Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

1. Los macrófagos derivados de médula ósea El cultivo y la polarización de hueso Día 0: Aislar fémur y la tibia huesos de 6-10 semanas de edad ratones de interés (C57BL / 6 en este ensayo). Retire el tejido muscular de los huesos y colocar los huesos en un 9 cm petri plato lleno de helado de PBS. La transferencia de los huesos a un plato de Petri de 9 cm llena de etanol al 70% y agitar suavemente la placa durante 30 segundos. La transferencia de los huesos a un nuevo máximo 9 cm placa de Petri llena de PBS estéril enfriado con hielo. Cortar el fémur y la tibia en ambos extremos con tijeras estériles. Lavar los huesos con 10 ml de PBS estéril enfriado con hielo utilizando una jeringa de 10 ml y una aguja de 25 G. Recoger la médula ósea en un tubo de 50 ml. Transferencia de las células de médula ósea a un nuevo tubo de 50 ml utilizando una aguja de 23 G. Repita este paso con una aguja de 25 G. Nota: Se necesitan estos pasos para eliminar grupos de células y restos óseos. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Deseche el supernatant y resuspender las células en medio de 40 ml de células de cultivo (RPMI-1640 más 2 mM L-glutamina, 10% de FCS, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml) y 15% filtrada L-929 celular ( ATCC, CCL-1) medio -conditioned que contiene M-CSF (o alternativamente 10 ng ml M-CSF / recombinante en lugar de L-929 medio celular acondicionado). Nota: La generación de medio celular acondicionado L-929 se detalló anteriormente en esta revista en 2013. 11 Cultura de las células de un ratón en dos 15 cm placas de Petri (no utilice placas de cultivo tratadas con células desde los macrófagos no se separará de este plástico) en 20 ml de medio de cultivo por la placa en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Añadir 10 ml medio de cultivo celular fresco en días 3, sin la eliminación de los 20 ml de medio de cultivo celular mayor. Sustituir el viejo medio de cada placa con 20 ml de medio de cultivo fresco en el día 6. Hacer esto, también se eliminarán las células no adherentes. Día 8: Separe las células incubándolas 5 men por lo 37 ° C en 10 ml de solución salina de citrato (cloruro de potasio 135 mM más citrato de sodio 15 mM en H 2 O, autoclave) y se lava con 10 ml de PBS. Cuente macrófagos óseas maduras derivadas de la médula (BMDM) el día 8 usando un contador de células. Verificar la formación de maduro (CD11b + F4 / 80 +) BMDM mediante inspección visual o por citometría de flujo. Bloque 10 5 células con anti-CD16 centésima / CD32 en PBS durante 20 minutos en 100 l de PBS, se incuban con 1/200 anti-CD11b-FITC además 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 a TA, lavado y analizar por citometría de flujo. Nota: los macrófagos derivados de médula ósea de ratón El cultivo se ha publicado en detalle anteriormente en esta revista por Ying et al 11.. Sembrar las células 50.000 (recuentos de células óptimas necesitan ser optimizados) por pocillo en una microplaca de cultivo de células en 100 l de medio de cultivo. No sembrar células en los pozos de corrección de fondo (A1, A12, H1, H12) y poner medio solamente (sin células) en estos pozos. Sugerencia: Mantenga la pipeta en un ángulo uncombate de la mitad del lado de los pozos para la capa celular más homogénea. Permita que las células se asienten a temperatura ambiente en una campana de cultivo de células durante 1 hora. Esto promoverá la distribución uniforme de células y reducir los efectos de borde. Supervisar el cumplimiento con un microscopio y la cultura en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Tres horas después de la siembra, estimular las células durante 24 horas con 10 ng / ml de LPS, o 20 ng / ml recombinante de ratón IL-4 para generar M1 o M2 macrófagos, respectivamente. Incluir los macrófagos no tratados naïve (M0) como control. Evaluar adecuada M1 y M2 macrófagos polarización mediante la medición de la secreción de IL-6, IL-12 inducida por LPS, TNF (ELISA) y IL-4 inducida por la arginasa-1 actividad y / o MMR (CD206) y MGL (CD301) expresión en la superficie (citometría de flujo) como se describió anteriormente 3,11. Nota: En este punto, las células pueden ser (pre) tratados con compuestos con farmacológicas de interés o macrófagos pueden ser estimulados con otros factores. Dado que, la variación entre pocillos separados podría ser substantial, es recomendable usar al menos 4 e idealmente 6 pocillos por condición. 2. Preparación del ensayo extracelular Flux Hidratar el cartucho del sensor un día antes de realizar el ensayo: Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de utilidad. Llenar cada pocillo de la placa de utilidad con 200 l de solución de calibrante y bajar el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad sumergiendo los sensores en la solución calibrante. Verifique el nivel de solución calibrador es lo suficientemente alta para mantener los sensores sumergidos y lugar en un no-CO 2 incubadora a 37ºC O / N. Preparar medio de ensayo en el día del ensayo como sigue: Cálido medio 50 ml de base XF a 37 ° C. Añadir 500 l 200 mM de L-glutamina para obtener una mM concentración final 2. Ajustar el pH a 7,4 usando NaOH 1 N y esterilizar con un filtro de 0,2 M y mantener el medio de ensayo a 37 ° C. Retire con cuidado el medio de cultivo celular de los macrófagos polarizadas y almacenarla a -20 ° C para su uso futuro (por ejemplo, ELISA para examinar la polarización de macrófagos adecuada). Lavar las células con medio de ensayo 100 l, añadir 180 l de medio de ensayo por pocillo y verificar bajo el microscopio que las células no se lavaron de distancia. Coloque la placa de cultivo de células en una incubadora a 37ºC sin CO 2 durante 1 hora antes de realizar la prueba. Prepare 10 x compuesto inyección de mezclas de A hasta D tal como se describe en la Tabla 1, se calienta a 37 ° C, ajustar el pH a 7,4 y esterilizar filtro. Hacer todos los compuestos en estas mezclas a 10x la concentración final en los pocillos de cultivo celular y optimizar estas concentraciones para cada tipo de célula. Cargue el cartucho del sensor usando las guías de carga provistos de volúmenes indicados (Tabla 1) de los preparados 10x mezclas de compuestos de la inyección en los puertos A, B, C y D, respectively. Mezcla / Inyección Compuestos El volumen agregado de conseguir 10x mezcla de (l) Volumen medio de ensayo (ml) Volumen inyectado durante la marcha (l) La concentración final en el ensayo LA 2,5 M (45%) de glucosa 300 2.7 20 25 mM segundo 5 mM oligomicina A (OM) 9 3.0 22 1,5 M do 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 M Solución 100 mM de piruvato sódico 300 1 mM re 5 mM antimicina A (AA) </td> 15 3.0 28 2,5 M Rotenona 5 mM (Rot) 7.5 1,25 M Tabla 1. mezclas de inyección. 3. Caracterización Bioenergético de polarizado M1 y M2 BMDM utilizando un extracelular Flux Analizador Crear una plantilla de ensayo con el asistente de ensayo con MIX 2 minutos y 3 veces minutos medir y (al menos) 3 mediciones de mezcla y de tipos de bucles antes de cada una de las 4 inyecciones (Tabla 1) y después de la última inyección. Nota: Estas concentraciones son válidos para los macrófagos derivados de médula ósea y RAW264.7 líneas celulares de macrófagos, pero deben ser optimizados para cada tipo de célula. Se necesita Adición de piruvato en la mezcla de FCCP para alimentar la respiración máxima. Empieza la carrera empujando la parte inferior de inicio y siga las instrucciones del aparato. Primera carga el cocheplaca de cartucho con las sondas hidratados para permitir la calibración de aparatos y próxima carga la placa celular. Después del ensayo, desechar cuidadosamente todo medio de ensayo y almacenar la cultura de microplacas celulares analizadas a -20 ° C para una futura normalización de células usando el kit de ensayo de proliferación celular como se describe en detalle por el proveedor. Brevemente, preparar un tampón de lisis celular 1x diluyendo el componente B de 20 veces en agua destilada y diluir el compuesto A 400 veces en el tampón de lisis celular 1x. Añadir 200 l por pocillo, incubar 5 minutos a temperatura ambiente y medir la fluorescencia con ~ 180 nm de excitación y de ~ 520 nm máximos de emisión. Nota: Cuando se trabaja con las células no adherentes o si la mala adherencia es una preocupación, el kit de proliferación celular directa se puede utilizar como una alternativa ya que este protocolo no requiere desechar todo medio de ensayo. Sin embargo, este protocolo directa es ligeramente menos sensible en comparación con el protocolo utilizado en este laboratorio. Después de la medición de la fluorescencia, normalizarel recuento de células en cada pocillo como una relación en la que el recuento de células promedio de todos los pocillos de macrófagos no tratados previamente se ha fijado en 1. Nota: La cuantificación de proteínas (por ejemplo, usando un ensayo de BCA) podría ser utilizado como una forma alternativa para normalizar los recuentos de células. Sin embargo, en nuestras manos este ensayo fue menos sensible en comparación con el kit de ensayo de proliferación celular.