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Developmental Biology

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em> Cre-lox</em> Mausmodelle

Published: November 21, 2015
doi:
10.3791/53429
, , ,
1European Cancer Stem Cell Research Institute,Cardiff University, 2Institut Curie

Summary

Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen.

Abstract

Die epitheliale Oberfläche der Säugerdarm ein dynamisches Gewebe, das alle 3 erneuert – 7 Tagen. Das Verständnis dieser Erneuerungsprozess identifizierten eine Population rasch proliferierender Darm-Stammzellen (ISCs), gekennzeichnet durch ihre Expression des Gens Lgr5. Diese werden von einem ruhenden Stammzellpopulation, von der BMI-1-Expression gekennzeichnet ist, in der Lage, im Falle einer Verletzung ersetzen unterstützt. Die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis ihrer Rolle in Erkrankungen und Krebs. Die ISCs existieren innerhalb Krypten auf der Darmoberfläche, diese Nischen unterstützen die ISC in Auffüllen der Epithelien. Die Wechselwirkung zwischen den aktiven und ruhenden ISCs wahrscheinlich mit anderen differenzierten Zellen innerhalb der Nische, wie es zuvor gezeigt worden ist, dass die '' stemness '' der Lgr5 ISC ist eng mit der Gegenwart ihrer benachbarten Panethzellen gebunden. Bedingte cre-lox-MausModelle, die wir untersucht den Effekt des Löschens der Mehrzahl der aktiven ISCs in Gegenwart oder Abwesenheit von Paneth-Zellen. Hier beschreiben wir die Techniken und Analysen durchgeführt, um den Darm zu charakterisieren und zu zeigen, dass die Paneth-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der ISC Nische bei der Unterstützung Erholung nach erheblichen Beleidigung.

Introduction

Die luminale Oberfläche der Säugerdarm Merkmale Repetiereinheiten der Krypten und fingerartigen Vorsprüngen, bezeichnet Zotten, die in das Lumen ragen. Diese Oberfläche ist eine kontinuierliche Bahn von Epithelien, die komplette Selbsterneuerung etwa alle 3 unterzogen – 4 Tage 1. Diese dynamische Gewebe wird durch eine Population rasch proliferierender Stammzellen unterstützt (ISCs; auch als Krypta Basis Cylinderzelle bekannt), die zunächst durch ihre Expression des Gens Lgr5 2,3 identifiziert wurden. Diese Zellen existieren in einer spezialisierten Nischen am Boden der Krypten der Lieberkühn. Zunächst wird die Feststellung, daß ISCs wurden rasch proliferierender war diskordanten mit der herrschenden Vorstellung, daß eine Stammzelle war Ruhe Natur. Vor der Identifizierung des Lgr5 + ISC wurde postuliert, dass eine Population von Ruheetikettenhaltende Zellen auf der + 4-Position, relativ zu der Basis der Krypta waren die ISCs 1. Neuere Forschungen hwie jetzt durch den Nachweis, dass in erster Linie gibt es einen Pool von äquipotent Radfahren ISCs in jeder Krypta, deren Schicksal durch seine Nachbarn 4,5 reguliert versöhnt diese Beobachtungen. Für den Fall, sie verloren sind diese durch ruhende Zellen, die normalerweise an den sekretorischen Linie verpflichtet, sondern kann auf ISCs zurück, wenn das ISC Bevölkerung beschädigt 6 ersetzt werden.

ISC Nachbarn können entweder ISCs oder deren Tochterzellen. Die ISCs produzieren naiv Tochterzellen, die sich vermehren und differenzieren sich in den spezialisierten Zelltypen, die die epithelialen Blatt, Linien Darmlumen 1 umfassen. Der Kelch, enteroendokrinen, Enterozyten, Büschel und M Zellen wandern nach oben, um die luminale Oberfläche, wo sie bieten verschiedene Absorptions- und Regulierungsfunktionen bleiben jedoch die Paneth Zellen am Boden der Krypta, wo sie existieren, mit der ISCs vermischt. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass ein Anteil des naiven daughtER-Zellen für einen sekretorischen Linie dazu bestimmt sind Ruheetiketthalte Lgr5 lo Zellen, die Rückkehr zu einer ISC auf Verletzungen 6,7.

Aufgrund ihrer Bedeutung in Krypta Regeneration eine Priorität auf das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen der ISCs und seinen Nachbarn, insbesondere der Panethzellen platziert. Die Paneth-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der Nische, die die ISCs 8 unterstützt. Neben bakterizide Produkte die Paneth Zellen Signalmoleküle, die Wege, die ISC Erneuerung oder Differenzierung regieren zu aktivieren. Frühere Studien zeigten, dass die Lgr5 + ISCs könnte nur dann verbindlich, wenn sie für wesentliche Nische Signale durch ihre Tochter Panethzellen 8 vorgesehen konkurrieren könnte. Diese Studien untersuchten die Rolle von Paneth-Zellen an normalen Lgr5 + ISCs und nicht in einer Situation, wo sie beschädigt sind und Nachschub von einer Lgr5 lo Bevölkerung.

<pclass = "jove_content"> Um zu verstehen, Darm Biologie und Modellerkrankung untersuchen wir die funktionelle Rolle der Zellen und / oder Gene mit transgenen Mausmodellen 9,10. Häufig sind diese Modelle verwenden cre-lox-Technologie, um Gen (e) 9,10 bedingt zu ändern. Cre (Ursachen Rekombination) Rekombinase ist eine ortsspezifische Rekombinase des Integrase-Familie, isoliert aus dem Bakteriophagen P1. Cre katalysiert ortsspezifische Rekombination zwischen definierten 34 bp ' Lox P '(Locus χ der Crossover-P1) Websites. Mäuse gentechnisch so verändert LoxP Websites, die interessierenden Bereiche, die bei der Expression der Cre-Rekombinase ausgeschnitten flankieren, enthalten. Verknüpfung der Expression der Cre-Gens in eine Zelle oder entwicklungsspezifischen Promotors ermöglicht die Änderung in einer räumlichen Mode 9,10 hergestellt werden, ist dies besonders nützlich bei der Überwindung embryonale letale Mutationen. Weitere Verknüpfung des Cre-Expression zu einem Rezeptor-Weg,daß künstlich aktiviert werden, erlaubt zeitlichen Veränderungen.

Mit dieser Technologie haben wir inaktiviert die CatnB Gen 11 in den Darmepithelien. β-Catenin, das CatnB Genprodukt ist ein wichtiger Regulator des Wnt-Signalwegs, der ISC-Homöostase regelt. Zwei frühere Studien mit dieser Strategie erzeugt widersprüchlichen Ergebnissen 12,13. Die Studie von FEVR et al. 12 gezeigt Verlust von Stammzellen und Darm Homöostase. Während die Ireland et al. 14 Studie berichtet, dass im Anschluss an eine Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen die Krypta-villus Achse wurde aus Wildtyp-Zellen, die CatnB neu besiedelt. Der Hauptunterschied in diesen Studien war der Promotor verwendet werden, um Cre in Darmepithelien auszudrücken. Die FEVR et al., Verwendet Studie die Villin-Gen-Promotor an den Östrogenrezeptor verbunden, die durch die Verabreichung von t aktiviert werden kannamoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. Im Gegensatz Ireland et al., Verwendet das Promotorelement des Ratten-Cytochrom P450A1 (CYP1A1) Gens Cre-Expression in Reaktion auf die xenobiotischen β-Naphthoflavon (Ah-cre) anzutreiben. Die Eigenschaften dieser verschiedenen Systemen erzeugten zwei Hypothesen für diese verschiedenen Beobachtungen erklären. Das erste, das CatnB effizienter im ISC mit der vil-Cre-ER T2 System im Vergleich zu den Ah-cre gelöscht wird, wodurch die Anzahl der ISCs, um Unter Repopulation Niveaus verringert wird. Alternativ war es aufgrund CatnB Deletion Differenz in der differenzierten Zellpopulation. Die vil-Cre-ER T2-System richtet sich an alle Epithelzellen der Krypta und Zotten während die Ah-cre-System zielt nur die nicht-Panethzellen des ISC-Nische und Krypta. Diese Systeme bereitgestellt ideale Werkzeuge für die Prüfung des Behavior der ISCs und ihrer Wechselwirkung mit den Paneth-Zellen. Hier stellen wir verschiedene ausführliche Protokolle auf, wie wir früher, diese Systeme zu bestimmen, dass Panethzellen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der intestinalen Reaktion auf eine Verletzung 17 zu spielen.

Protocol

Informationen zu allen verwendeten Materials ist in Tabelle 1 angegeben. Alle Tierversuche wurden unter der Aufsicht eines britischen Innenministeriums Projektlizenz durchgeführt. 1. CatnB Deletion mit dem Ah-cre und vil-Cre-ER T2 Systeme Überqueren Sie die Mausstämme bis 10 zu erzeugen – 14 Wochen alten Kohorten von Ah-cre + CatnB + / +, Ah-cre + CatnB flox / flox, vil-Cre-ER T2 CatnB + / + und vil-Cre-ER T2 CatnB flox / flox. Für die visuelle Analyse der Rekombination über eine β-gal-Färbung, sollte Kohorten die Rosa26R-lacZ-Reporter 17 enthalten. Kohorten sollte auf das Vorhandensein von veränderten Genen, und die Verwendung von Induktionsmittel zu steuern, sollte die Größe der Jahrgänge erforderlich unter Verwendung eines Leistungsanalyse abgeschätzt werden. Um die Ah-cre Transgen induziert vorzubereiten β; -Naphthoflavone (BNF) oder für das vIL-Cre-ER T2 Transgen Tamoxifen (TAM) in Maisöl, um eine Arbeitslösung von 10 mg / ml zu ergeben. HINWEIS: Die Mittel sollten in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutz abgewogen werden. Wärmelösungen in einer Braunglasflasche (BNF ist lichtempfindlich) entweder auf 99,9 ° C für BNF oder 80 ° C für TAM in einem Wasserbad. Transfer in ein beheiztes Rührwerk bei 100 ° C für BNF gesetzt oder 80ºC TAM, und rühre 10 min. Für BNF wiederholen 1,3-1,4, bis es gelöst (kann> 1 Stunde dauern). Aliquots in kleine bernsteinfarbenen Flaschen (~ 5 ml) und dann bei -20 ° C. Die Flaschen sollten nach 3 Gefrier / Tau-Zyklen verworfen werden. Vor dem Tauwetter Mittel zu verwenden und erneut erhitzen, um geeignete Temperatur, wenn sie aus der Lösung gefallen. Lasse auf <37 ° C vor der Injektion zu kühlen. Spritzen den Mäusen intraperitoneal (IP) mit einer Dosis von 80 mg / kg, zum Beispiel eine 25 g-Maus erhält 0,2 ml der geeignet friate Induktionsmittel. Für Ah-cre liefern drei Injektionen innerhalb von 24 Stunden-Zeitraum, für vil-Cre-ER T2 geben eine Injektion pro Tag für 4 Tage. 2. Präparation der Darm für Reporter Visualisierung und Immunhistochemie (IHC) Euthanize die Maus mit Genickbruch ohne vorherige Betäubung im Einklang mit ethischen Zulassung. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage und nass das Fell mit 70% EtOH, öffnen Sie den intraperitonealen Hohlraum in Längsrichtung entlang der Mittellinie mit einer Schere. Sichern Sie den Magen mit einer Pinzette und trennen Sie die Verbindung zum Speiseröhre. Entfernen Sie den Dünndarm bis zum Blinddarm durch leichtes Ziehen auf den Magen. Entfernen Sie den Dickdarm bis zum Anus durch leichtes Ziehen an der Anlage. Sobald der Darm wurden isoliert entfernen Sie den Magen und Anhang. Flush Darm mit 1x PBS unter Verwendung einer Spritze mit einer stumpfen ended Pipettenspitze. HINWEIS: Jeder Darm sollte ichnmittelbar für eine der unten beschriebenen nachfolgenden Anwendungen verarbeitet. 3. Formalinfixierung der Darm Schneiden Sie die gespülten Darm in 3 gleich große Abschnitte und Label proximalen, mittleren und distalen. Schneiden Sie jeden Abschnitt in 1 cm Stücke schneiden. Nehmen Sie einen kleinen Streifen des chirurgischen Band 2 cm x 2 cm. Stellen drei bis fünf 1 cm Stücke an der Mitte der chirurgischen Band in Pyramidenform. Schließen und verschließen Sie das Band um die Stücke in Längsrichtung, um einen "Protokollstapel" Effekt. Platzieren Gewebe in einem Flachbodenbehälter das Volumen der Fixierlösung zu dem Volumen des Gewebes, die einen großen Überschuss an neutral gepuffertem Formalin Fixiermittel mindestens 10x. HINWEIS: Vermeiden Sie es, überschüssige Mengen von Gewebe innerhalb eines Rohres zur Fixierung, teilen sie in mehrere Container. Platz Proben bei 4 ° C für mindestens 18 bis 24 Stunden vor dem Einbetten und Schneiden. Um den Verlust von Kern β-Catenin zu vermeiden, darf nicht über 24 Stunden zu beheben.Nach der Fixierung Übertragungsgewebe zu einem Flachbodenbehälter mit einer großen Überschuß von 70% EtOH, mindestens 10-fache Volumen des Gewebes. 4. Methacarn Fixierung Darm Vor der Sektion vorbereitet Methacarn Fixiermittel durch Kombinieren von 300 ml MeOH, 150 ml Chloroform und 75 ml Eisessig (4: 2: 1). Schneiden Sie die gespülten Darm in 3 gleich große Abschnitte proximalen, mittleren und distalen. Legen Sie jedes Stück des Darms nebeneinander auf einem Stück Filterpapier (15 cm x 15 cm) und mit einem Springbow Schere öffnen Sie es "en face". Setzen Sie den Darm und Filterpapier in eine Glasschale mit Methacarn für 3-24 h bei RT. Nach der Fixierung abholen das Ende einer Darmabschnitt mit einer Pinzette. Wickeln Sie das Darms um die Zange, um ein "Swiss Roll" zu bilden, und sichern Sie die Rolle durch leichtes Öffnen der Zange und setzen eine 25 G-Nadel durch sie. Zeigen Gewebe in einem Flachbodenbehälter mit einer laRGE Schuß neutral gepuffertem Formalin Fixiermittels, mindestens 10-fache Volumen der Fixierlösung zu dem Volumen des Gewebes und Speicher für mindestens 1 Stunde, bevor die Verarbeitung. 5. Ganze Berge LacZ Visualisierung (Geändert von El Marjou et al. 18) Wachsplatten herzustellen, indem geschmolzenes ralwax mit Mineralöl bei 10: 1. Gießen Sie in 15 cm Petrischalen und abkühlen lassen. Bereiten Sie X-gal Fixiermittel gemäß Tabelle 1 und speichern Sie auf dem Eis. Entfernen ganzen Darm und durch Spülen mit eiskaltem 1x PBS, gemäß Abschnitt 2. Fix Darm durch Spülen mit 25 ml eiskaltem X-gal Fixiermittel. Mit einer Schere schneiden Sie den Darm in 3-5 gleiche Abschnitte (maximal 5 pro Platte). Setzen Sie jeden Abschnitt auf Wachsplatte und festzunageln jedes Ende so der Abschnitt leicht mit der mesenterialen Linie obersten gestreckt; Trim überschüssige Mesenterium. Mit ein Springbow Schere den Darm in Längsrichtung und Anschlussbelegung auf dem Weg.60; Fluten die Platte mit X-gal Fixativ, um die Abschnitte behandeln und lassen Sie für mindestens 1 Stunde bei 4 ° C. Entfernen X-gal Fixiermittel unter Verwendung einer 25 ml Pipette und einmal mit 30 ml 1X PBS zu waschen. Deckprofile mit 30 ml DTT demucifying Lösung für 30 – 60 min bei RT, idealerweise auf einem Wippschüttler. Entfernen demucifiying Lösung unter Verwendung einer 25 ml Pipette und überfluten die Platte mit 30 ml 1x PBS. Mit einer Pasteurpipette waschen die Darmabschnitten mit 1x PBS in der Platte, um Schleim zu entfernen. Entfernen 1x PBS mit einer 25 ml Pipette und Flut mit 30 ml X-Gal-Färbung. Inkubieren über Nacht bei RT im Dunkeln unter leichtem Schütteln auf einem Wippschüttler. Nach der Inkubation über Nacht Check, dass die Abschnitte haben eine blau / grün-Färbung entwickelt, wenn die Hintergrundfarbe ist immer noch weiß, frische Farblösung hinzugefügt und überwacht bis Färbung entwickelt werden. HINWEIS: Sobald Abschnitte dann gefärbt keine weitere Färbung kann versucht werden. Entfernen Sie die X-gal-FärbungVerwendung einer 25 ml Pipette und Flutplatte mit 30 ml 1x PBS und lassen für 3 min unter leichtem Schütteln. Stifte entfernen und abholen, mit einer Pinzette, das Ende einer Darmabschnitt. Wickeln Sie das Darms um die Zange, um ein "Swiss roll" bilden, sichern Sie die Rolle durch leichtes Öffnen der Zange und setzen eine 25 G-Nadel durch sie. Platzieren Gewebe in einem weiten Mund Flachbodenbehälter mit einer großen Überschuß neutral gepuffertem Formalin Fixiermittels, mindestens 10-fache Volumen der Fixierlösung zu dem Volumen des Gewebes. Platz Proben bei 4 ° C für mindestens 24 Stunden vor dem Einbetten und Schneiden. 6. Extraktion von Krypten aus Darm Isolieren Sie die ersten 20 cm des Dünndarms, gemäß Abschnitt 2. Legen Sie den Darm auf eine saubere Sezieren Oberfläche und mit einer Pinzette und Schere entfernen Sie alle angeschlossenen Fett / Mesenterium. Verwendung eines Springbow Schere öffnen Sie die gut in Längsrichtung. Mit einem Mikroskop Deckglas, firmly kratzen die Darmlumen zu Zotten und Schleim zu entfernen. Mit einer Schere schneiden Sie den Darm in ~ 5 mm Stücke und Überführung in ein 50 ml Röhrchen mit 25 ml 1x HBSS ergänzt mit Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 U / ml). Inkubation für 10 min bei RT. Entfernen Sie das Antibiotikum enthaltenden Medien, indem die Proben durch einen 70 & mgr; m Zellsieb. Zeigen Darmabschnitte in ein frisches 50 ml Röhrchen mit 10 ml 1x HBSS und ersetzen Sie die Kappe. Vorsichtig umdrehen zweimal und entfernen Sie die 1x HBSS indem sie durch ein 70 & mgr; m Zellsieb. Weitere waschen die Darmstücke durch Wiederholung 6.4 & 6.5 dreimal und sicherzustellen, dass die letzte Fraktion ist relativ klar. Bringen Gewebe in ein frisches 50 ml Röhrchen mit 10 ml EDTA (8 mm) / 1x HBSS und lassen bei Raumtemperatur für 5 min. Durch kräftiges Schütteln (20 – 30x) oder Wirbel, durch ein 70 & mgr; m Zellsieb und Transfergewebestücke übergeben, um ein frisches 50 ml Röhrchen mit EDTA (8 mm) / 1x HBSS. HINWEIS:Die Strömung durch kann entweder verworfen oder beibehalten werden, sofern Analyse der Zotten Epithelien erforderlich ist. Die Gewebestücke auf Eis für 30 min inkubieren, schütteln Sie die Probe kräftig (20 – 30x) oder Wirbel. Übergeben Sie die Proben durch eine 70 um Zellsieb und bewahren die Durchströmung, da dies enthält die Krypten. Übertragen Sie die Gewebestücke in ein frisches 50 ml Röhrchen mit 10 ml 1x HBSS. Durch kräftiges Schütteln (20 – 30x) oder Wirbel, durchlaufen ein 70 & mgr; m Zellsieb und die Durchströmung zu behalten. Wiederholen Sie noch einmal, um eine maximale Rückgewinnung von Krypten von Darmstücke zu gewährleisten. Kombinieren Sie die Durchflussfraktionen und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Gießen Sie den Überstand und behalten die Krypta Pellet. HINWEIS: Die Pellets können direkt für die Kultivierung verwendet werden (falls vorhanden) oder bei -80 ° C vor der Standard-DNA / RNA / Protein-Extraktionsverfahren gespeichert. 7. Standard immunhistochemische Visualisierung Schneiden 5 μm Abschnitte in Paraffin eingebetteten Gewebe auf mit Poly-L-Lysin (PLL) gleitet. Hinweis: Ein Standard-Protokoll für die Färbung mit einem B-Catenin-Antikörpers wird nachstehend angegeben, werden die Parameter für andere Antikörper in Tabelle 2 angegeben. De-Wachs mit 2x 3 min Waschen in Rutsche Bäder mit frischem Xylol. Rehydrieren, indem Folien für 3 Minuten durch Schiebe Bäder frischen enthält: 100% EtOH (2x), 95% EtOH und 70% EtOH und schließlich in 1x PBS. Die Objektträger in eine Folie enthaltendes Bad Citratpuffer (pH 6) und Wärme 99,9 ° C für 20 min, um Antigene zu erhalten. Lassen Sie Folien zu kühlen und dann waschen 3x 5 min in einer Dia-Bad, das 1xTBS / T für 5 min. Objektträger aus der letzten Wäsche sofort um Gewebe zu ziehen mit einem PAP Pen und Deckelabschnitt mit einem kommerziellen Peroxidase Block oder 1,5% H 2 O 2 (in destilliertem H 2 O). Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) dann waschen 3x in Rutsche Bäder mit frischem 1x TBS / T für 5 min. Nach dem Waschening Deckelabschnitte, mit einer Pipette, in 5% normalem Kaninchenserum (NRS) / 1xTBS / T für 30 min bei RT unspezifische hydrophobe Bindungs ​​Ihrer primären Antikörpers zu blockieren. Entfernen NRS Block mit einer Pasteurpipette und Deckelabschnitt in B-Catenin primäre Antikörper verdünnt 1: 200 mit 5% NRS. Wash gleitet für 3x 5 Minuten in der Folien Bäder mit frischen 1xTBS / T. Hinweis – andere Antikörper-Optimierung zur Verdünnung und Spezifität erfordern. Um die Spezifität eines Antikörpers zu gewährleisten, sollten geeignete keine Antikörper und Isotypkontrolle Flecken durchgeführt werden. Ein Isotyp-Kontrolle wird auf der Wirtsspezies und Isotyp des primären Antikörpers abgestimmt. Visualisieren entweder mit einem kommerziellen HRP-Nachweis-Kit oder mit einem geeigneten Fluoreszenz-markierten sekundären Antikörper (Tabelle 2). Anmerkung: Die Länge des Entwicklungs unterscheidet sich für jeden Antikörper, der für β-Catenin 10-15 sec in der Regel ausreichend. Die Entwicklung für einen Antikörper ersten est optimierenablish die Länge der Zeit, die zum positiven Zellen unter Verwendung eines positiven Steuerschieber zu visualisieren und dann gilt dies auch für alle nachfolgenden Dias. Wash gleitet für 3x 5 Minuten in der Folien Bäder mit frischen TBS / T. Gegenfärbung Objektträger durch in einer Diashow Bad mit Hämatoxylin für ~ 45 Sekunden Eintauchen (nicht erforderlich, wenn mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper). Legen Sie Folien in einen sauberen Objektträger Bad und spülen Sie mit fließendem Leitungswasser für ~ 1 min, die Gewährleistung der Hämatoxylin nicht vollständig ausgewaschen. Dehydrieren gleitet, indem sie durch Schiebe Bäder mit steigenden Konzentrationen von Alkoholen; 1x 30 Sekunden in 70% EtOH, 1x 30 Sekunden in 95% EtOH, 2 x 30 s Waschen in 100% EtOH, 2 x 2 min in Xylol. Berg rutscht unter einem Deckglas mit einem handelsüblichen Montage Medien. HINWEIS: Bei Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörper Halterung mit einem Medium, das DAPI, den Kern zu beschriften. 8. Die histologische Identifizierung spezifischer intestinal Epithelzellen Enterozyten Bereiten Abschnitte mit Abschnitt 7 mit der Villin Antikörper und Bedingungen in Tabelle 2 beschrieben. Entero-endokrine Zellen (Grimelius färben 18,19). Bereiten Abschnitte durch folgende Schritte 7,1-7,2. Wash Bildern in einer Diashow Bad mit hochreinem Wasser für 3 min. Die Objektträger in einen Objektträger Bad, das vorgewärmt Silberlösung (Tabelle 1) und Inkubation bei 60 ° C für 3 Stunden. Entfernen Sie die Folien aus der Silberlösung und in eine Rutsche Bad, das frisch zubereitet vorgeheizten Reduktionslösung (Tabelle 2) bei 45 ° C für 3 min. Entfernen Sie die Folien und in einen Objektträger Bad mit frischem hochreinem Wasser für 3 min. Führen Sie die Schritte 7,6-7,8 aus dem Abschnitt 7. Becherzellen (alcianblau). Bereiten Abschnitte durch folgende Schritte 7,1-7,2 .. Objektträger zu einer Folie Bad mit Alcian Blue pH 2,5 für 5 Minuten bei RT. Entfernen alcianblau mit einer Pipette und Ort Schiebe Bad unter fließendem Wasser für 3-5 min. Führen Sie die Schritte 7,6-7,8. HINWEIS: Alcianblau-Lösung kann zur weiteren Verwendung beibehalten werden. ISCs. Um festzustellen, die ISCs folgen Abschnitt 9. Paneth-Zellen. Bereiten Abschnitten folgende Abschnitt 7 mit der Lysozym-Antikörpers und die Bedingungen in Tabelle 2 beschrieben. 9. In-situ-RNA-Detektion mit dem murinen Darm 19-21 Zeigen 5 um Abschnitte von Formalin fixiert Darm (Abschnitt 3) auf PLL Rutschen. Bereiten Sie eine linearisiert Digoxigenin markierten RNA-Sonde zum Nachweis Olfm4 Ausdruck 21. Entwachsen und rehydrieren Abschnitten gemäß Abschnitt 7. Hinweis: Dieses Protokoll sollte in einem RNAse freien Umgebung durchgeführt, um den Abbau des RNA-Sonde zu verhindern. Zeichnen Sie in der Umgebung von tProblem mit einem PAP Pen Reagenzien zu minimieren. Inkubieren Abschnitte in einer Dia-Bad mit 6% H 2 O 2 (in destilliertem H 2 O) für 30 min. Zweimal waschen in einer Dia-Bad mit frischem 1x PBS für 3 min. Entsorgen Sie 1x PBS und mit einer Pipette, Deckabschnitt mit 4% Paraformaldehyd für 20 min auf Eis. Zweimal waschen in einer Dia-Bad mit frischem 1x PBS für 3 min. Mit einer Pipette Deckelabschnitte mit Proteinase K-Lösung für 5 min Waschen in einer Dia-Bad mit frischem 1x PBS für 3 min. Mit einer Pipette Postfix-Abschnitte durch Abdecken in 4% Paraformaldehyd für 5 min bei RT. In einer Dia-Bad mit DEPC waschen behandelten H 2 0 2 min. Mit einer Pipette Deckelabschnitte in Essigsäureanhydrid-Lösung für 10 Minuten unter Rühren. In einer Dia-Bad mit frischem 1x PBS / 3 min, gefolgt von Kochsalzlösung 1x / 3 min waschen. Übergeben Sie gleitet durch Bäder mit steigenden Konzentrationen von Alkoholen; 1x 30 s in 70% EtOH, 1x 30 s in 95% EtOH, 2x 30 s Waschen in frischem 100% EtOH,2x 2 min in frischem Xylol und an der Luft trocknen. Verdünnter Olfm4 Sonde 1: 100 in Hybridisierungspuffer und denaturieren Sonde durch Erhitzen auf 80 ° C für 3 min. Apply 100 ul Sonde an jedem Abschnitt und decken mit Parafilm zu Austrocknung des Schlittens zu verhindern. Inkubieren über Nacht in einem dunklen, feuchten Kammer bei 65 ° C. Waschen Sie in einer Diashow Bad mit 5 x SSC bei 65 ° C für 15 min. Waschen in einer Reiß Bad zweimal mit frischem 50% Formamid / 5 x SSC / 1% SDS für 30 min bei 65 ° C. Zweimaliges Waschen in einer Reiß Bad in frisches PBT für 10 min, das erste bei 65 ° C und die zweite bei RT. Mit einer Pipette Deckelabschnitte mit PBT, enthaltend 25 & mgr; g RNAse für 45 min bei 37 ° C. Waschen in einer Reiß Bad in PBT für 5 min bei RT. Waschen in einer Reiß Bad zweimal mit frischem 50% Formamid / 5 x SSC für 30 min bei 65 ° C. Zu blockieren, Deckelabschnitte mit einer Pipette mit 10% Schafserum in PBT und an einem dunklen, moist Kammer bei RT für 2 – 3 Stunden. Vorbereitung Antikörper durch Verdünnung anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase-konjugierter Antikörper bei 1: 500 mit 10% Schafsserum in PBT, enthaltend 5 mg / ml Maus-Darm-Pulver. Inkubation für 3 Stunden bei 4 ° C im Dunkeln auf einer Schwingplattform. Spin down, um überschüssige Darmpulver entfernen und 3x Volumina von 1% Schafserum in PBT zu dem Überstand. Entfernen Block von Folien mit einer Pipette und fügen Sie 100 ul der Antikörperlösung zu jedem Abschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation in einem dunklen, feuchten Kammer bei 4 ° C über Nacht. Waschen in einer Reiß Bades 3 × mit frischem PBT für 5 min. So blockieren Abschnitten waschen in einer Dia-Bad 3 x mit frischen NTMT Puffer für 5 min. Um sichtbar zu machen, mit einer Pipette auf jedes Teil mit BM purple und Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 bis 72 Stunden, bis eine ausreichend starke Farbe entwickelt. Waschen in einer Reiß Bad einmal in PBT und in Eosin für 1 min Eintauchen gegenfärben. Remove überschüssige Eosin durch Waschen in einer Reiß Bad unter einen Wasser für 3-5 min. Tauchen Sie Folien in Xylol und an der Luft trocknen. Montieren Sie unter einem Deckglas mit kommerziellen Medien. 10. Die histologische Charakterisierung Darmepithelien Zeigen 5 um Abschnitte aus dem festen Gewebe (Abschnitt 3 und 4) auf PLL Rutschen. Analysieren ≥25 zufälligen ganzen (oder halben ≥50) Krypten von ≥4 Mäusen jeder Kohorte für jeden der folgenden Parameter. HINWEIS: Um die Konsistenz zu analysieren Krypten aus dem gleichen Ort jedes Darm (nur das proximale Ende). Zellparameter von Standard H & E gefärbte Schnitte (wenn nicht anders angegeben): Crypt Zahl, Höhe, Apoptose und Mitose. Crypt-Nummer. Verwenden Sie eine niedrige Energievergrößerung (zB 4X oder 10X), die Anzahl der Krypten in Kontakt mit der basalen Schicht von Hand zählen. Graf ≥10 quer proximalen Darm-SekteIonen von mindestens 4 Mäusen. Crypt Höhe. Verwenden Sie eine hohe Leistung Vergrößerung (zB 20X oder 40X), die Anzahl der Zellen vom Boden der Krypta in die Krypta / villus Achse (Abbildung 3b) manuell zu zählen. Apoptose 22, 23. Methode 1: Verwenden Sie eine hohe Leistung Vergrößerung (zB 20X oder 40X.), Die Zahl der apoptotischen Zellen in jeder Krypta von Hand zählen. Apoptotische Zellen durch Zellschrumpfung, Chromatinkondensation, die Bildung von Bläschen und zytoplasmatischen apoptotischen Körpern (3a) identifiziert werden. Methode 2: Führen Sie eine IHC-Färbung (Abschnitt 7) für die Caspase-3 unter Verwendung von in Tabelle 2 beschriebenen Bedingungen unter Verwendung eines Hochleistungsvergrößerung (zB 20X oder 40X.) Die Anzahl der positiven Zellen manuell zählen in jedem Krypta, um die Zellen in der zu quantifizieren. Ausführungsphase der Apoptose. Mitose. <ol> Verwenden Sie eine hohe Leistung Vergrößerung (zB 20X oder 40X), die Zahlen von mitotischen Zellen in jeder Krypta von Hand zählen. Mitotischen Zellen enthalten kondensierte DNA-Material und sind typischerweise symmetrisch und gut geformt (Figur 3b). Proliferation. Führen Sie eine IHC (Abschnitt 7) Fleck für Ki-67 unter Verwendung von in Tabelle 2 beschriebenen Bedingungen. Manuelles zählen positiven Zellen, den Anteil der Krypta-Zellen vermehren zu quantifizieren.

Representative Results

Vergleicht ISC Rekombinationseffizienz im Ah-cre und Vil-Cre-ER T2 Systeme Verwendung dieser cre-lox-Systeme zur Bewertung der Rolle von Paneth-Zellen, in Repopulation des Darms nach einer Beschädigung, erforderliche Charakterisierung der Effizienz der Rekombination innerhalb der ISCs. Verwendung des Rosa26R-lacZ bedingten Reporter wir gezeigt, daß in beiden Systemen 3 Tagen nach der Induktion (dpi) ist ~ 100% Rekombination in den Dünndarm (Abbildung 1a). Quantifizieren der Anwesenheit von rekombinierten Allel durch qPCR wurde durch die Unterschiede der Cre-Expressionsmuster zwischen den Systemen verwechselt. Die vIL-Cre-ER T2 System zeigte eine 3,53 fachen Anstieg in der Gegenwart des rekombinierten Allel im Vergleich zum Ah-cre Systems sind wegen seiner Expression in einem größeren Anteil des epitheliein 16. Um dies zu überwinden wir nahm eine andere Strategie, die es uns ermöglicht, direkt zu vergleichen, die Systeme. Wir induzierte die Mäuse mit unterschiedlichen Induktionsregime und analysiert bei 30 dpi, an welcher Stelle LacZ positive Krypten und Zotten stellen eine ISC Rekombinationsereignis. Mit diesem Ansatz haben wir gezeigt, dass in beiden Systemen, 3 Injektionen von Induktionsmittel (geliefert IP bei 80 mg / kg in 24 h), trotz anfänglicher Rekombination Ebenen in der vil-Cre-ER T2 weit größer in eine äquivalente Anzahl von ISCs rekombiniert System 16 (Figur 1b-d). Ferner wurde unter Verwendung von rekombinierten DNA extrahiert Krypten, qPCR für rekombinierten Allele zeigten eine nicht-signifikante Erhöhung der Rekombination mit dem vil-Cre- ER T2 System potentiell aufgrund der Rekombination in den Panethzellen Verwendung des Ah-cre System nicht beobachtet (Abbildung 1d). Ferner Färbung für Epithelien Zelltypen nicht indiCate jede Veränderung Differenzierungsmuster wird repräsentative Bilder von jedem Zelltyp untersucht in 2e-2h gezeigt. Charakterisierung von Darmepithelien folgenden CatnB Löschen Die Quantifizierung der Crypt-Verlust Charakterisierung der Kinetik der Rekombination in diesen Cre-Systeme konnten wir die Mausdarm zu analysieren, wenn äquivalente Anzahl von ISCs rekombiniert werden. Verwendung des lacZ-Reporter beide Systeme zeigte den vollständigen Verlust der rekombiniert (blau) Zellen bei 3 dpi (Abbildung 2a). Wie bereits drei Tage nach Löschung der CatnB berichteten die Ah-cre Mäuse zeigten Teil Krypta Verlust, während die vil-Cre-ER T2 Mäusen gezeigt vollständige Zerstörung der Krypta / villus Achse 13,16,24 (Abbildung 2b-d). </p> Dynamik der Epithelial Wiederbelegung Unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken befinden wir mehrere Parameter, damit wir diese Beobachtung zu verstehen. Repräsentative Bilder der Parameter und Zelltypen analysiert unter Verwendung von Protokollen 7-10 sind in (3a & 3b). Kurz gesagt, wurde der Verlust der Krypten, die mit den erhöhten Werten von Apoptose in beiden Systemen (Abbildung 3e) angezeigt. Allerdings ist die Mitose, Proliferation, Krypta Zellhöhe, Krypta und Ausdruck (nicht dargestellt) Daten zeigten die Ah-cre-System könnte zu erholen, was vermutlich auf Wiederbesiedlung durch un-rekombiniert ISCs (Abbildung 3c). Im krassen Vergleich die vil-Cre-ER T2 versäumt, trotz Beibehaltung epithelialen Krypta-Zellen (Abbildung 3d) zu erholen. Charakterisierung zellulärer Phänotypen innerhalb Crypt Um zu verstehen, warum die Krypten von Ah-cre Mäusen konnte wieder zu bevölkern, während die vil-Cre-ER T2 konnten wir dadurch die Epithelzellen drei Tage nach Löschung der CatnB. Verwendung in situ Hybridisierung (Abschnitt 9) und IHC-Analyse (Abschnitt 7, 8 und 10) haben wir gezeigt, dass die Krypta-Zellen in den vil-Cre-ER T2 CatnB flox / flox Mäuse waren nicht-proliferative und es fehlte die Expression des ISC Marker Olfm4 , im Gegensatz zu den Krypten in den Ah-cre-Mäuse (4c & f). Als anfängliche Charakterisierung hatten gezeigt, daß die Rekombination in Krypten entsprach wir fort, die Rolle der Panethzellen untersuchen. Wir führten eine duale Fluoreszenz-IHC gegen CatnB und Lyz1 zu identifizieren, welche Zellen β-Catenin verloren hatte und ob sie Paneth Zellen (5a bis 5c). Wie zuvor beschrieben wir demonstrated dass alle Krypta-Zellen werden mit Hilfe der vil-Cre-ER T2-System ausgerichtet. Im Vergleich verschont die Ah-cre System die Paneth-Zellen und die Zotten Epithelien. Weitere Paneth-Zellen wurden nur beobachtet, die einer Apoptose nach CatnB Löschen mit der vil-Cre-ER T2-System (Abbildung 5d & 5e). Abbildung 1: Vergleich der Spezifität und Effizienz des Cre / lox-Rekombination im Darmepithelien mit dem Ah-cre und Vil-Cre-ER T2 Systems (a):. Visualisierung von Ah-cre LacZ Reporterexpression in wholemount kleinen (SI; * distalen Ende) und große (LI; * distalen Ende) von einer Wildtyp-Maus. (b): Die Ergebnisse der qPCR zeigt fache Veränderung für die rekombiniert CatnB flox Allel in 1 dpi zu unterschiedlichen Induktionsregime in Ah-cre CatnB flox / flox (BNF induziert) zu vergleichen und vil-Cre-ER T2 CatnB flox / flox (TAM induzierte ); * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] im Vergleich zur Kontrolle). (c) – (e):.. Wholemount Dünndarms, die LacZ positive Krypta 30 dpi Panel (b) – (e) von Parry et al 16 modifiziert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Vergleich der Ah-cre und Vil-Cre-ER T2 <strong> Systeme für Bedingt Löschen CatnB im Dünndarm Epithelien (a):. Wholemount Dünndarm zeigt Verlust der rekombinierten Zellen in Ah-cre CatnB flox / flox LacZ + Mäusen über 3 Tage. (b): Die Quantifizierung der Krypta Verlust von 3 Tagen nach Löschung der CatnB; * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] im Vergleich zur Kontrolle). (C und D): Quer H & E Abschnitten Formalin fixiert Darm demonstrieren Verlust der Krypten nach CatnB Löschen. (e) – (h) Beispiel von Zelltypen von Kontrollmäusen: (e) entero-endocriine Zellen, (f) den Becherzellen, (g) CatnB IHC Anzeigen eines ISC (→) mit Kern B-Catenin und (h) Paneth Zellen. Panel (b) von Parry et al. 16 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <p class="jove_content" fo:keep-to gether.within-page = "always"> Abbildung 3: Charakterisierung der Beginn der Phänotyp bei der Verwendung des Ah-cre und Vil-Cre-ER T2 Systeme für Bedingt Löschen CatnB in Ähnliche Zahlen von ISCs innerhalb der Dünndarm-Epithel (a & b) H & E gefärbten Formalin fixiert Abschnitte der Lage der Krypta. Höhe ([), eine apoptotische (←) und mitotischen Zelle (↓). Die Quantifizierung der durchschnittlichen Anzahl der Zellen pro crypt zwischen Wildtyp (blau) und CatnB flox (orange) Mäusen zu drei Zeitpunkten (dpi) (c) crypt Höhe, (d) die Mitose und (e) die Apoptose (Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung ). Tafel (c) – (e) von Parry et al 16 modifiziert.3429fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abb. 4: Vergleich der ISC Merkmale mit Ah-cre und Vil-Cre-ER T2 Systeme für Bedingt Löschen CatnB im Dünndarm Epithel Epitheliale Kryptenzellen 3 Tage nach dem Löschen von CatnB mit dem Ah-cre (ac) oder Villa Cre-ER T2 (df) System. (A & D), H & E Schnitt, der Bereiche der Krypta Verlust; (B & D), Ki-67 IHC demonstrieren Verlust der proliferativen Zellen unter Verwendung von vil-Cre-ER T2; (C & F) Olfm4 in situ Nachweis Anwesenheit von funktionellen ISCs mit Ah-cre. Panel (a.) – (f) von Parry et al 16 modifiziert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5: Charakterisierung der Paneth Zellen nach CatnB Deletion mit den Vil-Cre-ER T2 und Ah-cre-Systeme (AC):. Immunfluoreszenzbilder von Krypten, die Paneth Zellen (rot), B-Catenin (grün) und Kern (blau ), Pfeil entsprechend membrangebundenen β-Catenin; (de) IHC für die Caspase-3 anzeigt apoptotischen Paneth-Zellen fehlen in der Ah-cre (d), aber in der vorliegenden vil-Cre-ER T2-System (e). Tafel (a) – (e) aus modifiziertemParry et al 16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Acetat-Puffer * * Auf 100 ml 4,8 ml 0,2 M Essigsäure, 45,2 ml 0,2 M Natriumacetat und 50 ml destilliertem Wasser Essigsäure Fisher Scientific C / 0400 / PB17 Essigsäureanhydrid Sigma A6404 Essigsäureanhydridlösung * * 2 M Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolamin-Hydrochlorid Alcianblau Sigma A5268 Alcianblau pH 2,5 * * </td> Auf 500 ml zu machen: 15 ml Essigsäure, 5 g Alcianblau und 485 ml destilliertem Wasser, Anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase-konjugierter Antikörper Abcam ab119345 B (beta) -Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, zu injizieren, ohne dass die Lösung zu sehr abkühlen als Verbindung aus der Lösung fallen zu lassen. Lösung kann wiederverwendet werden – bei -20 ° C zwischen den Anwendungen, nicht aufwärmen mehr als das Doppelte. Bloxall Vector Labs SP-6000 BM purple Roche 11442074001 BSA Sigma A4503 Rinderserumalbumin Chloroform Fisher Scientific C / 4920/17 Citrat-Puffer / Antigen Demaskierung Lösung Vector Labs H-3300 Maisöl Sigma C8627 Demucifiying Lösung * * Für 500 ml: 50 ml Glycerin, 50 ml Tris pH 8,8 0,1 M, 100 ml EtOH, 300 ml Salzlösung (0,9% NaCl in Wasser), 1,7 g DTT. Demucifying Lösung kann im Voraus gebucht werden und gespeichert, aber DTT sholud kurz vor Inkubation (340 mg / 100 ml) hinzugefügt werden. DEPC behandeltem Wasser Life Technologies 750.023 DTT Sigma 101509944 EDTA Sigma O3690 0,5 M Ethanol Fisher Scientific E / 0650DF / 17 Filterpapier Welcher Mann 3000917 Formaldehyd Sigma F8775 Formalin Sigma SLBL11382V Neutral gepuffertem Formalin Formamid Sigma F5786 Glutaraldehyd Sigma G6257 H 2 O 2 Sigma 216.763 HE Raymond A Lamb 12698616 HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2) Hybridisierungspuffer * * 5 × SSC, 50% Formamid, 5% SDS, 1 mg / ml Heparin, 1 mg / ml Kalbsleber-tRNA Hydrochinon Sigma H9003 ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105 <tr> Immpress HRP Anti-Maus-IgG-Kit Vector Labs MP-7402 Immpress HRP-Anti-Kaninchen-IgG-Kit Vector Labs MP-7401 Darmgewebe Pulver * * Dünndarm von 5 erwachsenen Mäusen wurden vereinigt und homogenisiert in einem minimalen Volumen eiskaltem PBS. 4 Volumina eiskaltem Aceton wurden zu der homogenisierten Darm, die gründlich gemischt und auf Eis für 30 min inkubiert wurde. Dieses wurde zentrifugiert, und das Pellet wurde mit eiskaltem Aceton gewaschen. Dies wurde weiter zentrifugiert und das resultierende Pellet auf Filterpapier ausgebreitet und trocknen gelassen. Sobald gründlich trocknen das Material wurde zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel gemahlen. K-Ferricyanid Sigma P-3667 K-Ferrocyanid Sigma P3289 </tr> Levamisol Sigma L0380000 Methacarn * * 60% Methanol: 30% Chloroform: 10% iger Essigsäure Methanol Fisher Scientific M / 4000/17 MgCl2 Sigma M8266 Normales Ziegenserum Vector Labs S-1012 NGS Normales Kaninchenserum Dako X0902 NRS NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl 2, 0,1% Tween 20, 2 mM Levamisol PAP Pen Vektor H-400 Para Sigma P6148 PBT * * 0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20 Penicillin / Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x) Fisher Scientific BP3994 Verdünnte 1:10 mit destilliertem Wasser auf 1x machen PLL Dias Sigma P0425-72EA Poly-L-Lysin-Objektträger Proteinase K Sigma P2308 Proteinase K-Lösung * * Verdünnter Proteinase K bei 200 ug / ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA. Ralwax BDH 36154 7N Reducer Lösung * * 1 g Hydrochinon, 5 g Natriumsulfit und 100 ml destilliertem Wasser: auf 100 ml RNaseA Sigma R6148 </ td> Salzig * * 0,9% NaCl in destilliertem Wasser SDS Sigma I3771 Schafserum Sigma S3772 Silber Nitrat Sigma S / 1240/46 Silberlösung * * 10 ml Acetatpuffer, 87 ml destilliertem Wasser, 3 ml 1% Silbernitrat: auf 100 ml Natriumacetat Fisher Scientific S / 2120/53 Natriumchlorid Sigma S6753 NaCl Natriumsulfit Sigma 239.321 SSC Sigma 93.017 20x Kochsalzlösung Natriumcitrat Chirurgischen Band Fisher Scientific 12960495 Tamoxifen Sigma T5648 TAM, zu injizieren, ohne dass die Lösung zu sehr abkühlen als Verbindung aus der Lösung fallen zu lassen. Lösung kann wiederverwendet werden – bei -20 ° C zwischen den Anwendungen, nicht aufwärmen mehr als das Doppelte. TBS / T Zelluläre Signaltransduktion # 9997 Triethanolaminhydrochlorid Sigma T1502 Tris-HCl Invitrogen 15567-027 Tween20 Sigma TP9416 VectaMount Vector Labs H-5000 Vectashield Hardset Eindeckmedium mit DAPI Vector Labs H-1500 Vectastain ABC Kit Vectoder Labs PK-4001 X-gal Promega V3941 X-gal Fixiermittel * * 2% Formaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd in 1xPBS X-Gal-Färbung * * X-Gal-Färbung; 200 & mgr; l X-gal (A) in 50 ml Lösung B (0,214 g MgCl 2, 0,48 g K-Ferricyanid, 0,734 g K-Ferrocyanid in 500 ml PBS). Lösung B kann bis oin Voraus bei 4 ° C vorgenommen und gespeichert werden Xylol Fisher Scientific X / 0200/21 Tabelle 1: Materialien und Methoden Ziel beta-Catenin Lysozym Ki67 Caspase-3 Villin Kommerzielle Quelle für Primär Ab Transduction Labs NeoMarkers Vector Labs R & D Systems Santa Cruz Art.Nr. 610.154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672 Primäre Ab hob in Mouse (mAb) Kaninchen (PAB) Mouse (mAb) Kaninchen (PAB) Goat (PAB) Antigen-Retrieval Siedenden Wasserbad / Citratpuffer Siedenden Wasserbad / Citratpuffer Siedenden Wasserbad / Citratpuffer Siedenden Wasserbad / Citratpuffer Siedenden Wasserbad / Citratpuffer Peroxidase Block Bloxall oder 2% H 2 O 2, 45 sec Bloxall oder 1,5% H 2 O 2, 30 min Bloxall oder 0,5% H 2 O 2, 20 min Bloxall oder 2%H 2 O 2, 45 sec Bloxall oder 3% H 2 O 2, 20 min Serum-Block 1% BSA, 30 min 10% NGS, 30min 20% NRS, 20 min 10% NGS, 45 min 10% NRS, 30 min Waschpuffer PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T Bedingungen für Primär Ab 1/300, 2 h bei RT 1/100, 1 h bei RT 1/50, 1 h bei RT 1/750, O / N bei 4 ° C 1/500, 1 h bei RT Sekundär Ab Immpress HRP Anti-Maus-IgG-Kit Immpress HRP-Anti-Kaninchen-IgG-Kit Biotinylierten Kaninchen-Antimaus Biotinylierten Ziege anti-Kaninchen Biotinylierten Kaninchen anti-Ziege Bedingungen für Sekundär Ab 1 h bei RT 30 min bei RT <t d> 1/200, 30 min bei RT 1/200, 30 min bei RT 1/200, 30 min bei RT Signalverstärkung N / A N / A ABC-Kit ABC-Kit ABC-Kit Signalerkennung ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase Immunfluoreszenz-Antikörper AlexaFluor 488 AlexaFluor 594 N / A N / A N / A Immunfluoreszenz-Eigenschaften Anregungs Max 488 / Emissions-Max 525 Anregungs Max 595 / Emissions-Max 617 Gemeinsame Filter-Set FITC Texas Red Inhalt "> Tabelle 2: IHC Antikörper Bedingungen

Discussion

Verwendung bedingter cre-lox-transgenen Mäusen, die Funktion der Gene und Zellen zu zerlegen ist ein häufig verwendeter Ansatz. Diese Modelle sind mit großem Erfolg im Darm verwendet worden, um zu identifizieren und zu charakterisieren, die Stammzellen 2,4-6 und zu verstehen, ihre Rolle bei der Krankheit 25. Diese Modelle voll auszuschöpfen erfordert eine umfassende Charakterisierung des Systems zu ermöglichen, dass Daten richtig interpretiert werden. Ein vollständiges Verständnis dieser Systeme ist schwierig zu erreichen, aufgrund von Genen nur selten spezifisch für eine Einzelzelle Typ oder Ort, einer geringen biologischen Erkenntnisse und Ineffizienz der verwendet wird, um Cre Expression zu induzieren Systeme. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, wie wir diese Probleme durch experimentelle Gestaltung und Anwendung des vorhandenen Wissens zu überwinden. Obwohl wir diese Methoden verwendet werden, um eine spezifische Fragestellung der hier vorgestellten Techniken sind generisch und kann für jede Forschung Untersuchung der Muri ausgenutzt werden, zu beantwortenne Darm.

Vorbereitung der Darmgewebe

Der entscheidende Schritt für die Gewährleistung robustere Ergebnisse ist die Ernte und Verarbeitung des Gewebes, die zeitnah und Fixierung Protokolle genau eingehalten verarbeitet werden muss. Da fast alle wichtigen Fragen können stromabwärts zu Artefakten mit dem Gewebe Austrocknen und / oder unvollständige Fixierung zugeordnet zurückzuführen. Timing ist entscheidend, um eine Verschlechterung der Gewebearchitektur und / oder Nukleinsäuren und Proteinen zu verhindern. Unvollständige oder übereifrigen Fixierung kann zum Verlust der histochemischen Auflösung führen. Unvollständige Fixierung aufgrund unzureichender Zeit oder Abschnitte zu dick, um zu ermöglichen Fixiermittel Penetration kann zu einem Verlust der Auflösung innerhalb der Darmkrypten, die als "Wassermarke" auf IHC-Analyse beobachtet werden kann, führen. Weiterhin ist es wichtig, dass Fixierung nicht zu lange zu verlängern, wie kern β-Catenin aus dem Zellkern, sofern nicht sofort pro diffundierenbeitet und Wachs eingebettet folgenden Formalinfixierung.

Rolle der Paneth-Zellen in der ISC-Nischen-

Die hier vorgestellten Daten effektiv zu zeigen, wie wichtig die Paneth-Zellen in Krypta Regeneration im adulten Darm folgenden ISC Verlust. Allerdings blieb die Möglichkeit, dass Ah-cre erspart eine Bevölkerung von ISCs dass vil-Cre-ER T2 Ziele. Tian et al. 26 elegant gezeigt, dass die Lgr5 hallo ISCs werden von einer Bevölkerung von Lgr5 lo Reserve ISCs ersetzt. Es scheint nun wahrscheinlich, dass diese ISCs in der Ah-cre-System aufgrund der Reservepopulation, die als sekretorischen Zellvorläufer 6,7 identifiziert verschont. Die Bedeutung des reifen Paneth Zelle bei der Unterstützung dieser sekretorischen Zellvorläufer bei Bedarf zu einem ISC Zustand zurück bleibt unbeantwortet. Wie Paneth-Zellen bilden die ISC Nischen 8 und spielen eine Rolle bei der Regulierung der ISC-Antworten, die Kalorienaufnahme 27 und Entzündung 28 bleibt es wahrscheinlich, dass ihre Pflegefunktionen, um ihre eigenen Vorprodukte zu verlängern.

Neue Konzepte und Technologien zur effektiven Modell Menschen Darmkrebs

Die Entdeckung des ISC führte zur Identifizierung von Genen, die nun verwendet werden, um neue Mausmodelle für die Untersuchung der Rolle der Gene und Zellen in Darm-Biologie und Erkrankung durch Clarke et al 9 Bewertung zu erzeugen. Die einzigen Einschränkungen dieser Technik ist die Identifizierung von Genen, die Cre-Protein zu exprimieren. Derzeit ISCs werden routinemäßig untersucht mit Hilfe von bedingten transgenen Mäusen auf der Grundlage der Lgr5 Genexpressionsmuster. Mäuse, die Cre vom Lgr5 Promotors exprimieren, wurden verwendet, um APC, das Gen am häufigsten bei Darmkrebs mutiert (CRC zu löschen), Was die ISC als Ursprungszelle 25. Selektiven Löschen anderer CRC-Gene in diesen Zellen wird einen Einblick in den Krankheitsverlauf und die Ausbreitung z. PTEN 29. Weitere Einblicke in ISC-Funktion wird von speziell Abtragen Lgr5 exprimierenden Zellen in Mäusen mit einem menschlichen Diphtherie-Toxin-Rezeptor abgerufen (DTR) Gen klopfte in die Lgr5 Locus 26. Andere Strategien nutzen die Tet-A-System, das laufende reversible Expression der mutierten Proteine ​​30 ermöglicht. Mit Hilfe dieser Werkzeuge, um Gen (en) in verschiedenen Zellen 31 und Standorte 32,33 ändern wird verwendet, um zu verstehen, wie Krebs auslösen, Fortschritt und metastasieren 34. Alternativ Mutagenese mit dem Transposon Sleeping Beauty System ist die Identifizierung neuer Fahrer von CRC. Die Weiterentwicklung von Mäusen, Techniken und genetische Veränderung Strategien weiterhin mehr Patienten relevanten Modelle zu entwickeln.

New methoden wurden zur Charakterisierung der Darmepithelien und ISCs entwickelt. Charakterisierung des Verhältnisses der epithelialen Zelltypen können mit Strömung erreicht werden Zytometrie auf die differentielle Expression von Lectin und CD24 35 basierend. Möglicherweise der größte Fortschritt in der ISC Verständnis der Biologie und ihre Rolle bei der Krankheit mit der ex vivo organoiden Kultursystem 36 durchgeführt werden. Dieses System erlaubt es normalen und malignen ISCs zu Kultur in 3D, wo sie zu replizieren und zu differenzieren in einem physiologisch relevanten Art und Weise. Es ist zu hoffen, dass diese direkte Prüfung von Arzneimitteln am Patientenproben in vitro zu ermöglichen und damit den Weg für die personalisierte Medizin 37.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood and Sylvie Robine. This work was funded by a programme grant from Cancer Research UK.

Materials

Acetate buffer * * To make 100ml: 4.8ml 0.2M Acetic acid, 45.2ml 0.2M Sodium acetate & 50ml distilled water
Acetic acid Fisher Scientific C/0400/PB17
Acetic anhydride Sigma A6404
Acetic anhydride solution * * 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride
Alcian Blue Sigma A5268
Alcian Blue ph2.5 * * To make 500ml: 15ml acetic acid, 5g Alcian Blue & 485ml distilled water
anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody Abcam ab119345
B(beta)-Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20°C between uses, do not reheat more than twice.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM purple Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovine serum albumin
Chloroform Fisher Scientific C/4920/17
Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution Vector Labs H-3300
Corn oil Sigma C8627
Demucifiying solution * * For 500ml: 50ml glycerol, 50ml Tris 0.1M pH8.8, 100ml EtOH, 300ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7g.  Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340mg/100ml).
DEPC treated water Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5M
Ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17
Filter paper Whatman 3000917
Formaldehyde Sigma F8775
Formalin  Sigma SLBL11382V Neutral buffered formalin
Formamide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H2O2 Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisation buffer * *  5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA
Hydroquinone Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vector Labs MP-7401
Intestinal tissue powder * * The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 minutes. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. 
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanide Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid
Methanol Fisher Scientific M/4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal goat serum Vector Labs S-1012 NGS
Normal rabbit serum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole
PAP pen Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0.5M NaCl, 10mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphate buffered saline (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x
PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine microscope slides
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k solution * * Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Solution * * To make 100ml: 1g Hydroquinone, 5g sodium sulphite & 100ml distilled water
RnaseA Sigma R6148
Saline * * 0.9% NaCl in distilled water
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Silver nitrate Sigma S/1240/46
Silver solution * * To make 100ml: 10ml Acetate buffer, 87ml distilled water, 3ml 1% silver nitrate
Sodium acetate Fisher Scientific S/2120/53
Sodium Chloride Sigma S6753 NaCl
Sodium sulfite Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saline sodium citrate
Surgical tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20°C between uses, do not reheat more than twice.
TBS/T Cell Signalling #9997
Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vector Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixative * * 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1xPBS
X-gal stain * * X-gal stain; 200ul X-gal (A) in 50ml solution B (0.214g MgCl2, 0.48g K-ferricyanide, 0.734g K-ferrocyanide in 500ml PBS).  Solution B can be made up oin advance and stored at 4°C
Xylene Fisher Scientific X/0200/21
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References

  1. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
  2. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  3. Clevers, H. . The gut, a clonal conveyor belt. , (2015).
  4. Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  5. Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
  6. Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
  7. Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
  8. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
  9. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
  10. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  11. Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
  12. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  13. Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
  14. Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).
  15. Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
  16. Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
  17. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  18. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  19. Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
  20. Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
  21. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  22. Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
  23. Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
  24. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  25. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  26. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  27. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
  28. Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
  29. Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
  30. Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
  31. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  32. Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
  33. Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
  34. Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
  35. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
  36. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  37. van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

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Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).
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