Метаболический характеристика поляризованных M1 и M2 из костного мозга макрофагов, используя анализ в реальном времени внеклеточной Flux
Summary
Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.
Abstract
Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization.
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC).
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage’s metabolic phenotype and inflammatory status.
Introduction
В то время как макрофаги играют центральную роль в практически всех заболеваний, молекулярные механизмы, которые регулируют их фенотип до сих пор не разгадана полностью. Макрофаги проявлять высокую неоднородность и в ответ на микросреды принять различные фенотипы 1. ЛПС (+ IFN,), индуцированного в классическом активирована M1 или М (LPS) макрофаги способствуют воспаление и защитить хозяина против различных типов микроорганизмов угроз из 2. Другие используют IFN, отдельно или в сочетании с TNF, как стимулов, чтобы вызвать M1 поляризацию. ИЛ-4 и / или IL-13 индуцирует активацию макрофагов и альтернативный них М2 или М (ИЛ-4) клетки являются мощными супрессоров и контроллеры текущих иммунных реакций 3. Поляризованные макрофаги отображения отличное регулирование клеточного метаболизма с ЛПС-активированными макрофагами M1 проходит метаболический выключатель к повышению гликолиза 4-6. Окисления, наоборот, усиливается жирных кислот (ФАО) и митохондриальной oxidativе фосфорилирования (OXPHOS) обеспечивает устойчивый энергии в Ил-4-индуцированных М2 макрофаги 7-9. Таким образом, изменения метаболизма является не только характеристикой поляризованных макрофагов подмножеств, он также является необходимым условием для правильной поляризации и воспалительного регулирования. Важно отметить, что ингибирование гликолиза или OXPHOS / ФАО было продемонстрировано, ухудшают M1 или M2 активации соответственно 8,10. Таким образом, выявление метаболические изменения в макрофагах может быть применен в качестве инструмента для оценки состояния поляризации их и воспалительный потенциал.
Последовательное анализ, который измеряет макрофагов метаболизм, следовательно, может быть использован для прогнозирования ли препарат, ген сбить или другое лечение влияет макрофагов поляризации и функции. В этом видео, внеклеточный анализатор потока используется для характеристики биоэнергетики профили наивных, М1 и М2 макрофаги.
Эта рукопись подробно оптимизированный протокол, который позволяет измерятьвсех соответствующих параметров гликолиза (гликолиз, максимальная гликолиза и гликолитических резервных) и митохондриальных характеристик функций (общая дыхания, базальная митохондриального дыхания, АТФ производства, утечки протонов, максимальная дыхания и запчасти дыхательных мощности) в одном тесте. Используя эту экспериментальную установку, биоэнергетика можно сравнить между контролем и «измененной» (например, гена сбить, трансгенной сверхэкспрессии или фармакологическое лечение) клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью нашей лаборатории, чтобы понять, как макрофагов поляризации и функции, могут влиять на конечную цель, чтобы улучшить результат атеросклероза и других воспалительных условиях 12. Для оценки макрофагов поляризации, один, как правило, измеряет LPS (+ IFN,), индуцированного и IL-4-индуцированных экспрессию генов M1 и M2 маркерных генов (КПЦР), определяет IL-6, IL-12, TNF и NO секрецию (по ELISA и Грисс реакция) и рассматривает ИЛ-4 индуцированный CD71, CD206, CD273 и CD301 поверхности выражение (цитометрическим) и активность аргиназы 3,13. Кроме того, апоптоз анализы (по аннексина-V / окрашивания PI), фагоцитоз анализа (с флуоресцентные шарики латекса и / или pHrodo E.coli) и формирование пенистых клеток анализа (по поглощению DiI-oxLDL, LipidTOX нейтрального липида) окрашивания может быть выполнена с оценить функциональность макрофагов 14. Кроме того, внеклеточный анализ потока могут быть выполнены, чтобы измерить биоэнергетики профили поляризованного Macмакрофаги как новый и альтернативной функциональной считывания.
Эта рукопись показывает, что макрофагов поляризации вызывает метаболический перепрограммирование с ЛПС-индуцированной макрофагами коммутации к увеличению гликолиза в качестве источника энергии. С другой стороны, ИЛ-4-индуцированные М2 макрофаги использовать митохондриальную окислительное фосфорилирование в качестве основного источника АТФ. Важно отметить, что метаболический перепрограммирование не только дает энергию для конкретных требований М1 и М2 поляризованных макрофагах. В самом деле, метаболические изменения влияют метаболитов концентраций, которые являются прямыми регуляторами макрофагов фенотипа 10,15,16. Следовательно, макрофагов метаболизм не только характеристика (как показано здесь на рисунке 2), но также водителем различных состояний поляризации макрофагов и это новое знание поддерживается быстрый рост научно-исследовательской сфере immunometabolism в течение последних нескольких лет.
Тем не менее, надежные измерения метаболических профилей в макрофаги остается сложной и имел свои ограничения. В этом исследовании, внеклеточный анализатор потока применяется для решительно измерить гликолиза, гликолитический резерв, максимальный гликолитический потенциала, без гликолитический подкисление, базальную и максимальную дыхание, производство АТФ, свободное дыхания потенциала, утечку протонов и без дыхание митохондрий в режиме реального времени в минимальном количестве макрофагов.
Таким образом, мы изменили и улучшили протоколы производителя следующим образом. Стандартная Мито Стресс-тест (# 103015-100) предлагает использовать среду с глюкозой и пирувата и протокол с 3 инъекции (OM, FCCP, А.А. / красный). Мы решили начать с анализа глюкозы / пируват-среде, свободной, добавить глюкозу в качестве первой инъекции в порту A (как в гликолиза стресс-тест # 103020-100) и добавить пирувата вместе с разобщающий FCCP в порту С. В этом случае все соответствующие параметры гликолиза получены из измерений Ecar 1-9 и всей соответствующей информации о mitochondriаль функция из измерений OCR 4-15.
Обратите внимание, что очень важно, чтобы придать пируват вместе с FCCP топлива максимальный дыхание на разобщение. Перед использованием этой комбинированной протокол, следует также проверить, что 2-дезокси-D-глюкоза (2-DG) снижает уровень Ecar после анализа на базальных значений (1-3), и что записанные скорости Ecar 4-6 действительно из-за гликолиза. Кроме того, нужно понимать, что концентрации соединений и число клеток, используемые в этой рукописи действительны для мозга, полученных макрофагов костей и RAW264.7 макрофагов клеточных линий и должен быть оптимизирован для других типов клеток. Кроме того, следует отметить, что M-CSF, который используется для генерации мозга, полученных макрофаги костного способствует М2-типа противовоспалительное фенотип. Поэтому Представленные результаты от мозга, полученных макрофагов кости могут быть не полностью сопоставима с измерениями с первичной ткани резидентных макрофагов или макрофаги клеточных линий, которые не требуют M-CSF в течение клеточного culturiнг.
По сравнению с существующими методами, этот протокол требует минимальное количество макрофагов и быстро обеспечивает практически все основные метаболические характеристики клеток. Это приводит к достаточно избыточных клеток для выполнения других иммунологических анализах, и даже клетки, используемые для профилирования биоэнергетической еще может быть использована для других предназначена после анализа. Кроме того, особенно 96-луночный планшет формата позволяет оценить несколько условий в реальном времени, в то же время. Тем не менее, разница между отдельных скважин может быть значительным, и поэтому использование по крайней мере 4 скважин в состоянии часто желательно. Взятые это ограничение во внимание, описанный анализ внеклеточного поток по-прежнему позволяет работать более чем 10 экспериментальных условий (п = 6) сразу, что гораздо больше, чем традиционные методы.
В целом, эта статья предоставляет простой и воспроизводимый функциональный анализ, позволяющий измерения всю необходимую гликолиза и митохондриального параметровметры в поляризованных макрофагов подмножеств. Этот метод может служить в качестве будущего приложения для оценки функции макрофагов и оценить эффект различных манипуляций (например, ген сбить, новые фармацевтические препараты и т.д.) на (метаболического) фенотипа макрофагов в. Таким образом, внеклеточные потока данных может быть использован в сочетании с другими анализами, чтобы углубленный характеристику состояния активации макрофагов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project “Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis” (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.
Materials
| 23G and 25G needles | Becton Dickinson | #300800 and #300600 | To flushed bone marrow |
| 10 ml syringes | Becton Dickinson | #307736 | To flushed bone marrow |
| Petri dishes | Greiner | #639161 | To culture bone marrow cells |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #C7026 | For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells) |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #35011 | For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells) |
| XFe96 cell culture microplate | Seahorse Bioscience | #101085-004 | 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done |
| recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) | Peprotech | #214-14-B | Used to induced alternative macrophage activation |
| lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | #L2637 | Pro-inflammatory stimulus |
| Seahorse Sensor Cartridge | Seahorse Bioscience | #102416-100 | Contains the probes for pH and O2 measurement |
| Seahorse XF Calibrant | Seahorse Bioscience | #100840-000 | Needed to hydrate the probes overnight |
| XF base medium | Seahorse Bioscience | #102353-100 | Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes |
| L-glutamine | Life Technologies | #25030-081 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | #G8769 | Fuels glycolysis once added to the cells |
| oligomycin A | Sigma | #75351 | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | Sigma | #C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| 100 mM Sodium Pyruvate solution | Lonza | #BE13-115E | Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis |
| Antimycin A | Sigma | #BE13-115EA8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Rotenone | Sigma | #BE13-115EA8674R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Casy Cell Counter | Roche Diagnostics | #05 651 697 001 | Instrument to count cells |
| anti-CD16/CD32 | eBioscience | #14-0161 | Fc receptor block flow cytometry |
| anti-F4/80-APC-eFluor780 | eBioscience | #47-4801 | Antibody to stain macrophages |
| anti-CD11b-FITC | eBioscience | #11-0112 | Antibody to stain macrophages |
References
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
- Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
- Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
- Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436 (2014).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
- Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
- Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
- Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
- Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
- Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
- Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
- Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
- Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).
- Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).
