Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

1. Os macrófagos A cultura e polarização de Medula Óssea derivados Dia 0: Isolar fêmur e tíbia ossos de 6-10 semana ratos velhos de interesse (C57BL / 6 neste ensaio). Remover o tecido do músculo dos ossos e colocar os ossos numa placa de petri com 9 cm cheia de PBS gelado. Transfira os ossos de um prato de 9 centímetros de Petri cheia com etanol 70% e agitar suavemente a placa durante 30 segundos. Transfira os ossos para uma nova 9 centímetros placa de Petri cheia de gelo-frio PBS estéril. Cortar o fêmur ea tíbia em ambas as extremidades com tesoura estéril. Lave os ossos com 10 ml de gelo-frio PBS estéril usando uma seringa de 10 ml e uma agulha de 25 G. Recolha da medula óssea em um tubo de 50 ml. Transferir as células da medula óssea para um novo tubo de 50 ml usando uma agulha 23 G. Repita este passo com uma agulha de 25 G. Nota: Estes passos são necessários para remover aglomerados de células e resíduos ósseos. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Descarte o supernatant e ressuspender as células em meio de 40 ml de células de cultura (RPMI-1640 mais 2 mM de L-glutamina, 10% FCS, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 ug / ml) e 15% filtrou-se L-929 de células ( ATCC, CCL-1) meio contendo climatizados, M-CSF (ou, alternativamente, 10 ng mL-M-CSF / recombinante em vez de L-929 de meio condicionado de células). Nota: A geração de meio condicionado de células L-929 foi detalhado anteriormente neste jornal em 2013. 11 Cultura das células a partir de um murganho em duas placas de Petri de 15 cm (não utilizar placas tratadas de cultura de células uma vez que macrófagos não irá separar a partir desta plástico) em 20 ml de meio de cultura por placa em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. Adicionar 10 ml de meio de cultura de células fresco no dia 3, sem remover os mais velhos 20 ml meio de cultura celular. Substitua a forma de cada placa com 20 ml de meio de cultura fresco no dia 6. Fazendo isto, as células não aderentes também serão removidos. Dia 8: Separe as células, incubando-as a 5 mno a 37 ° C em 10 ml de solução salina de citrato (135 mM de cloreto de potássio mais citrato de sódio 15 mM em H2O, autoclavado) e lava-se com 10 ml de PBS. Contagem macrófagos osso maduro derivadas da medula (BMDM) no dia 8, utilizando um contador de células. Verifique a formação de maduro (CD11b + F4 / 80 +) BMDM por inspeção visual ou por citometria de fluxo. Bloco 10 5 células com anti-CD16 1/100 / CD32 em PBS durante 20 minutos em 100 ul de PBS, incubar com 1/200 anti-CD11b-FITC mais 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 à RT, lavagem e analisar por citometria de fluxo. Nota: os macrófagos derivados da medula óssea de rato A cultura foi publicada em detalhes anteriormente neste jornal por Ying et al 11.. Semente 50.000 células (contagem de células óptimas devem ser optimizados) por cavidade em uma microplaca de cultura de células em 100 ul de meio de cultura. Não semear células em poços de correção de fundo (A1, A12, H1, H12) e colocar apenas meio (sem células) nesses poços. Sugestão: Segure a pipeta em um ângulo umluta a meio do lado dos poços para camada de células mais homogênea. Permitir que as células de resolver à temperatura ambiente numa capa de cultura de células durante 1 h. Isto irá promover uma distribuição uniforme de células e reduzir efeitos de borda. Monitorar a aderência usando um microscópio e cultura num banho a 37 ° C, 5% de CO2. Três horas após o plaqueamento, estimular as células durante 24 horas com 10 ng / ml de LPS, ou 20 ng / ml de rato recombinante da IL-4 para gerar M1 ou M2 macrófagos, respectivamente. Incluir naïve (M0) macrófagos não tratados como um controle. Avaliar adequada M1 e M2 macrófagos polarização medindo induzida por LPS a secreção de IL-6, IL-12, TNF (ELISA) e IL-4 induzida pela arginase-1 atividade e / ou MMR (CD206) e MGL (CD301) a expressão de superfície (citometria de fluxo) conforme descrito anteriormente 3,11. Nota: Neste ponto, as células podem ser (pré) tenha sido tratada com com compostos farmacológicos de interesse ou os macrófagos podem ser estimuladas com outros factores. Uma vez que, a variação entre os poços separados pode ser substantial, é aconselhável a utilização de, pelo menos, 4 e, idealmente 6 poços por condição. 2. Preparação do Ensaio de Fluxo Extracelular Hidratar o cartucho do sensor, um dia antes de realizar o teste: Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade. Encher cada poço da placa de utilidade com 200 ul de solução de calibração e diminuir o cartucho do sensor sobre a placa de utilidade submergindo os sensores na solução de calibração. Verificar o nível da solução de calibração é alta o suficiente para manter os sensores e submersos num lugar não-CO 2 37 ° C incubadora S / N. Prepare meio de ensaio no dia do ensaio como se segue: 50 ml de meio de base XF Aquece-se até 37 ° C. Adicionar 500 ul de 200 mM de L-glutamina para obter uma concentração final de 2 mM. Ajustar o pH para 7,4 utilizando NaOH 1 N e esterilizar com um filtro de 0,2 uM e manter o meio de ensaio a 37 ° C. Suavemente remover o meio de cultura de células de macrófagos polarizadas e armazená-lo a -20 ° C para uso futuro (por exemplo, ELISA para examinar a polarização adequada de macrófagos). Lavam-se as células com meio de ensaio de 100 ul, adicionar meio de ensaio de 180 ul por poço e verificar ao microscópio as células que não foram lavados. Colocar a placa de cultura de células em um temperatura de 37 ° C sem incubadora de CO2 durante 1 hora antes do procedimento de ensaio. Preparar 10 x compostos para injecção misturas A até D, tal como descrito na Tabela 1, aquecer até 37 ° C, ajustar o pH para 7,4 e esterilizar filtro. Fazer todos os compostos nessas misturas em 10x a concentração final em poços de cultura de células e optimizar estas concentrações para cada tipo de célula. Coloque o cartucho do sensor usando as guias de carregamento fornecidos com volumes indicados (Tabela 1) das misturas de compostos 10x injeção preparados nos portos A, B, C e D, respectively. Mistura / Injecção Compostos Volume adicionado para obter 10x mistura (ul) Ensaio Volume Médio (ml) Volume injetado durante a execução (ul) A concentração final no ensaio UMA 2,5 M (45%) de glucose 300 2.7 20 25 mM B 5 mM de oligomicina A (OM) 9 3.0 22 1,5 uM C MM FCCP 5 9 2.7 25 1,5 uM Solução 100 mM de piruvato de sódio 300 1 mM D 5 mM antimicina A (AA) </td> 15 3.0 28 2,5 uM 5 mM rotenone (Rot) 7,5 1,25 mM Tabela 1. misturas de injecção. 3. Caracterização bioenergética da Polarizada M1 e M2 BMDM usando um Extracelular Flux Analyzer Criar um modelo de ensaio com o assistente de ensaio com MIX 2 minutos e 3 vezes minuto medir e (pelo menos) 3 mix e de taxa de medições laços antes de cada um dos 4 injecções (Tabela 1) e após a última injecção. Nota: Estas concentrações são válidas para os macrófagos derivados da medula óssea e RAW264.7 linhas celulares de macrófagos, mas deve ser optimizada para cada tipo de célula. Adição de piruvato na mistura FCCP é necessário para abastecer respiração máxima. Comece a correr, empurrando o fundo de início e siga as instruções do aparelho. Primeira carga do carroplaca cartucho com as sondas hidratados para permitir calibração por aparelhos e próxima carga da placa de células. Após o ensaio, descartar cuidadosamente todos meio de ensaio e armazenar a microplacas de cultura celular analisada a -20 ° C para futuro normalização celular utilizando o kit de ensaio de proliferação celular, como descrito em detalhe pelo fornecedor. Resumidamente, preparar um tampão de lise de células-1x diluindo o componente B de 20 vezes em água destilada e dilui-se o composto A de 400 vezes no tampão de lise de células-1x. Adicionar 200 ul por poço, incubar 5 minutos à temperatura ambiente e medir a fluorescência com excitação a 180 nm ~ e ~ 520 nm de emissão máximos. Nota: Quando se trabalha com células não-aderentes ou se baixa adesão é uma preocupação, o kit de proliferação de células directo pode ser usado como uma alternativa uma vez que este protocolo não necessita descartando todos meio de ensaio. No entanto, este protocolo direto é um pouco menos sensível em comparação com o protocolo utilizado neste laboratório. Após a medição de fluorescência, normalizara contagem de células em cada poço como uma razão em que a contagem média de células de todas as cavidades sem tratamento prévio de macrófagos é fixada em 1. Nota: a quantificação de proteínas (por exemplo, utilizando um ensaio BCA) poderia ser utilizado como uma forma alternativa para normalizar as contagens de células. No entanto, nas nossas mãos este ensaio foi menos sensível em comparação com o kit de ensaio de proliferação celular.