،10.
الفوائد الرئيسية من الأعمدة PSF هي التحسينات في كفاءة العمود، والحد من تجهيز المذيبات لمصدر كشف (ق) وتمكين الكشف المضاعفة. ومع ذلك، ميزة إضافية هي أنه منذ تتم إزالة المخلفات والمناطق المواجه من أي فرقة من شطف العام ملف المذاب في شطف أو الكشف موجود في أعلى تركيز من لولاها ملاحظتها لنفس الصورةolute الحقن وتحميل تركيز على عمود التقليدية، اعتمادا على نسبة تجزئة المستخدمة. ونتيجة لذلك كثيرا ما لوحظ هناك مكاسب في كثافة إشارة للفصل أجريت على الأعمدة PSF 2. في الواقع، إذا تم تعديل نسبة تجزئة مثل أن 25٪ من مخارج تدفق من كل من منافذ خروج أربعة، وشدة إشارة إلى أن لوحظ استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) كشف وتبين عمليا بالضبط نفس كثافة إشارة تظهر بشكل واضح باستخدام التقليدية العمود حيث كامل (100٪) من الطور المتحرك ويتم تحليل 7. وعلاوة على ذلك، ضبط نسبة منفذ بين المناطق تدفق الوسطى والجدار يسمح كفاءة العمود على الوجه الأمثل. لاحظت مكاسب في الكفاءة العمود باستخدام أعمدة AFT لا يمكن القول أن قيمة واحدة، لأن هذه المكاسب الكفاءة هي وظيفة من ثلاثة عوامل هي: (1) معدل التدفق، (2) نسبة تجزئة، و (3) عامل الاحتفاظ المذاب . ومع ذلك، وتحقيق مكاسب في الكفاءة مقارنة التحويلويلاحظ دائما تقريبا الأعمدة entional، وأحيانا هذه المكاسب أكثر من 100٪ في عدد من لوحات النظرية 1،2. القدرة على ضبط نسبة تجزئة يسمح المحلل لتكييف فعال قطر عمود "الظاهري"، وهذا هو عامل مهم في ما يتعلق بعملية الكشف. على سبيل المثال، يتم تأسيس 2.1 مم القطر الداخلي (ID) عمود الظاهري من 4.6 ملم عمود معرف البدني عندما تكون نسبة تجزئة هي 21٪ من المرحلة المتنقلة يبلغ حجمه من شعاعي ميناء الخروج المركزي. في ظل هذه الظروف، ينفذ الظاهري 2.1 ملم عمود الهوية مع الكفاءة التي قد تكون أكبر أكثر من 70٪ من التقليدية 2.1 ملم عمود الهوية، اعتمادا على معدل التدفق، والمذاب الاحتفاظ عامل 10.
تصميم عمود PSF الحالي الذي يستخدم للكشف عن المضاعفة يشتمل على 4 منافذ منفذ المناسب، ولكن يمكن تركيبها على عمود مع 2-الميناء أيضا تركيب النهاية، ومع ذلك، وهذا يحد كشف رس اثنين فقط من كشف. العملية الأساسية من هذه الأعمدة، مع ذلك، في نفسه، إلا يمكن أن يقترن أن أربعة كشف في وقت واحد إلى 4 منافذ منفذ العمود PSF توسيع نطاق الكشف المضاعفة. وبصرف النظر عن عمود أنابيب الضام قبل وبعد، ومتطلبات إضافية الوحيدة التي تشغل عمود PSF غير الأنابيب التي يمكن توصيلها إلى الموانئ منفذ الطرفية، والوسائل التي يمكن قياس كمية الطور المتحرك مرورا كل أنبوب، عادة إما قياس كتلة أو القياس الحجمي. لسهولة ضبط، ويجب أن يكون القطر الداخلي لجميع أنابيب تدفق مخرج نفسه. ثم اختلفت نسبة التدفق بين موانئ الخروج المركزية الطرفية وشعاعي من خلال استخدام إدارة الضغط، وذلك ببساطة عن طريق تغيير طول الأنبوب الموجود على منفذ الطرفية المناسب، أو طول كاشف آخر الأنابيب على شعاعي الميناء منفذا المركزي.
كشف المضاعفة عن طريق أعمدة PSF </stroنانوغرام>
ميزة هامة من الأعمدة PSF هي أن كل من منافذ الخروج منفذ يمكن ان تكون مرتبطة مباشرة إلى المصدر الكشف، وبالتالي تمكين الكشف المضاعفة. في نظام الكشف مصممة تصميما جيدا لتحليل واحد مع الكشف عن المضاعفة يمكن أن توفر معلومات كبيرة في ما يخص طبيعة المكونات داخل العينة. الأهم من ذلك، يمكن إجراء الاختبارات المدمرة وغير المدمرة في نفس الوقت بالضبط، دون تأخير الكشف. وهذا يسمح للاحالة المطلق، على سبيل المثال، المواد المضادة للتأكسد باستخدام DPPH • كاشف، مع مكونات احظت أن أزل مع الأشعة فوق البنفسجية و / أو قياس الطيف الكتلي (MS) ردود الكشف عن 7،11. ولذلك، يمكن تشغيل أربعة أجهزة كشف مستقلة في وقت واحد مع الأجزاء المناسبة من تدفق الموجهة إلى كل كاشف عن طريق أي من منافذ مأخذ الأربعة. منذ تدفق من خلال هذه المنافذ يمكن تعديلها بسهولة كمية من المذاب الوصول إلى أي من أجهزة الكشف يمكن تعديلها لتناسبحساسية مصدر كاشف معين. وتجدر الإشارة إلى أنه، مع ذلك، أن الهجرة المذاب الأكثر فعالية لوحظ من خلال شعاعي الميناء منفذا المركزي. كل من الموانئ الطرفية تقديم كفاءة الفصل ما يعادلها، والتي عند تعيينها إلى 25٪ من خلال كل ميناء، ليست سوى أقل قليلا كفاءة من عمود التقليدي. على هذا النحو، فمن المهم أن يتم تعيين كاشف الكمي لتحليل عينة من شعاعي ميناء الخروج المركزي.
عند إعداد عمود PSF لغرض الكشف عن الإرسال المتعدد هناك عدد من الاعتبارات التي يجب القيام بها لتحقيق نتائج فعالة وعالية الجودة؛ هذا هو أبعاد أنبوب لكل منفذ، واختيار أي منفذ لنوع من كشف وضبط التدفق.
الأبعاد أنبوب لكل منفذ
في اللوني طول عمود آخر أنابيب يلعب دورا حاسما في كفاءة وأداء الانفصال. وكالة مكافحة المخدرات كبيرةود الحجم نتيجة طويلة أو واسعة أنابيب معرف من منفذ عامود لكشف يؤدي إلى فقدان الكفاءة والقرار، وحساسية. وبالتالي، يجب أن تستخدم أبعاد أنابيب المناسبة عند إعداد العمود PSF لتحقيق أقصى قدر من إمكانات في توفير الفصل كفاءة وفي الوقت ذاته توفير فوائد مضاعفة.
الميناء لالكاشف
الرقم 2 هو التوضيح لإعداد سبيل المثال الكشف المضاعفة (البنفسجية المرئية (U فيس)، مطياف الكتلة (MS) و2،2-ثنائي-1-picrylhydrazyl (DPPH •) كشف). ويبين الرسم التوضيحي يتم إرفاق ميناء المركزي للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، في حين DPPH و• ويتم إرفاق كشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس إلى الموانئ الطرفية. منذ MS هو كاشف الأكثر حساسية من الثلاثة، وتدفق للكشف عن هذا كان موجها من ميناء منفذ المركزي. كما DPPH • الكشف غير انتقائية لpresencوجهت ه من المواد المضادة للاكسدة، وأقل حساسية والأكثر تسامحا لفرقة توسيع، تتدفق إلى هذا كاشف من ميناء الطرفية. كان للأشعة فوق البنفسجية فيس كاشف 'عام' الثانوية، حتى تتدفق إلى هذا كاشف كان موجها من ميناء الطرفية الثاني.
ضبط تدفق
مرة واحدة وقد تم إرفاق الأنبوب المناسب من ميناء إلى كشف، وتدفق الخروج من كل من كشف يمكن تعديلها لالمبلغ المطلوب. وهناك طريقة بسيطة لقياس كمية تدفق الخروج من كل كاشف هو لوزن كمية من المرحلة المتنقلة التي elutes من خلال كل ميناء على مدى فترة معينة من الزمن. وهكذا يمكن تحديد تدفق مئوية، ونسب التدفق يمكن تعديلها من قبل أي تقصير أو إطالة الأنابيب التي تعلق على خط منفذ على كشف وفقا لذلك لتتناسب مع متطلبات كشف في الاختيار. كشف المختلفة لها متطلبات مختلفة من التدفق، على سبيل المثال، الخلية تدفقكاشف مضان (FLD) لا تتدفق نسبة محدودة، ولكن يجب توخي الحذر لتجنب الضغط الزائد للخلايا التدفق. وبالتالي السيطرة على تدفق من خلال FLD عادة ما يتحقق عن طريق ضبط هبوط الضغط عبر أجهزة الكشف الأخرى وما تبقى من تدفق ثم يمر عبر الكبد الدهني. وكشف عن أن تراعي كمية تدفق التي يتم تسليمها هو MS. عموما، يمكن الطيف الحالية كتلة الراقية معالجة بسهولة في جميع أنحاء 1-1،5 مل / دقيقة من الطور المتحرك المائية باعتدال. فوق هذا معدل التدفق والفيضانات من مصدر قد جعل MS غير صالحة للعمل. ومع ذلك، استفاد حساسية الكشف في معظم الطيف الجماهيري باستخدام انخفاض معدلات تدفق؛ وبالتالي قدرات تقسيم تدفق PSF مفيدة للغاية للتطبيقات التي تنطوي على كشف MS. ويمكن استخدام عمود ارتفاع معدلات التدفق الحجمي، ولكن مع الأحمال انخفاض حجم نقلها إلى كشف MS. ضبط تدفق للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، ولكن يجب أن يتم عن طريق ضبط هبوط الضغط مسبق للكشف MS، MS بدلا من آخر. هنا، واستخدام أنابيب ضيق تجويف (0.1 ملم معرف) مفيد جدا، حيث أن الضغط يمكن تعديلها بسهولة دون إضافة حجم القتلى غير مناسب.
اعتمادا على نوع من كاشف تعديل نسبة التقسيم يمكن أن يتم إما قبل أو بعد كشف. إذا كاشف غير المدمرة، مثل استخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس، سيتم قياس نسبة تدفق وضبطها للكشف عن آخر. إذا تم استخدام جهاز كشف المدمرة واحد في متعدد إعداد يتم تحديد نسبة التدفق عن طريق حساب الوراء فيما يتعلق أخرى نسب تدفق الميناء. إذا تم استخدام جهاز الكشف عن أساس كاشف مثل DPPH •، يتم قياس نسبة تدفق للكشف عن آخر دون إضافة كاشف. وإذا تم استخدام اثنين أو أكثر تدميرا للكشف عن، ثم يتم قياس نسبة تدفق ما قبل كاشف. الأنظمة التي قد تتطلب أجهزة إضافية، مثل DPPH • الكشف، وسوف يكون نظام الضغط الإضافي الذي قد يغير تدفقنسبة تعلق مرة واحدة لنظام الكشف. ولذلك، ينبغي إيلاء دراسة متأنية لضغوط النظام من كشف مدمرة، عند ضبط نسبة تدفق ما قبل كاشف. بغض النظر عن نسبة تدفق التي تم تعيينها من خلال أي من المنافذ، يجب الحصول على معلومات كمية عن طريق توحيد المناسب. مرة واحدة يتم تعيين نسب التدفق، ومع ذلك، فهي قوية، وأنها لا تتغير حتى في ظل ظروف شطف التدرج 7،
ويهدف البروتوكول فيديو مفصل يرافق هذه المخطوطة لإظهار كيفية استخدام وتوليف أداء العمود PSF في وضع المضاعفة من الكشف.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتنطوي هذه الدراسة توصيف والتنميط من القهوة باستخدام HPLC مع الكشف عن المضاعفة توظف تدفق مجزأة (PSF) العمود المتوازي. المضاعفة HPLC باستخدام أعمدة PSF تمكن من توصيف وتحديد الكيانات الكيميائية الأساسية عن طريق الحد من تعقيد البيانات من عينة حين الحصول على قدر أكبر من المعلو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35 (3), 410-415 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a ‘virtual’ narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
