JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Protocollen voor het analyseren van de rol van Paneth Cellen in het regenereren van de muizen darm met behulp van voorwaardelijke<em> Cre-lox</em> Mouse Modellen

Published: November 21, 2015
doi:
10.3791/53429
, , ,
1European Cancer Stem Cell Research Institute,Cardiff University, 2Institut Curie

Summary

Intestinale epitheliale stamcellen (ISC) worden vermengd met Paneth cellen. Deze cellen zijn gedifferentieerd nageslacht van de ISC, die ISC ondersteunen en antibacteriële bescherming. Hier laten we zien hoe we gebruikten conditionele transgene muismodellen aangetoond dat Paneth cellen spelen een cruciale rol bij het handhaven van de intestinale epitheel.

Abstract

De epitheliale oppervlak van het zoogdier darm is een dynamisch weefsel dat elke vernieuwt 3 – 7 dagen. Inzicht in dit vernieuwingsproces identificeerde een populatie snel delende intestinale stamcellen (ISC) gekenmerkt door hun expressie van de Lgr5-gen. Deze worden ondersteund door een rustende stamcelpopulatie gekenmerkt door Bmi-1 expressie kan te vervangen bij schade. Onderzoek naar de interacties tussen deze populaties is cruciaal voor het begrijpen van hun rol in ziekte en kanker. Het ISC's bestaan ​​binnen crypten op de intestinale oppervlak, deze niches ondersteunen de ISC in het aanvullen van het epitheel. De interactie tussen actieve en latente ISC waarschijnlijk ook door andere gedifferentieerde cellen in de niche, zoals eerder is aangetoond dat de 'stemness' 'van de Lgr5 ISC nauw verbonden met de aanwezigheid van hun naburige Paneth cellen. Voorwaardelijke cre-lox muismodellen die het effect van verwijderen van de meeste actieve ISCs in aanwezigheid of afwezigheid van de Paneth cellen getest. Hier beschrijven we de technieken en analyse uitgevoerd om de darm te karakteriseren en aantonen dat de Paneth cellen spelen een cruciale rol binnen de ISC niche in de hulp herstel na forse belediging.

Introduction

Het luminale oppervlak van de zoogdieren darm functies herhalende eenheden van de crypten en vinger uitsteeksels, darmvlokken genoemd, die uitsteken in het lumen. Dit oppervlak is een continu vel epitheel die volledig zelf-vernieuwing ondergaat ongeveer elke 3-4 dagen 1. Deze dynamische weefsel wordt ondersteund door een populatie snel delende stamcellen (ISC, ook bekend als crypt base cilindrische cellen), die initieel werden geïdentificeerd door hun expressie van het gen Lgr5 2,3. Deze cellen bestaan ​​in een niche onderin de crypten van Lieberkuhn. Aanvankelijk de ontdekking dat ISCs snel waren fietsen was discordant de heersende gedachte dat een stamcel was rustig karakter. Voorafgaand aan de identificatie van de Lgr5 + ISC werd gepostuleerd dat een populatie van rustende label behouden cellen op de 4 positie ten opzichte van de basis van de crypte waren ISCs 1. Recent onderzoek hzoals nu deze waarnemingen verzoend door aan te tonen dat in de eerste plaats is er een pool van equipotente fietsen ISC's in elke crypte wier lot worden gereguleerd door zijn buren 4,5. In het geval ze verloren deze kunnen worden vervangen door slapende cellen die gewoonlijk zich inzetten voor de secretie lineage maar kan terugkeren naar ISC's als de ISC bevolking is beschadigd 6.

ISC buren kan zowel ISC's of hun dochter cellen. De ISC produceren naïeve dochtercellen die vermenigvuldigen en differentiëren tot gespecialiseerde celtypes die de epitheliale sheet welke lijnen het darmlumen 1 omvatten. De beker, entero, enterocyten, tuft en M migreren omhoog naar het luminale oppervlak waar zij verschillende absorberende en regulerende functies, maar de Paneth cellen blijven aan de onderkant van de crypte waar deze bestaan ​​vermengd met de ISC. In de afgelopen jaren is aangetoond dat een deel van de naïeve daughter cellen die bestemd zijn voor een secretorische afkomst zijn latente label behoud Lgr5 lo cellen die in staat terug te keren naar een ISC op letsel 6,7.

Vanwege het belang ervan in crypte regeneratie prioriteit op het begrijpen van de interactie tussen de ISC en zijn buren, met name het Paneth cellen geplaatst. De Paneth cellen spelen een cruciale rol in de niche waarin het ISC 8 ondersteunt. Naast bacteriedodende producten produceren Paneth cellen signaalmoleculen die de routes die ISC verlenging of differentiatie regelen activeren. Eerdere studies toonden aan dat de Lgr5 + ISCs kon alleen bestaan ​​als ze kunnen concurreren voor essentiële niche signalen die door hun dochter Paneth cellen 8. Deze studies onderzochten de rol van Paneth cellen op normale Lgr5 + ISC en niet in een situatie waarin ze beschadigd en vereisen aanvulling van een Lgr5 lo populatie.

<pclass = "jove_content"> Om te begrijpen intestinale biologie en modelziekte onderzoeken we de functionele rol van de cellen en / of genen met behulp van transgene muismodellen 9,10. Vaak deze modellen maken gebruik cre-lox technologie voorwaardelijk gen (en) 9,10 wijzigen. Cre (Oorzaken recombinatie) recombinase is een plaatsspecifiek recombinase van de integrase familie, geïsoleerd van bacteriofaag P1. Cre katalyseert plaatsspecifieke recombinatie tussen bepaalde 34 bp ' Lox P '(locus χ van crossover P1) sites. Muizen genetisch gemanipuleerd om LoxP sites die gebieden van belang dat bij expressie van Cre recombinase worden uitgesneden flankeren bevatten. Het koppelen van expressie van het Cre-gen aan een cel of ontwikkelingsstoornis specifieke promoter maakt veranderingen worden gemaakt op een manier ruimtelijk 9,10, dit is vooral nuttig bij het ​​overwinnen van embryonale letale mutaties. Verder koppelen de Cre expressie van een receptor route,dat kan kunstmatig worden geactiveerd, maakt tijdelijke wijzigingen.

Met behulp van deze technologie die we geïnactiveerd de CatnB gen 11 in de intestinale epitheel. β-catenine, de CatnB gen product, is een belangrijke regulator van de Wnt signaleringsroute die ISC homeostase regeert. Twee eerdere studies met behulp van deze strategie leverden tegenstrijdige resultaten 12,13. Het onderzoek van févr et al. 12 aangetoond verlies van stamcellen en intestinale homeostase. Overwegende dat Ierland et al. 14 studie gemeld dat na een verlaging van de levensvatbaarheid van de cellen de crypte-villus as werd herbevolkt van wild-type cellen die CatnB. Het grootste verschil in deze studies werd gebruikt om de promoter Cre drukken in de intestinale epitheel. De févr et al., Studie gebruikte villin gen promoter gekoppeld aan de oestrogeenreceptor dat geactiveerd kan worden door het toedienen van tamoxifen (VIL-Cre-ER T2) 15,16. In tegenstelling Ierland et al., Gebruikt de promotor element van de ratten cytochroom P450A1 (CYP1A1) Cre gen expressie te drijven in reactie op de lichaamsvreemde β-naftoflavon (Ah-cre). De kenmerken van deze verschillende systemen gegenereerde twee hypothesen verklaren deze verschillende observaties. Het eerste dat CatnB efficiënter verwijderd in de ISC met de VIL-Cre-ER T2 systeem ten opzichte van de Ah-cre, waardoor het aantal ISCs om sub-herbevolking niveaus verminderen. Alternatief was het gevolg van differentiële CatnB deletie in de gedifferentieerde celpopulatie. De vil-Cre-ER T2-systeem richt zich op alle epitheelcellen van de crypte en villus terwijl de Ah-cre systeem richt zich alleen de niet-Paneth cellen van de ISC niche en crypte. Deze systemen voorzien ideaal gereedschap voor het onderzoeken van de Behavior van het ISC en hun interactie met de Paneth cellen. Hier presenteren we een aantal gedetailleerde protocols gebaseerd op hoe we gebruiken deze systemen te bepalen dat Paneth cellen spelen een cruciale rol in het mediëren van de intestinale reactie op letsel 17.

Protocol

Informatie over alle materiaal dat gebruikt wordt in tabel 1 gegeven. Alle dierproeven werden uitgevoerd onder het gezag van een Britse ministerie van Binnenlandse Zaken project licentie. 1. CatnB verwijdering met behulp van de Ah-cre en VIL-Cre-ER T2 Systems Steek de muizen stammen tot 10 genereren – 14 weken oude cohorten van Ah-cre + CatnB + / +, Ah-cre + CatnB flox / flox, vil-Cre-ER T2 CatnB + / + en VIL-Cre-ER T2 CatnB Flox / Flox. Voor de visuele analyse van recombinatie, via een β -Gal vlek, moet cohorten de Rosa26R-lacZ reporter 17 bevatten. Cohorten zou moeten controleren op de aanwezigheid van gemodificeerde genen en het gebruik van inductiemiddelen, moet de omvang van de cohorten vereist geschat met een poweranalyse. Om de Ah-cre transgene induceren bereiden β; -Naphthoflavone (BNF), of voor het VIL-Cre-ER T2 transgene tamoxifen (TAM) in maïsolie om een werkende oplossing van 10 mg / ml. LET OP: De agenten dient te worden gewogen in een zuurkast met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Hitte oplossingen in een amberkleurige fles (BNF is lichtgevoelig) hetzij 99,9 ° C BNF of 80 ° C TAM in een waterbad. Transfer naar een verwarmde roerder ingesteld op 100 ° C gedurende BNF of 80 ° C TAM en roer gedurende 10 min. Voor BNF herhalen 1,3-1,4 totdat het is opgelost (kan> 1 uur duren). Aliquot in kleine amberkleurige flesjes (~ 5 ml) en dan bevriezen bij -20 ° C. Flessen moeten na 3 vries / ontdooi cycli worden weggegooid. Voorafgaand aan dooi agenten gebruiken en opwarmen tot de juiste temperatuur als ze uit de oplossing zijn gedaald. Laat afkoelen tot <37 ° C voorafgaand aan injectie. Injecteer de muizen intraperitoneaal (IP) met een dosis van 80 mg / kg, bijvoorbeeld een 25 g muis ontvangt 0,2 ml van de appropriate inductiemiddel. Voor Ah-cre leveren drie injecties in 24 uur tijd, voor vil-Cre-ER T2 geven één injectie per dag gedurende 4 dagen. 2. Dissectie van Darm voor Reporter Visualisatie en immunohistochemie (IHC) Euthanaseren de muis met behulp van cervicale dislocatie zonder voorafgaande verdoving in overeenstemming met de ethische goedkeuring. Plaats de muis in een liggende positie en nat van de vacht met behulp van 70% EtOH, opent de intra-peritoneale holte lengterichting langs de middellijn met een schaar. Zet de maag met een pincet en verbreken de verbinding met de slokdarm. Verwijder de dunne darm tot aan het aanhangsel door voorzichtig aan de maag. Verwijder de dikke darm naar de anus door zachtjes trekken aan de appendix. Nadat de darmen zijn geïsoleerd verwijdert de maag en appendix. Flush darmen met 1x PBS met behulp van een spuit met een stompe uiteinden pipetpunt. OPMERKING: Elke darm moet ik zijnmmediately bewerkt voor een van de stroomafwaartse toepassingen hieronder beschreven. 3. Formaline Fixatie van de Darm Snijd de gespoelde darm in 3 gelijke grootte secties en label proximale, midden en distale. Snijd elke sectie in 1 cm stukjes. Neem een ​​kleine strook chirurgische tape 2 cm x 2 cm. Plaats 3-5 1 cm stukken op het midden van de chirurgische tape in een piramide formatie. Dicht en sluit de tape rond de stukken in de lengte, om een ​​"log stapel" effect te geven. Plaats weefsel in een vlakke bodem houder die een grote overmaat neutrale gebufferde formaline fixeermiddel, ten minste 10x de hoeveelheid fixeermiddel aan het volume van weefsel. OPMERKING: Vermijd het plaatsen van overmatige hoeveelheden van weefsel in een buis voor de fixatie, verdeel het in meerdere containers. Leg monsters bij 4 ° C gedurende ten minste 18 – 24 uur voorafgaand aan het inbedden en snijden. Om verlies van nucleair β-catenine te voorkomen, niet te repareren dan 24 uur.Na fixatie overdracht weefsel een vlakke bodem houder met een grote overmaat van 70% EtOH, tenminste 10x het volume weefsel. 4. Methacarn Fixatie van de Darm Voorafgaand aan ontleding bereiden methacarn fixeermiddel combineert 300 ml MeOH, 150 ml chloroform en 75 ml ijsazijn (4: 2: 1). Snijd de gespoelde darm in 3 even grote secties proximale, midden en distale. Plaats elk stukje darm naast elkaar op een stuk filtreerpapier (15 cm x15 cm) en met behulp van een schaar springbow open up 'en face'. Plaats de darm en filtreerpapier in een glazen schaaltje met methacarn gedurende 3 – 24 uur bij KT. Na fixatie halen het einde van een darm gedeelte met behulp van een pincet. Wikkel de darm rond de tang om een ​​"Swiss roll" vormen en zet de rol van lichtjes openen van de tang en het zetten van een 25 G naald doorheen. Plaats weefsel in een vlakke bodem container met daarin een laRGE overmaat neutrale gebufferde formaline fixeermiddel, ten minste 10x de hoeveelheid fixeermiddel aan het volume van weefsel en opslag gedurende ten minste 1 uur voordat de verwerking. 5. Hele Mount LacZ Visualization (Gewijzigd van El Marjou et al. 18) Bereid wasplaten combineren gesmolten ralwax met minerale olie bij 10: 1. Giet het mengsel in 15 cm petrischaaltjes en laat afkoelen. Bereid X-gal fixeermiddel volgens Tabel 1 en bewaren op ijs. Verwijder gehele darm en doorspoelen met ijskoude 1x PBS, zoals beschreven in hoofdstuk 2. Fix darm door te spoelen met 25 ml ijskoude X-gal fixatief. Met behulp van een schaar te snijden de darm in 3-5 gelijke delen (maximaal 5 per plaat). Plaats elke sectie op wax bord en vastpinnen elk uiteinde, zodat de sectie enigszins wordt uitgerekt de mesenterische bovenste lijn; trimmen overtollige mesenterium. Met behulp van een springbow schaar knippen de darm lengterichting en speld langs de weg.60; Overspoelen de plaat met X-gal fixatief om de secties omvatten en laat ten minste 1 uur bij 4 ° C. Verwijder X-gal fixeermiddel met een pipet 25 ml en eenmaal met 30 ml 1 x PBS. Afdekprofielen met 30 ml DTT demucifying oplossing 30 – 60 min bij kamertemperatuur, bij voorkeur op een schudplatform. Verwijder demucifiying oplossing met een pipet 25 ml en overspoelen de plaat met 30 ml 1x PBS. Met behulp van een pasteurpipet wassen de darm gedeelten met 1x PBS in de plaat om slijm te verwijderen. Verwijder 1x PBS met een pipet 25 ml en overgieten met 30 ml X-gal kleuring. Incubeer overnacht bij RT in het donker met zacht schudden op een schommelende platform. Na de incubatie overnacht controleren of de delen van een blauw / groene vlek hebben ontwikkeld, indien de achtergrondkleur is nog steeds wit, kan verse vlekken oplossing worden toegevoegd en gecontroleerd tot vlekken ontwikkelt. OPMERKING: Zodra secties dan heb gekleurd verder geen vlekken kunnen worden geprobeerd. Verwijder de X-gal kleuringmet behulp van een 25 ml pipet en vloed plaat met 30 ml 1x PBS en laat gedurende 3 min met voorzichtig roeren. Verwijder pinnen en pick-up, met een pincet, het einde van een darm sectie. Wikkel de darm rond de tang om een ​​"Swiss roll" te vormen, zet de rol van lichtjes openen van de tang en het zetten van een 25 G naald doorheen. Plaats weefsel in een wijdmonds vlakke bodem houder die een grote overmaat neutrale gebufferde formaline fixeermiddel, ten minste 10x de hoeveelheid fixeermiddel aan het volume van weefsel. Leg monsters bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur vóór het inbedden en snijden. 6. Winning van crypten van Darm Isoleer de eerste 20 cm van de dunne darm, zoals bepaald in punt 2. Plaats de darm op een schone dissectie oppervlak en met behulp van een pincet en een schaar verwijder eventueel vastzittend vet / mesenterium. Met behulp van een springbow schaar opent de darm lengterichting. Met behulp van een microscoop deksel slide, firmly schraap de darm lumen aan villi en slijm te verwijderen. Met behulp van een schaar knippen de darm in ~ 5 mm gesneden en over in een 50 ml buis met 25 ml 1 x HBSS aangevuld met penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 U / ml). Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het antibioticum bevattende media door het passeren van de monsters door een 70 um cel zeef. Plaats intestinale secties in een verse 50 ml buis met 10 ml 1x HBSS en vervang de dop. Voorzichtig omkeren twee keer en verwijder het 1x HBSS door het passeren door een 70 um cel zeef. Verder was de intestinale stukken door het herhalen van 6.4 & 6.5 drie keer en ervoor te zorgen dat de uiteindelijke fractie is relatief duidelijk. Overdracht weefsel verse 50 ml buis met 10 ml EDTA (8 mM) / 1 x HBSS en laat bij kamertemperatuur 5 min. Schud krachtig (20 – 30x) of vortex, passeren door een 70 um cel zeef en overdracht weefsel stukken om een ​​frisse 50 ml buis met EDTA (8 mm) / 1x HBSS. LET OP:De stroom door kan ofwel worden weggegooid of bewaard als analyse van de darmvlokken epitheel is vereist. Incubeer het weefsel stukken op ijs gedurende 30 min, schud het monster krachtig (20 – 30x) en vortex. Passeren de monsters door een 70 pm cel zeef en behouden van de stroom door, omdat dit bevat de crypten. Breng de weefselstukken om een ​​nieuwe 50 ml buis met 10 ml van 1 x HBSS. Schud krachtig (20 – 30x) of vortex, passeren door een 70 um cel zeef en behouden van de stroom door. Herhaal dit nog een keer om een ​​maximale herstel van de crypten van de darm stukken te garanderen. Combineer de stroom door breuken en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min. Giet het supernatant en bewaar de crypte pellet. Opmerking: De korrels kunnen direct worden gebruikt voor het kweken (indien van toepassing) en bewaard bij -80 ° C voorafgaand aan standaard DNA / RNA / proteïne extractieprocedures. 7. Standard Immunohistochemische Visualisatie Snijd 5 μm gedeelten van paraffine ingebed weefsel op met poly-L-lysine (PLL) slides. Opmerking: Een standaard protocol voor het kleuren met een B-catenine antilichaam hieronder is weergegeven, worden de parameters voor andere antilichamen in tabel 2. De-wax met 2x 3 min wassingen in dia baden met vers xyleen. Hydrateren door het passeren objectglaasjes gedurende 3 min door slide bad met vers: 100% EtOH (2 x), 95% EtOH en 70% EtOH en uiteindelijk in 1x PBS. Plaats de glaasjes in een dia bad dat citraatbuffer (pH 6) en verwarm 99,9 ° C gedurende 20 min om antigenen te halen. Laat dia's afkoelen en daarna wassen 3x 5 min in een dia bad dat 1xTBS / T voor 5 min. Verwijder dia's uit de laatste wasbeurt, direct trekken rond weefsel met een PAP pen, en bedekken gedeelte met een commerciële peroxidase blok of 1,5% H 2 O 2 (in gedestilleerd H 2 O). Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT) daarna wassen 3x in slide bad met vers 1 x TBS / T voor 5 min. Na het wassening afdekprofielen, met een pipet, in 5% normaal konijnenserum (NRS) / 1xTBS / T gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om niet-specifieke hydrofobe binding van het primaire antilichaam te blokkeren. Verwijder NRS blok met een Pasteur pipet en afdekprofiel in B-catenine primair antilichaam verdund 1: 200 met 5% NRS. Was dia's voor 3x 5 min in dia baden met vers 1xTBS / T. Opmerking – andere antilichamen zal optimalisatie voor verdunning en specificiteit nodig. Om de specificiteit van een antilichaam te waarborgen, moeten passende geen antilichaam en isotypecontrole vlekken worden uitgevoerd. Een isotype controle is afgestemd op de gastheersoort en isotype van primair antilichaam. Visualiseren ofwel commercieel HRP detectie kit of een geschikt fluorescent gemerkt secundair antilichaam (Tabel 2). OPMERKING: Lengte van ontwikkeling dan voor elk antilichaam voor β-catenine 10 – 15 sec meestal voldoende. Om de ontwikkeling te optimaliseren voor een antilichaam eerste establish de tijd die nodig is om positieve cellen met een positieve controleglaasje visualiseren en vervolgens toepassen op alle volgende dia. Was dia's voor 3x 5 min in dia baden met verse TBS / T. Tegenkleuring dia's door onderdompeling in een bad met glijbaan haematoxyline voor ~ 45 seconden (niet vereist bij gebruik van fluorescent gelabelde secundaire antilichamen). Zet dia's in een schone dia bad en afspoelen met stromend leidingwater voor ~ 1 min, het waarborgen van de haematoxyline niet volledig uitgewassen. Uitdrogen glijdt door het door slide baden met toenemende concentraties alcohol; 1x 30 sec in 70% EtOH, 1 x 30 sec in 95% EtOH, 2 x 30 sec wassingen in 100% EtOH, 2 x 2 min in xyleen. Mount glijdt onder een dekglaasje met behulp van een commercieel montage media. NB: Bij gebruik van fluorescent gelabelde antilichaam te monteren met een medium met DAPI om de kern te labelen. 8. Histologische Identificatie van specifieke Intestinal epitheelcellen Enterocyten Bereid secties met behulp van hoofdstuk 7 van de villin antilichaam en omstandigheden in tabel 2 beschreven. Entero-endocriene cellen (Grimelius vlek 18,19). Bereid secties door de stappen 7,1-7,2. Was dia's in een diavoorstelling bad dat ultrapuur water gedurende 3 minuten. Breng de dia een dia bad dat voorverwarmd zilveroplossing (tabel 1) en incubeer bij 60 ° C gedurende 3 uur. Verwijder de dia's uit de zilveroplossing en in een slede bad dat vers bereide oplossing voorverwarmde verloopstuk (tabel 2) bij 45 ° C gedurende 3 min. Verwijder de dia's en te plaatsen in een glijbaan bad met vers ultrapuur water gedurende 3 minuten. Volg de stappen 7,6-7,8 uit sectie 7. Bekercellen (alcianblauw vlek). Bereid secties door de stappen 7,1-7,2 .. Overdracht dia's aan een dia bad dat Alcian Blue pH 2,5 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder Alcian blauwe vlek met een pipet en plaats glijbaan bad onder een lopende kraan voor 3-5 min. Volg de stappen 7,6-7,8. OPMERKING: Alcian blue oplossing voor verder gebruik worden bewaard. ISC's. Identificeren van de ISC's volgen hoofdstuk 9. Paneth cellen. Bereid secties volgende paragraaf 7 met behulp van de lysozym antilichaam en omstandigheden in tabel 2 beschreven. 9. In Situ RNA detectie met Murine darm 19-21 Plaats 5 micrometer secties van formaline gefixeerde darm (deel 3) op PLL dia's. Bereid een gelineariseerde digoxigenine gemerkte RNA-probe voor het detecteren van expressie Olfm4 21. Dewax en hydrateren secties per hoofdstuk 7. OPMERKING: Dit protocol moet in een RNAse vrije omgeving worden uitgevoerd om de afbraak van de RNA-probe te voorkomen. Trekken rond tprobleem met een PAP pen om reagentia te minimaliseren. Incubeer secties in een dia bad met 6% H 2 O 2 (in gedestilleerd H 2 O) gedurende 30 min. Twee keer wassen in een dia bad met verse 1x PBS gedurende 3 min. Gooi 1x PBS en, met behulp van een pipet, afdekprofiel met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten op ijs. Twee keer wassen in een dia bad met verse 1x PBS gedurende 3 min. Met behulp van een pipet deksel secties met proteïnase K-oplossing gedurende 5 minuten wassen in een dia bad met verse 1x PBS gedurende 3 min. Pipetteer post-fix gedeelten van die in 4% paraformaldehyde gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Wassen in een dia bad met DEPC behandeld H 2 0 2 min. Met behulp van een pipet afdekprofielen in azijnzuuranhydride gedurende 10 min onder roeren. Wassen in een dia bad met verse 1x PBS / 3 min, gevolgd door zoutoplossing 1x / 3 min. Pass dia's door baden met toenemende concentraties alcohol; 1x 30 sec in 70% EtOH, 1 x 30 sec in 95% EtOH, 2 x 30 sec wassingen in vers 100% EtOH,2x 2 min in verse xyleen en laat aan de lucht drogen. Verdun Olfm4 probe 1: 100 in hybridisatiebuffer en probe denatureren door verwarmen tot 80 ° C gedurende 3 min. Breng 100 ui van probe voor elke sectie en dek af met parafilm om uitdroging van de dia te voorkomen. Incubeer overnacht in een donkere, vochtige kamer bij 65 ° C. Was in een dia bad met 5 x SSC bij 65 ° C gedurende 15 min. Was secties in een dia bad tweemaal met vers 50% formamide / 5 x SSC / 1% SDS gedurende 30 min bij 65 ° C. Was tweemaal secties in een dia bad in vers PBT gedurende 10 min, de eerste bij 65 ° C en de tweede bij KT. Met behulp van een pipet afdekprofielen met PBT met 25 ug RNase gedurende 45 min bij 37 ° C. Was secties in een dia bad in PBT gedurende 5 min bij RT. Was secties in een dia bad tweemaal met vers 50% formamide / 5 x SSC gedurende 30 minuten bij 65 ° C. Te blokkeren, dekking secties met behulp van een pipet met 10% schapen serum in PBT en op te slaan in een donkere, moist kamer bij kamertemperatuur gedurende 2 – 3 uur. Bereid door verdunning van antilichaam anti-digoxigenine alkalisch fosfatase geconjugeerd antilichaam bij 1: 500 met 10% schapen serum in PBT met 5 mg / ml muis intestinale poeder. Incubeer 3 uur bij 4 ° C in het donker op een schudplatform. Spin down om overtollig intestinale poeder te verwijderen en 3x volumes van 1% schapen serum toe te voegen in PBT aan het bovenstaande. Verwijder blok van dia's met een pipet en voeg 100 ul van de antilichaamoplossing elke sectie, bedek met parafilm en geïncubeerd in een donkere, vochtige kamer bij 4 ° C overnacht. Was secties in een dia bad 3 × met verse PBT gedurende 5 minuten. Te blokkeren secties wassen in een dia bad 3 × met verse NTMT buffer gedurende 5 minuten. Visualiseren met behulp van een pipet bedekken elke sectie met BM purple en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 24 – 72 uur totdat een voldoende sterke kleurontwikkeling. Was secties in een dia bad eens in PBT en tegenkleuring door onderdompeling in eosine 1 min. Remove overtollige eosine door wassen secties in een dia bad onder een stromend water gedurende 3-5 min. Dompel de glaasjes in xyleen en laat aan de lucht drogen. Monteren onder een dekglaasje met behulp van commerciële media. 10. histologische karakterisering van intestinale epitheel Plaats 5 micrometer secties van de vaste weefsel (hoofdstuk 3 & 4) op PLL dia's. Analyseer ≥25 willekeurig geheel (of ≥50 half) crypten van ≥4 muizen per cohort voor elk van de volgende parameters. OPMERKING: Om te handhaven consistentie analyseren crypten uit dezelfde locatie van elke darm (alleen gebruik maken van het proximale uiteinde). Cellulaire parameters van standaard H & E gekleurde secties (tenzij anders vermeld): Crypt nummer, hoogte, apoptose en mitose. Crypte nummer. Gebruik een lage vermogenvergroting (bijvoorbeeld 4x of 10x) het aantal crypten handmatig tellen in contact met de basale laag. Count ≥10 dwarse proximale darm sekteionen van ten minste 4 muizen. Crypte hoogte. Gebruik een hoge vermogenvergroting (bijvoorbeeld 20X of 40X) het aantal cellen handmatig tellen vanaf de bodem van de crypte de crypte / villus as (figuur 3b). Apoptose 22, 23. Methode 1: Gebruik een hoge vermogenvergroting (bijvoorbeeld 20X of 40X.) Het aantal apoptotische cellen handmatig tellen per crypt. Apoptotische cellen kunnen worden geïdentificeerd door celinkrimping, chromatine condensatie, cytoplasmatische vorming van blebs en apoptotische lichamen (Figuur 3a). Methode 2: Voer een IHC vlek (deel 7) voor caspase-3 gebruikt in tabel 2 beschreven ondities hoge vermogenvergroting (bv 20x of 40x.) Het aantal positieve cellen handmatig tellen elk crypte cellen in de kwantificeren. uitvoeringsfase van apoptose. Mitose. <ol> Gebruik een hoge vermogenvergroting (bijvoorbeeld 20X of 40X) om het aantal mitotische cellen handmatig tellen per crypt. Mitotische cellen bevatten gecondenseerd DNA-materiaal en zijn meestal symmetrisch en goed gevormd (figuur 3b). Proliferatie. Voer een IHC (hoofdstuk 7) vlek voor Ki-67 met behulp van de in tabel 2 beschreven omstandigheden. Handmatig tellen positieve cellen om het aandeel van de crypte cellen uitdijende kwantificeren.

Representative Results

Vergelijken ISC recombinatie-efficiëntie in de Ah-cre en Vil-Cre-ER T2 Systems Het gebruik van deze cre-lox systeem voor het evalueren van de rol van Paneth cellen te herbevolken de darm volgende schade vereist karakterisering van de efficiëntie van recombinatie binnen de ISC. De Rosa26R-lacZ reporter conditionele we aangetoond dat in beide systemen 3 dagen na inductie (dpi) is ~ 100% recombinatie in de dunne darm (figuur 1a). Kwantificeren van de aanwezigheid van het gerecombineerde allel door qPCR werd verstoord door de verschillen in Cre expressiepatronen tussen de systemen. De vil-Cre-ER T2 systeem vertoonde een 3,53-voudige toename in aanwezigheid van het gerecombineerde allel in vergelijking met de Ah-cre systeem, vanwege zijn expressie in een groter deel van de epithelia 16. Om dit te ondervangen we nam een ​​andere strategie die liet ons toe om rechtstreeks vergelijken de systemen. We veroorzaakte de muizen met verschillende inductie regimes en geanalyseerd op 30 dpi, op welk punt LacZ positieve crypten en villus vertegenwoordigen een ISC recombinatie. Met deze aanpak hebben we aangetoond dat in beide systemen, 3 injecties van inducerende middel (geleverd IP 80 mg / kg in 24 uur), gecombineerd in een equivalent aantal ISCs ondanks aanvankelijke recombinatie niveaus zijn veel groter in de VIL-Cre-ER T2 systeem 16 (figuur 1 b-d). Verder, met behulp van DNA geëxtraheerd uit de gerecombineerde crypten, qPCR het gerecombineerde allelen toonde een niet-significante toename van recombinatie met het vil-Create ER T2 systeem, mogelijk als gevolg van de recombinatie in de Paneth cellen niet waargenomen met behulp van de Ah-cre systeem (figuur 1d). Verder kleuring voor epitheel celtypes niet indicate elke wijziging differentiatiepatroon representatieve afbeeldingen van elke celtype onderzocht wordt getoond in figuur 2e-2h. Karakterisering van intestinale epitheel volgende CatnB Verwijdering Kwantificering van Crypt Loss Karakteriseren van de kinetiek van recombinatie in deze Cre systemen stelde ons in staat om de muis darm analyseren wanneer equivalente aantallen ISC's worden gecombineerd. Met behulp van de LacZ reporter beide systemen toonde volledig verlies van gerecombineerde (blauw) cellen op 3 dpi (Figuur 2a). Zoals eerder gemeld drie dagen na verwijdering van CatnB de Ah-Cre muizen vertoonden gedeeltelijke crypte verlies, terwijl de VIL-Cre-ER T2 muizen aangetoond volledige vernietiging van de crypte / villus as 13,16,24 (figuur 2b-d). </p> Dynamiek van epitheliale Herbevolking Met behulp van de technieken die we hierboven gekarakteriseerd meerdere parameters om ons in staat om deze opmerking te begrijpen. Representatieve beelden van de parameters en celtypen geanalyseerd met protocollen 7 – 10 gegeven in (figuur 3a en 3b). In het kort, het verlies van crypten was consistent met de verhoogde apoptose weergegeven in beide systemen (Figuur 3e). Echter de mitose, proliferatie, crypt cellulaire hoogte crypte en expressie (niet getoond) data gaf de Ah-cre systeem kon herstellen, vermoedelijk als gevolg van herpopulatie van un-gerecombineerde ISC (figuur 3c). In schril vergelijking, de VIL-Cre-ER T2 niet om te herstellen, ondanks het behoud van epitheliale crypte cellen (figuur 3d). Karakterisering van cellulaire fenotypes binnen Crypt Om te begrijpen waarom de crypten van Ah-Cre muizen kon herbevolken terwijl de VIL-Cre-ER T2 konden we niet gekenmerkt de epitheelcellen drie dagen na de verwijdering van CatnB. Met behulp van in situ hybridisatie (paragraaf 9) en IHC-analyse (hoofdstuk 7, 8 en 10) hebben we aangetoond dat de crypte cellen in de VIL-Cre-ER T2 CatnB Flox / Flox muizen waren non-proliferatie en miste de expressie van het ISC marker Olfm4 Anders dan de crypten van de Ah-Cre muizen (figuur 4c en f). Aangezien de eerste karakterisering heeft aangetoond dat recombinatie in crypten was gelijk gingen we naar de rol van de Paneth cellen onderzocht. We hebben een twee fluorescerende IHC tegen CatnB en Lyz1 om te bepalen welke cellen β-catenine verloren had en of ze waren Paneth cellen (figuur 5a-5c). Zoals eerder beschreven wij demonstrated alle cryptcellen gericht met de vil-Cre-ER T2 systeem. In vergelijking met de Ah-cre systeem spaarde de Paneth cellen en de villus epitheel. Verdere Paneth cellen werden alleen waargenomen apoptose ondergaan na CatnB verwijderen met behulp van het VIL-Cre-ER T2-systeem (Figuur 5d en 5e). Figuur 1: Vergelijking van de specificiteit en de efficiëntie van Cre / Lox recombinatie binnen de intestinale epitheel met behulp van de Ah-cre en Vil-Cre-ER T2 Systems (a):. Visualisatie van Ah-cre LacZ reporter uitdrukking in wholemount klein (SI; * distale einde) en grote (LI; * distale einde) van een wild-type muis. (b): De resultaten van qPCR tonen voudige verandering voor de gerecombineerde CatnB Flox allel op 1 dpi verschillende inductie regimes vergelijken Ah-cre CatnB Flox / Flox (BNF veroorzaakte) en VIL-Cre-ER T2 CatnB Flox / Flox (TAM geïnduceerde ); * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] vergeleken met controle). (c) – (e):.. Wholemount dunne darm toont LacZ positieve crypte 30 dpi Panel (b) – (e) gewijzigd van Parry et al 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Vergelijking van de Ah-cre en Vil-Cre-ER T2 <strong> Systemen voor voorwaardelijk verwijderen CatnB in dunne darm epitheel (a):. Wholemount dunne darm toont verlies van gerecombineerde cellen in Ah-cre CatnB Flox / Flox LacZ + muizen gedurende 3 dagen. (b): Kwantificering van crypt verlies 3 dagen na verwijdering van CatnB; * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] vergeleken met controle). (c en d): Transversale H & E secties van formaline gefixeerde darm aantonen verlies van crypten na CatnB verwijdering. (e) – (h) Voorbeeld van celtypen van controle muizen: (e) entero-endocriine cellen, (f) slijmbekercellen, (g) CatnB IHC aangeeft dat er een ISC (→) met nucleaire B-catenine & (h) Paneth cellen. Paneel (b) gewijzigd van Parry et al. 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <p class="jove_content" fo:keep-to gether.within-page = "always"> Figuur 3: Karakterisering van de Onset van fenotype bij gebruik van de Ah-cre en Vil-Cre-ER T2 Systemen voor voorwaardelijk verwijderen CatnB in vergelijkbare aantallen van ISC's binnen de dunne darm epitheel (a & b) H & E gekleurde formaline gefixeerde secties de ligging van de crypte. hoogte ([), een apoptotische (←) en mitotische cel (↓). Kwantificering van het gemiddeld aantal cellen per crypte tussen wild type (blauw) en CatnB Flox (oranje) muizen op drie tijdstippen (dpi) (c) crypte hoogte, (d) mitose en (e) apoptose (foutbalken geven standaarddeviatie ). Panel (c) – (e) modificatie van Parry et al 16.3429fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4:. Vergelijking van de ISC Kenmerken met Ah-cre en Vil-Cre-ER T2 Systemen voor voorwaardelijk verwijderen CatnB in de dunne darm epitheel Epithelial crypte cellen 3 dagen na verwijdering van CatnB gebruik van de Ah-Cre (AC) of Vil- cre-ER T2 (DF) systeem. (A & D), H & E sectie waarop de gebieden van de crypte verlies; (b & d) Ki-67 IHC aantonen verlies van proliferatieve cellen met behulp vil-Cre-ER T2; (C & F) Olfm4 in situ aantonen van aanwezigheid van functionele ISC's met Ah-cre. Paneel (een) -. (f) gewijzigd van Parry et al 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Karakterisering van de Paneth cellen na CatnB Verwijdering via de Vil-Cre-ER T2 en Ah-cre Systems (ac). Immunofluorescentie beelden van crypten tonen Paneth cel (rood), B-catenine (groen) en de kern (blauw ) arrow geven membraangebonden β-catenine; (de) IHC voor caspase-3 aangeeft apoptotische Paneth cellen afwezig in de Ah-CRE (d), maar in de vil-Cre-ER T2 systeem (e). Paneel (a) – (e) gewijzigd vanafParry et al 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Acetaatbuffer * * 100 ml te maken: 4,8 ml 0,2 M azijnzuur, 45,2 ml 0,2 M natriumacetaat en 50 ml gedestilleerd water Azijnzuur Fisher Scientific C / 0400 / PB17 Azijnzuuranhydride Sigma A6404 Acetic anhydride oplossing * * 2 M azijnzuuranhydride in 0,1 M triethanolamine-hydrochloride Alcian Blue Sigma A5268 Alcian Blue PH 2,5 * * </td> Om 500 ml te maken: 15 ml azijnzuur, 5 g Alcian Blue & 485 ml gedestilleerd water anti-digoxigenine antilichaam geconjugeerd alkalisch fosfatase Abcam ab119345 B (beta) -Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, injecteren zonder dat de oplossing voor te veel afkoelen als verbinding zal dalen uit de oplossing. Oplossing kan worden hergebruikt – bewaar bij -20 ° C tussen de toepassingen, niet opwarmen meer dan twee keer. Bloxall Vector Labs SP-6000 BM paars Roche 11442074001 BSA Sigma A4503 Runderserumalbumine Chloroform Fisher Scientific C / 4.920 / 17 Citraat Buffer / Antigen ontmaskeren Solution Vector Labs H-3300 Mais olie Sigma C8627 Demucifiying oplossing * * Voor 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml 0,1 M Tris pH 8,8, 100 ml EtOH, 300 ml zoutoplossing (0,9% NaCl in water), DTT 1,7 g. Demucifying oplossing kan vooraf worden gemaakt en opgeslagen, maar DTT sholud worden toegevoegd juist vóór incubatie (340 mg / 100 ml). DEPC behandeld water Life Technologies 750023 DTT Sigma 101509944 EDTA Sigma O3690 0,5 M Ethanol Fisher Scientific E / 0650DF / 17 Filter papier Welke man 3000917 Formaldehyde Sigma F8775 Formaline Sigma SLBL11382V Neutraal gebufferde formaline Formamide Sigma F5786 Glutaraldehye Sigma G6257 H 2 O 2 Sigma 216763 Haematoxyline Raymond A Lamb 12698616 HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2) Hybridisatiebuffer * * 5 x SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg / ml heparine, 1 mg / ml tRNA kalfslever Hydrochinon Sigma H9003 IMMPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105 <tr> Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402 Immpress HRP anti-konijn IgG Kit Vector Labs MP-7401 Darmweefsel poeder * * De dunne darm van 5 volwassen muizen werden gecombineerd en gehomogeniseerd in het minimale volume ijskoude PBS. 4 volumina ijskoude aceton werd toegevoegd aan de gehomogeniseerde darm, die grondig was vermengd en geïncubeerd op ijs gedurende 30 min. Dit werd gecentrifugeerd en de pellet werd gewassen met behulp ijskoude aceton. Dit werd verder gecentrifugeerd en de resulterende pellet uitgespreid op filtreerpapier en drogen. Eenmaal goed drogen werd het materiaal tot een fijn poeder met behulp van een vijzel. K-ferricyanide Sigma P-3667 K-ferrocyanide Sigma P3289 </tr> Levamisol Sigma L0380000 Methacarn * * 60% methanol: 30% chloroform: 10% azijnzuur Methanol Fisher Scientific M / 4000/17 MgCl2 Sigma M8266 Normaal geit serum Vector Labs S-1012 NGS Normaal konijnenserum Dako X0902 NRS NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCI, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween 20, 2 mM Levamisole PAP pen Vector H-400 Paraformaldehyde Sigma P6148 PBT * * 0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20 Penicilline / streptomycine Gibco 15140-122 100x solutiuon. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 met gedestilleerd water tot 1x maken PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine objectglaasjes Proteinase K Sigma P2308 Proteinase K oplossing * * Verdun Proteinase K bij 200 ug / ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA. Ralwax BDH 36.154 7N Reducer Oplossing * * 1 g hydrochinon, 5 g natriumsulfiet en 100 ml gedestilleerd water: tot 100 ml te maken RnaseA Sigma R6148 </ td> Zoutoplossing * * 0,9% NaCl in gedestilleerd water SDS Sigma I3771 Schapen serum Sigma S3772 Zilvernitraat Sigma S / 1240/46 Zilveroplossing * * 10 ml acetaat buffer, 87 ml gedestilleerd water, 3 ml 1% zilvernitraat: tot 100 ml te maken Natriumacetaat Fisher Scientific S / 2.120 / 53 Sodium chloride Sigma S6753 NaCl Natriumsulfiet Sigma 239.321 SSC Sigma 93.017 20x saline natriumcitraat Chirurgische tape Fisher Scientific 12960495 Tamoxifen Sigma T5648 TAM, injecteren zonder dat de oplossing voor te veel afkoelen als verbinding zal dalen uit de oplossing. Oplossing kan worden hergebruikt – bewaar bij -20 ° C tussen de toepassingen, niet opwarmen meer dan twee keer. TBS / T Cell Signalling # 9997 Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502 Tris-HCL Invitrogen 15567-027 Tween20 Sigma TP9416 VectaMount Vector Labs H-5000 Vectashield Hardset montage medium met DAPI Vector Labs H-1500 Vectastain ABC Kit Vectof Labs PK-4001 X-gal Promega V3941 X-gal fixatief * * 2% formaldehyde, 0,1% glutaaraldehyde in 1xPBS X-gal vlek * * X-gal vlek; 200 pi X-gal (A) in 50 ml oplossing B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-ferricyanide, 0,734 g K-ferrocyanide in 500 ml PBS). Oplossing B kan worden gemaakt oin vooraf opgeslagen bij 4 ° C Xyleen Fisher Scientific X / 0200/21 Tabel 1: Materialen en Methoden Doel beta-catenine Lysozym Ki67 Caspase-3 Villin Commerciële bron van de primaire Ab Transductie Labs Neomarkers Vector Labs R & D Systems Santa Cruz Catalogus Aantal 610154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672 Primaire Ab getogen in Mouse (mAb) Konijn (PAB) Mouse (mAb) Konijn (PAB) Geit (PAB) Antigen herstel Bad met kokend water / citraatbuffer Bad met kokend water / citraatbuffer Bad met kokend water / citraatbuffer Bad met kokend water / citraatbuffer Bad met kokend water / citraatbuffer Peroxidase block Bloxall of 2% H 2 O 2, 45 sec Bloxall of 1,5% H 2 O 2, 30 min Bloxall of 0,5% H 2 O 2, 20 min Bloxall of 2%H 2 O 2, 45 sec Bloxall of 3% H 2 O 2, 20 min Serum blok 1% BSA, 30 min 10% NGS, 30min 20% NRS, 20 min 10% NGS, 45 min 10% NRS, 30 min Wasbuffer PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T Voorwaarden voor de primaire Ab 1/300, 2 uur bij KT 1/100, 1 uur bij KT 1/50, 1 uur bij KT 1/750, o / n bij 4 ° C 1/500, 1 uur bij KT Secundaire Ab Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Immpress HRP anti-konijn IgG Kit Gebiotinyleerd konijn anti-muis Gebiotinyleerd geit anti-konijn Gebiotinyleerd Rabbit anti-Geit Voorwaarden voor secundaire Ab 1 uur bij KT 30 min bij RT <t d> 1/200, 30 min bij kamertemperatuur 1/200, 30 min bij kamertemperatuur 1/200, 30 min bij kamertemperatuur Signaalversterking N / A N / A ABC-kit ABC-kit ABC-kit Signaaldetectie IMMPACT DAB Peroxidase IMMPACT DAB Peroxidase IMMPACT DAB Peroxidase IMMPACT DAB Peroxidase IMMPACT DAB Peroxidase Immunofluorescentie antilichaam AlexaFluor 488 AlexaFluor 594 N / A N / A N / A Immunofluorescentie Properties Excitatie Max 488 / Emission Max 525 Excitatie Max 595 / Emission Max 617 Gemeenschappelijke Filter Set FITC Texas Red content "> Tabel 2: IHC Antilichamen voorwaarden

Discussion

Voorwaardelijke cre-lox transgene muizen om de functie van genen en cellen te ontleden is een veel gebruikte aanpak. Deze modellen zijn gebruikt met groot succes in de darm om de stamcellen 2,4-6 identificeren en te karakteriseren en begrijpen hun rol in ziekte 25. Om deze modellen volle benutten een alomvattende karakterisering van het systeem om data mogelijk correct geïnterpreteerd. Een volledig begrip van deze systemen is moeilijk te bereiken als gevolg van genen zelden specifiek zijn voor een solitair plaats cellen, gebrek aan biologische kennis en inefficiëntie van de gebruikte Cre expressie te induceren systeem. De hier beschreven methoden laten zien hoe we overwinnen van deze problemen door middel van experimenteel ontwerp en de toepassing van de bestaande kennis. Hoewel we gebruikt deze methoden op een specifieke vraagstelling de hier gepresenteerde technieken zijn generiek en kan worden benut voor een onderzoek onderzoek naar de muri beantwoordenne darm.

Bereiding van darmweefsel

De cruciale stap voor het waarborgen robuuste resultaten is het verzamelen en verwerken van het weefsel, dat moet tijdig en fixatie protocollen strikt aangehouden te verwerken. Aangezien vrijwel alle belangrijke kwesties stroomafwaarts kan worden toegeschreven aan artefacten verbonden met het weefsel uitdroogt en / of onvolledige fixatie. Timing is cruciaal om afbraak van weefselarchitectuur en / of nucleïnezuren en eiwitten te voorkomen. Onvolledige of overijverige fixatie kan leiden tot verlies van histochemische resolutie. Onvolledige fixatie wegens onvoldoende tijd of secties te dik om fixeermiddel penetratie kan leiden tot verlies van resolutie in de intestinale crypten die kan worden waargenomen als een "tide mark" bij IHC analyse. Verder is het cruciaal dat de fixatie niet te verlengen te lang, nucleaire β-catenine kan diffunderen uit de celkern, tenzij onmiddellijk probewerkte en was ingesloten na formaline fixatie.

Rol van Paneth Cellen in het ISC Niche

De hier gepresenteerde gegevens effectief te tonen het belang van Paneth cellen in de crypte regeneratie in de volwassen darm volgende ISC verlies. Maar er bleef de mogelijkheid dat Ah-cre spaart een bevolking van ISC dat VIL-Cre-ER T2 doelen. Tian et al. 26 elegant aangetoond dat de Lgr5 hi ISC's worden vervangen door een bevolking van Lgr5 lo reserve ISC. Het lijkt nu waarschijnlijk dat deze ISC worden gespaard in de Ah-cre systeem als gevolg van de reserve bevolking te zijn geïdentificeerd als secretoire cel precursoren 6,7. Het belang van het rijpe Paneth cel ondersteunen van deze secretoire cel precursors indien vereist om terugkeren naar een ISC toestand nog worden beantwoord. Zoals Paneth cellen vormen de ISC niche 8 en rol spelen in het reguleren van de ISC reacties op calorie-inname 27 en ontsteking 28 blijft het waarschijnlijk dat hun verpleegkundige functies uit te breiden tot hun eigen voorlopers.

Nieuwe benaderingen en technologieën om effectief model menselijke Colorectale Kanker

De ontdekking van de ISC geleid tot de identificatie van genen die nu worden gebruikt om nieuwe muismodellen genereren voor het onderzoeken van de rol van genen en cellen intestinale biologie en ziekte beoordeeld door Clarke et al 9. De enige beperkingen aan deze techniek is de identificatie van genen naar het Cre eiwit expressie. Momenteel ISC's worden routinematig onderzocht met behulp van voorwaardelijke transgene muizen op basis van de Lgr5 genexpressie patroon. Muizen die Cre tot expressie van de promoter Lgr5 zijn gebruikt om Apc, het gen gemuteerd meest bij colorectale kanker (CRC schrappen), Waaruit de ISC als de cel van oorsprong 25. Selectief verwijderen van andere CRC genen in deze cellen is het inzichtelijk maken van progressie van de ziekte en de verspreiding bv. PTEN 29. Verder inzicht in ISC functie wordt opgehaald door specifiek ablatie Lgr5 expressie brengen cellen bij muizen met een menselijk difterietoxine receptor (DTR) gen klopte in de Lgr5 locus 26. Andere strategieën gebruiken het Tet-O-systeem dat een continue omkeerbare expressie van mutante eiwitten 30 mogelijk maakt. Met behulp van deze instrumenten van gen (en) in verschillende cellen 31 en bestemmingen 32,33 modificeren wordt gebruikt om te begrijpen hoe kanker initiëren, voortgang en 34 uitzaaiing. Alternatief mutagenese met behulp van de slapende schoonheid transposon systeem is het identificeren van nieuwe bestuurders van CRC. De voortdurende ontwikkeling van muizen, technieken en genetische verandering strategieën blijft de patiënt meer relevante modellen te ontwikkelen.

Nieuwe methoden zijn ontwikkeld voor het karakteriseren van de intestinale epitheel en ISC. Karakterisering van de verhouding van epitheliale celtypen kan worden bereikt met behulp van flowcytometrie op basis van de differentiële expressie van lectine en CD24 35. Potentie de grootste vooruitgang in het begrijpen ISC biologie en hun rol bij de ziekte zal worden gemaakt met behulp van de ex vivo organoïde kweeksysteem 36. Dit systeem maakt het mogelijk de normale en kwaadaardige ISC cultuur in 3D, waar ze repliceren en differentiëren in een fysiologisch relevante manier. Gehoopt wordt dat deze directe testen van drugs op monsters van patiënten in staat zal stellen in vitro, de weg vrijmaakt voor gepersonaliseerde geneeskunde 37.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood and Sylvie Robine. This work was funded by a programme grant from Cancer Research UK.

Materials

Acetate buffer * * To make 100ml: 4.8ml 0.2M Acetic acid, 45.2ml 0.2M Sodium acetate & 50ml distilled water
Acetic acid Fisher Scientific C/0400/PB17
Acetic anhydride Sigma A6404
Acetic anhydride solution * * 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride
Alcian Blue Sigma A5268
Alcian Blue ph2.5 * * To make 500ml: 15ml acetic acid, 5g Alcian Blue & 485ml distilled water
anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody Abcam ab119345
B(beta)-Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20°C between uses, do not reheat more than twice.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM purple Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovine serum albumin
Chloroform Fisher Scientific C/4920/17
Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution Vector Labs H-3300
Corn oil Sigma C8627
Demucifiying solution * * For 500ml: 50ml glycerol, 50ml Tris 0.1M pH8.8, 100ml EtOH, 300ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7g.  Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340mg/100ml).
DEPC treated water Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5M
Ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17
Filter paper Whatman 3000917
Formaldehyde Sigma F8775
Formalin  Sigma SLBL11382V Neutral buffered formalin
Formamide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H2O2 Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisation buffer * *  5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA
Hydroquinone Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vector Labs MP-7401
Intestinal tissue powder * * The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 minutes. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. 
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanide Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid
Methanol Fisher Scientific M/4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal goat serum Vector Labs S-1012 NGS
Normal rabbit serum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole
PAP pen Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0.5M NaCl, 10mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphate buffered saline (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x
PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine microscope slides
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k solution * * Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Solution * * To make 100ml: 1g Hydroquinone, 5g sodium sulphite & 100ml distilled water
RnaseA Sigma R6148
Saline * * 0.9% NaCl in distilled water
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Silver nitrate Sigma S/1240/46
Silver solution * * To make 100ml: 10ml Acetate buffer, 87ml distilled water, 3ml 1% silver nitrate
Sodium acetate Fisher Scientific S/2120/53
Sodium Chloride Sigma S6753 NaCl
Sodium sulfite Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saline sodium citrate
Surgical tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20°C between uses, do not reheat more than twice.
TBS/T Cell Signalling #9997
Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vector Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixative * * 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1xPBS
X-gal stain * * X-gal stain; 200ul X-gal (A) in 50ml solution B (0.214g MgCl2, 0.48g K-ferricyanide, 0.734g K-ferrocyanide in 500ml PBS).  Solution B can be made up oin advance and stored at 4°C
Xylene Fisher Scientific X/0200/21
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
  2. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  3. Clevers, H. . The gut, a clonal conveyor belt. , (2015).
  4. Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  5. Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
  6. Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
  7. Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
  8. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
  9. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
  10. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  11. Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
  12. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  13. Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
  14. Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).
  15. Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
  16. Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
  17. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  18. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  19. Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
  20. Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
  21. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  22. Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
  23. Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
  24. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  25. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  26. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  27. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
  28. Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
  29. Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
  30. Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
  31. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  32. Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
  33. Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
  34. Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
  35. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
  36. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  37. van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Tags

Intestinal Stem CellsLgr5Bmi-1Paneth CellsCre-lox Mouse ModelsIntestinal RegenerationIntestinal EpitheliumIntestinal Niche

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image