条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル<em>のCre-LOX</em>マウスモデル

使用されるすべての材料に関する情報を表1に与えられている。全ての動物実験は、英国内務省プロジェクトライセンスの権限の下で行いました。 AH-CREとVIL-のCre-ER T2システムを使用して1 CatnB削除 AH-CRE + CatnB + / +、AH-CRE + CatnB FLOX / FLOX、VIL- のCre-ER T2 CatnB + / +とVIL-のCre-ER T2 CatnB FLOXの14週齢のコホート- 10を生成するために、マウス系統を渡り/ FLOX。再結合の視覚的な分析のために、β-gal染色を経て、コホートはRosa26R-lacZレポーター 17が含まれている必要があります。コホートが変更遺伝子および誘導剤の使用の有無を制御する必要があり、必要な集団の大きさは、電力解析を用いて推定されるべきです。 β準備AH-CRE導入遺伝子を誘導するために、; -Naphthoflavone（BNF）、またはVIL-のCre-ER T2導入遺伝子のタモキシフェン（TAM）は、トウモロコシ油中の10 mg / mlでの作業溶液を得ました。注：エージェントは、適切な個人用保護具を使用して、ドラフト内で秤量しなければなりません。 水浴中でBNFのための99.9°CまたはTAMのための80°Cのいずれかに琥珀色のボトルの熱ソリューション（BNFは光感受性です）。 BNFのために100℃に設定された加熱攪拌機への転送、またはTAM 80℃、10分間攪拌します。 溶解するまでBNFは1.3から1.4を繰り返しために（> 1時間を取ることができます）。 小さな琥珀色の瓶（〜5ミリリットル）に小分けして、-20℃で凍結します。ボトルは、3回の凍結/融解サイクル後に廃棄されるべきです。融解エージェントを使用し、それらが溶液から下落している場合は、適切な温度に再加熱する前に。注射の前に、<37℃に冷却させます。 25gのマウスがapprop 0.2mlのを受け取り、例えば、80ミリグラム/ kgの用量でマウスに腹腔内（IP）を注射しますriate誘導剤。 AH-CREのために4日間毎日一回の注射を与えるVIL-のCre-ER T2の間 、24時間の期間中に3回の注射を提供します。 Reporterの可視化と免疫組織化学のための腸の2解剖（IHC） 倫理的承認に従って事前の麻酔なし頸椎脱臼を使用して、マウスを安楽死させます。仰臥位でマウスを置き、70％エタノールを使用してファーを濡らし、はさみを使用して正中線に沿って縦方向にイントラ腹腔を開きます。 鉗子で胃を保護し、食道への​​接続を切断。優しくお腹を引っ張ることにより、付録までの小腸を取り出します。そっと付録を引っ張って肛門までの大腸を削除します。 腸が単離されたら、胃や付録を削除します。平滑末端ピペットチップで注射器を用いて1×PBSで洗い流す腸。注：各腸は私でなければなりませんmmediately以下で説明する下流のアプリケーションのいずれかのために処理しました。 腸の3ホルマリン固定 3つの等しいサイズのセクションとラベル近位、中、遠位にフラッシュ腸をカット。 1cmの片に各セクションをカット。サージカルテープ2センチメートル×2センチの小さなストリップを取ります。ピラミッド形成のサージカルテープの中央に上の3つの1 5センチの部分を置きます。 閉じると、「ログパイル」効果を与えるために、縦方向の部分の周りにテープをシール。少なくとも10倍、組織のボリュームに固定液の量を中性緩衝ホルマリン固定液を大過剰を含む平底の容器に組織を配置します。注：固定用チューブ内の組織の過剰量を配置しないように、複数のコンテナに分割。 埋め込み、切片の前に24時間 – 少なくとも18 4℃で置きサンプル。核βカテニンの損失を防ぐために、24時間を超えて修正されません。70％エタノール、組織の少なくとも10倍の体積の大過剰を含有する平底容器に固定転送後の組織。 腸の4 Methacarn固定 300 mlのMeOHを、150 mlのクロロホルムおよび75 mlの氷酢酸を組み合わせることにより、methacarn固定液を調製解剖前に（4：2：1）。 、近位ミドルおよび遠位3同じサイズのセクションにフラッシュされた腸をカット。 ろ紙（15cmのX15センチ）の一片側によって腸側の各部分を置き、springbowハサミを使用して「顔en 'とそれを開きます。室温で24時間 – 3 methacarnを含むガラス皿に腸及びろ紙を置きます。固定後、鉗子を用いて、腸セクションの最後を拾います。 「スイスロール」を形成し、わずかに鉗子を開き、それを介して25 G針を置くことによってロールを保護するために鉗子の周りの腸に風。ラを含む平底の容器に組織を配置します中性緩衝ホルマリン固定液のRGEの過剰、処理に進む前に、少なくとも1時間のための組織と店舗の体積に固定液の少なくとも10倍のボリューム。 5.ホールマウントのLacZの可視化（エルMarjou らから変更された。18） 1：10にミネラルオイルを溶融ralwaxを組み合わせることにより、ワックスプレートを準備します。 15cmのペトリ皿に注ぎ、冷却するために残します。 表1の通りのX-galの固定液を用意し、氷上で保存します。 腸全体を削除し、25ミリリットルの氷冷のX-galの固定液でフラッシュすることによって部2修正腸ごとに、氷冷1×PBSでを通じて洗い流します。 5等分（プレートあたり最大5） – はさみを使用すると、3に腸を切りました。ワックスプレート上に各セクションを置き、セクションは少し腸間膜ライン最上に延伸されるように、それぞれの端を突き止めます。余分な腸間膜をトリミング。 springbowハサミを使用すると、縦方向に腸を切断して、道に沿ってピン。60; セクションをカバーし、4℃で少なくとも1時間放置するのX-galの固定液でプレートを洪水。 25ミリリットルのピペットを用いて、X-galの固定液を取り出して、1×PBS 30mlで1回洗浄。理想的には、ロッキングプラットフォーム上で室温で60分間、 – 30のためのソリューションをdemucifying DTTを30 mlのカバーセクション。 25ミリリットルのピペットを用いてdemucifiying溶液を除去し、1×PBS 30mlでプレートをあふれさせます。パスツールピペットを使用して、粘液を除去するために、プレートに1×PBSを用いて腸セクションを洗います。 X-gal染色の30ミリリットルと25ミリリットルピペットと洪水で1×PBSを削除します。ロッキングプラットフォーム上で穏やかに撹拌しながら、暗所で室温で一晩インキュベートします。 背景色はまだ白である場合のセクションでは、青/緑の汚れを開発したことを一晩のインキュベーションのチェックの後、新鮮な染色溶液を添加し、染色が発症するまで監視することができます。注：セクションでは、その後、染色した後、さらなる染色は行われませんすることができます。 X-gal染色を削除1×PBS 30mlで25ミリリットルピペットや洪水プレートを使用し、穏やかに撹拌しながら3分間おきます。ピンを削除し、鉗子で、腸セクションの最後を拾います。少し鉗子を開き、それを介して25 G針を入れてロールを固定し、「スイスロール」を形成するために鉗子の周りの腸に風。 組織のボリュームに少なくとも10倍の固定剤の量の中性緩衝ホルマリン固定液を大過剰を含む広口平底の容器に組織を配置します。埋め込み、切片の前に少なくとも24時間4℃で置きサンプル。 腸から陰窩の6抽出セクションごとなど2.小腸の最初の20センチ、クリーンな解剖表面に腸を分離し、鉗子とはさみ接続されているすべての脂肪/腸間膜を削除を使用して。 springbowハサミを使用すると、縦方向に腸を開きます。 fは、顕微鏡カバースライドを使用してirmly絨毛および粘液を除去するために、腸管内腔をこすり。はさみを使用して、ペニシリン（100 U / ml）およびストレプトマイシン（100 U / ml）を補充した約5 mmの片に腸を切断し、25 mlの1×HBSSで50 mlチューブに移します。 RTで10分間インキュベートします。 70μmのセルストレーナーを通してサンプルを通過させることにより、抗生物質を含む培地を除去します。 10ミリリットル1×HBSSを含む新しい50mlチューブに腸のセクションを配置し、キャップを交換してください。 静かに二回反転させ、70μmのセルストレーナーを通過させることにより、1×HBSSを除去します。さらに6.4＆6.5三回繰り返すことで、腸の部分を洗浄し、最終的な割合が比較的明確であることを確認してください。 EDTAの10ミリリットルを含む新鮮な50mlのチューブ（8ミリモル）/ 1×HBSSに組織を移し、室温で5分間おきます。 、または渦70μmのセルストレーナーを通過し、EDTA（8ミリモル）/ 1×HBSSを含む新しい50mlチューブに組織片を転送する – 活発（30×20）振ります。注意：絨毛上皮の分析が必要な場合は廃棄されるか、または保持することができるいずれかのフロースルー。 、30分間氷上で組織片をインキュベート精力的にサンプル振る（20 – 30倍）や渦を。 70μmのセルストレーナーを通してサンプルを渡し、これが陰窩が含まれているとして流れを介して、保持しています。 1×HBSS 10 mlを含む新しい50mlチューブに組織片を転送します。積極的に（20 – 30倍）振動や渦を、70μmのセルストレーナーを通過し、フロースルーを保持しています。腸の作品から陰窩の最大回復を確実にするために、もう一回繰り返します。 5分間300×gでの分画遠心を通る流れを結合します。上清を捨て、および陰窩ペレットを保持しています。注：ペレットを培養する（該当する場合）、または前の標準DNA / RNA /タンパク質抽出手順を-80℃で保存するためにすぐに使用することができます。 7.標準免疫組織化学的可視化 5μをカットポリ-L-リジン（PLL）スライド上のパラフィン包埋組織の切片M。注：B-カテニン抗体で染色するための標準プロトコルを以下に示すが、他の抗体のためのパラメータを表2に示します。 新鮮なキシレンを含むスライド浴中の2倍、3分間の洗浄と脱ワックス。 100％エタノール（2回）、95％エタノール、70％エタノール、最終的に1×PBSへ：新鮮含むスライドバスを通して3分間スライドを渡すことで水分補給。 場所は、クエン酸緩衝液（pH 6）を含むスライド槽に挿入し、抗原を取得するために20分間99.9℃で加熱します。スライドを冷却した後、5分間1xTBS / Tを含むスライド浴中に3回、5分間の洗浄を可能にします。 PAPペンで組織を中心に描くすぐに、最後の洗浄からスライドを外し、商業ペルオキシダーゼブロックまたは（蒸留H 2 O中 ）、1.5％のH 2 O 2とカバー部。 室温（RT）で20分間インキュベートし、次いで5分間、新鮮な1×TBS / Tを含むスライド浴中で3回洗浄します。洗浄した後、あなたの一次抗体の非特異的な疎水性結合をブロックするために室温で30分間、1xTBS / T / 5％正常ウサギ血清（NRS）に、カバーセクションるピペットを使用して。 5％のNRSで200：1に希釈したB-カテニン一次抗体でパスツールピペットとカバー部分とNRSのブロックを削除します。洗浄は、新鮮な1xTBS / Tを含むスライド浴中で3×5分間スライドします。注 – 他の抗体は、希釈および特異性の最適化が必要になります。抗体の特異性を確保するために、適切な抗体およびアイソタイプコントロールできない汚れを実行する必要があります。アイソタイプコントロールは、宿主種とあなたの一次抗体のアイソタイプにマッチしています。 いずれかの市販のHRP検出キットまたは適切な蛍光標識二次抗体（ 表2）で視覚化します。注： – 15秒で十分です開発の長さは、10は、βカテニンのために、各抗体については異なります。抗体最初のESTの開発を最適化するにはablish時間の長さは、陽性対照スライドを使用して陽性細胞を可視化して、以降のすべてのスライドにこれを適用するために必要な。 洗浄は、新鮮なTBS / Tを含むスライド浴中で3×5分間スライドします。対比は、〜45秒（蛍光標識二次抗体を使用している場合は必要ありません）のためにヘマトキシリン​​を含むスライド浴中に浸漬することによりスライドします。きれいなスライド浴にスライドを入れ、完全に洗浄されていないヘマトキシリン​​を確保し、約1分間水道水ですすいでください。 アルコールの濃度を増加させ、スライド含む浴を通過することによってスライドを脱水します。 1×70％EtOHに30秒、95％EtOH中の1×30秒、100％エタノールで2倍30秒洗浄、キシレンで2倍の2分。 マウントは、市販の取り付けメディアを使用して、カバーガラスの下にスライドします。注：蛍光標識した抗体を使用している場合、核を標識し、DAPIを含む培地でマウントします。 特定Intestinaの8組織学的同定L上皮細胞腸 表2に記載ビリン抗体および条件にセクション7を使用してセクションを準備します。 腸-内分泌細胞（Grimelius染色18,19）。 手順7.1から7.2に従うことにより、セクションを準備します。洗浄は3分間の超純水を含むスライド浴中にスライドします。予熱された銀溶液（ 表1）を含むスライド浴にスライドを移し、3時間60℃でインキュベートします。 3分間45℃で新たに調製した予熱した減速溶液（ 表2）を含むスライド浴中の銀溶液と場所からスライドを削除します。スライドを削除し、3分間、新鮮な超純水を含むスライド浴中に置きます。セクション7から手順7.6から7.8に従ってください。 ゴブレット細胞（アルシアンブルー染色）。 アルシアンB1をを含むスライド浴に..次の手順7.1から7.2による転送スライドをセクションを準備室温で5分間、UEのpHは2.5。 5分 – 3用水道の下にピペットと場所スライドバス付きのアルシアンブルー染色を削除します。ステップ7.6から7.8に従ってください。注：アルシアンブルー溶液をさらなる使用のために保持することができます。 ISC。 識別するためのISCは、セクション9に従ってください。 パネート細胞。 表2に記載したリゾチーム抗体および条件を用いてセクション7次のセクションを用意してください。 マウス腸19-21とその場のRNAの検出9. PLLスライド上に、ホルマリン固定された腸（セクション3）から5μm切片を置きます。 Olfm4式21を検出するための線形化ジゴキシゲニン標識RNAプローブを準備します。脱ワックスとは、セクション7の注に従って切片を再水和：このプロトコルは、RNAプローブの劣化を防止するために、RNAseを含まない環境で行われるべきです。 トンの周りを描きますPAPペンで問題が試薬を最小限に抑えます。 30分間（蒸留H 2 O中）6％のH 2 O 2とスライド浴中にセクションをインキュベートします。 3分間、新鮮な1×PBSでスライド浴で二回洗浄します。氷上で20分間、4％パラホルムアルデヒドでピペット、カバー部を使用して、1×PBS捨て。 3分間、新鮮な1×PBSでスライド浴で二回洗浄します。 3分間の新鮮な1×PBSでスライド浴中で5分間の洗浄のためのプロテイナーゼK溶液でピペットカバーセクションを使用しました。 RTで5分間4％パラホルムアルデヒドで被覆することによってピペット接尾部を使用して。 DEPCでスライド浴で洗浄は2分間のH 2 Oを処理しました。撹拌しながら10分間、無水酢酸溶液中にピペットカバーセクションを使用して。 1×食塩水/ 3分、続いて新鮮な1×PBS / 3分、とスライド浴で洗浄します。アルコールの濃度の増加を含むバスを介してスライドを渡します。 70％のEtOH、95％EtOH中の1×30秒で1×30秒、新鮮な100％エタノールで2倍30秒の洗浄、新鮮なキシレンで2分を2倍空気乾燥させ。 希釈Olfm4プローブ1：ハイブリダイゼーション緩衝液中の100および3分間80℃に加熱することによって、プローブを変性させます。各セクションにプローブを100μlを適用し、スライドの脱水を防ぐためにパラフィルムでカバーしています。 65℃の暗所、湿室中で一晩インキュベートします。 15分間、65℃で5×SSCでスライド浴で洗浄します。 65℃で30分間、新鮮な50％ホルムアミド/ 5×SSC / 1％SDSで二回スライド浴中で洗浄セクション。 10分、65℃での最初の、室温で二新鮮なPBTでスライド浴中に二回のセクションを洗ってください。 PBTは、37℃で45分間、25μgのRNアーゼを含有するピペットカバーセクションを使用して。室温で5分間PBTでスライド浴でセクションを洗ってください。 65℃で30分間、新鮮な50％ホルムアミド/ 5×SSCで二回スライド浴中で洗浄セクション。 、暗闇の中でPBTや店舗で、10％ヒツジ血清をピペットを用いて、MOIをカバーセクションをブロックするには3時間 – 2 RTでST室。 5 mg / mlのマウスの腸の粉末を含むPBT 10％ヒツジ血清を500：1の抗ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ結合抗体を希釈することによって抗体を準備します。ロッキングプラットフォーム上で暗所で4℃で3時間インキュベートします。過剰腸粉を除去し、上清に、PBTの1％のヒツジ血清の3倍のボリュームを追加するためにスピンダウン。 ピペットでスライドからブロックを削除し、各セクションへの抗体溶液100μlを加え、パラフィルムで覆い、4℃で一晩、暗い、湿ったチャンバー内でインキュベートします。 5分間新鮮なPBTでスライド浴中に3回のセクションを洗ってください。ブロックするためのセクションでは、スライド浴中で5分間、新鮮なNTMTバッファーで3回洗浄します。 BMとの各セクションでは、紫色のピペットカバーを使用して、視覚化し、24室温で暗所でインキュベートする – 十分に強い色が開発されるまで72時間。 1分間エオシンで浸漬することによって、一度PBTと対比でスライド浴でセクションを洗ってください。レモ5分 – 3用の流水でスライド浴中の洗濯セクションによって過剰エオシンVEの。キシレンにスライドを浸し、空気乾燥させ。商業メディアを使用してカバースリップの下にマウントします。 腸管上皮の組織学的特性評価10 PLLスライド上に固定された組織（セクション3＆4）から5μm切片を置きます。 ≥25ランダム全体（または≥50半分）以下の各パラメータの各コホートの≥4マウスから陰窩を分析します。注：整合性を維持するため（だけ近位端を使用）、各腸の同じ場所から陰窩を分析します。 （特に明記しない限り）は、標準的なH＆E染色した切片から細胞パラメーター：クリプト数、高さ、アポトーシスおよび有糸分裂。 墓所番号。 手動で基底層と接触している陰窩の数をカウントするために、低電力倍率（ 例えば 4Xまたは10X）を使用します。カウント≥10横基部腸の宗派少なくとも4匹のマウスからのイオン。 墓所の高さ。 手動陰窩/絨毛軸（ 図3b）に陰窩の底から細胞数をカウントするために高出力倍率（ 例えば 20倍または40倍）を使用します。 アポトーシス22、23。 方法1：手動で各クリプトにアポトーシス細胞の数をカウントするために高出力倍率（ 例えば 20倍または40倍）を使用します。アポトーシス細胞は、細胞収縮、クロマチン凝縮、細胞質ブレブ及びアポトーシス小体（ 図3a）を形成することによって同定することができます。 方法2： 表2に記載された条件を用いてカスパーゼ-3のためのIHC染色（セクション7）を実行し、高出力倍率を使用して（例えば、20Xまたは40X。）手動で細胞を定量するために、各陰窩における陽性細胞の数を数えます。アポトーシスの実行段階。 有糸分裂。 <ol> 手動で各クリプトで有糸分裂細胞の数をカウントするために高出力倍率（ 例えば 20倍または40倍）を使用します。有糸分裂細胞の凝縮したDNA材料を含み、典型的に対称とよく（ 図3b）が形成されています。 増殖。 表2に記載された条件を用いてのKi-67のためのIHC（セクション7）染色を実行します。手動で増殖する陰窩細胞の割合を定量するために陽性細胞をカウントします。