リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

1.培養し、偏光骨髄由来マクロファージ 0日目：関心の6-10週齢のマウス（このアッセイにおいてC57BL / 6）から大腿骨と脛骨の骨を分離します。 骨から筋肉組織を削除し、氷冷PBSで満たされた9センチメートルペトリ皿に骨を置きます。 70％エタノールで満たさ9センチメートルペトリ皿に骨を移し、静かに30秒間プレートを振ります。 氷冷滅菌PBSで満たされた新鮮9センチメートルペトリ皿に骨を移します。 滅菌はさみで両端の大腿​​骨と脛骨をカットします。 10ミリリットルの注射器と25 Gの針を用いて10ミリリットルの氷冷滅菌PBSで骨をフラッシュします。 50mlのチューブで骨髄を収集します。 23Gの針を使用して、新しい50mlチューブに骨髄細胞を転送します。 25 G針で、この手順を繰り返します。注：これらのステップは、細胞塊と骨の残留物を除去するために必要とされます。 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。 SUPを破棄ernatant、40mlの細胞培養培地（RPMI-1640プラス2mMのL-グルタミン、10％FCS、ペニシリン（100 U / ml）を、ストレプトマイシン（100μg/ ml）および15％濾過L-929細胞中で細胞を再懸濁（ ATCC、CCL-1）は、M-CSF（または代わりに10ng / mlの組換えM-CSFの代わりにL-929細胞馴化培地）を含有する培地を-conditioned。 注：L-929細胞馴化培地の発生が早く、このジャーナルで2013年11で詳述されました文化37℃、5％CO 2インキュベーター中でプレートあたり20ミリリットルの培地中の2つの15センチメートルペトリ皿（マクロファージは、このプラスチックから離れないので、細胞培養処理プレートを使用していない）内の1つのマウス由来の細胞。 20 mlのに古い細胞培養培地を除去することなく、3日目に10 mlの新鮮な細胞培養培地を加えます。 これを行うと6日目に20ミリリットル新鮮な培養培地で各プレートの古い培地を交換し、非接着細胞も削除されます。 8日目： 彼らに5メートルをインキュベートすることによって細胞を切り離し37℃での10ml中のクエン酸生理食塩水で（135mMの塩化カリウムを加え、H 2 O中の 15mMのクエン酸ナトリウム、オートクレーブ処理）および10 mlのPBSで洗浄します。セルカウンターを使用して8日目に成熟した骨髄由来マクロファージ（BMDM）をカウントします。 目視検査によって、またはフローサイトメトリーによって成熟の形成（のCD11b + F4 / 80 +）BMDMを確認してください。 100μlのPBS中で20分間、PBS中1/100抗CD16 / CD32とのブロック10 5個の細胞を 、室温で抗CD11b-FITC 1/200プラス1/200抗F4 / 80-APC-Cy7のでインキュベート、洗浄フローサイトメトリーによって分析します。 注意：マウス骨髄由来マクロファージを培養する英ら 11によって以前本誌で詳細に掲載されました。 100μlの培養培地中の細胞培養マイクロプレートにおいてウェル当たり50,000個の細胞種（最適な細胞数が最適化される必要があります）。バックグラウンド補正のウェル中の細胞（A1、A12、H1、H12）をシードし、これらのウェルに培地のみ（細胞）を入れないでくださいヒント：角αでピペットを保持途中で最も均一な細胞層のための井戸の側を下に試合。 細胞を1時間細胞培養フード内で室温で安定するようにします。これも細胞分布を促進し、エッジ効果を減少させます。 37℃、5％CO 2インキュベーター中で、顕微鏡や文化を使用して遵守を監視します。 めっき後の3時間は、それぞれ、M1またはM2マクロファージを生成するために10ng / mlのLPS、または20 ngの/ mlの組換えマウスIL-4で24時間細胞を刺激します。コントロールとして未処理のナイーブ（M0）マクロファージを含めます。 IL-6のLPS誘導性の分泌を測定することによって、適切なM1とM2マクロファージ偏光を評価し、IL-12、TNF（ELISA）およびIL-4誘発性のアルギナーゼ-1活性および/またはMMR（CD206）およびMGL（CD301）の表面発現先に説明したように3,11（フローサイトメトリー）。 注：この時点で、細胞は、（プレ）とすることができる他の因子を刺激することができる関心またはマクロファージの薬理学的化合物で処置されました。以来、別々のウェル間の変動は潜水艦であるかもしれませんtantial、条件あたり少なくとも4、理想的には6井戸を使用することをお勧めします。 細胞外フラックスアッセイの調製 1日アッセイを実行する前に、センサカートリッジを水和： 次のユーティリティプレートに逆さまセンサカートリッジを置きます。 較正溶液200μlとユーティリティプレートの各ウェルを記入し、較正溶液にセンサーを沈めるユーティリティ板上にセンサカートリッジを下げてください。 較正液レベルは非CO 2、37℃のインキュベーターO / Nに沈めセンサーと場所を維持するのに十分な高さを確認してください。 以下のようにアッセイの日にアッセイ培地を準備します。 37°Cまでのウォーム50ミリリットルXFベース媒体。 2 mMの最終濃度を得るために、500μlの200mMのL-グルタミンを追加します。 1 N NaOHを用いてpHを7.4に調整し、0.2μmのフィルターで滅菌し、37℃でアッセイ培地を保ちます。 ゆっくり（ 例えば、ELISA、適切なマクロファージの偏光を調べるために）偏マクロファージからの細胞培養培地を除去し、将来の使用のために-20℃で保管してください。 100μlのアッセイ培地で細胞を洗浄し、ウェル当たり180μlのアッセイ培地を追加し、細胞が洗い流されなかった顕微鏡で確認してください。アッセイの実行の前に1時間、CO 2なしで37℃のインキュベーター内で細胞培養プレートを置きます。 表1に記載されているように7.4、フィルター滅菌するためにpHを調整、37°C ​​まで暖かく、Dまでの10×注入化合物の混合物Aを準備します。 細胞培養ウェル中の10倍の最終濃度で、これらの混合物中のすべての化合物を作成し、各細胞型のためのこれらの濃度を最適化します。 ポートA、B、CおよびD、respeで調製された10倍噴射化合物混合物の示された容積（ 表1）を備えた装填ガイドを使用して、センサカートリッジをロードしますctively。 混合/注入 化合物 ボリュームは10倍混合物（μl）を取得するために追加されました ボリュームアッセイ培地（ミリリットル） 実行中に注入された容量（μL） アッセイにおける最終濃度 A 2.5 M（45％）グルコース 300 2.7 20 25mMの B Aオリゴ5ミリ（OM） 9 3.0 22 1.5μM C言語 5 mMのFCCP 9 2.7 25 1.5μM 100 mMのピルビン酸ナトリウム液 300 1 mMの D 5 mMのアンチマイシンA（AA） </tD> 15 3.0 28 2.5μM 5mMのロテノン（腐敗） 7.5 1.25μM 表1注入の混合物が含まれます。 細胞外フラックスアナライザーを使用して偏光M1とM2 BMDMの3生体エネルギー特性評価 2分のMIXと測定時間と（少なくとも）3ミックスと速度の測定は4回の注射（ 表1）のそれぞれの前に、最後の注射後にループ3分で分析ウィザードを使用して分析テンプレートを作成します。 注：これらの濃度は、骨髄由来マクロファージおよびRAW264.7マクロファージ細胞株に対して有効であるが、各細胞型のために最適化されるべきです。 FCCP混合物中のピルビン酸を追加すると、最大の呼吸を燃料に必要とされています。 スタート底を押して実行を開始し、装置の指示に従ってください。最初の車をロード水和プローブとtridgeプレートが装置と次のロードセルプレートによりキャリブレーションを可能にします。 分析した後、慎重にすべてのアッセイ培地を廃棄し、供給者により詳細に記載されるように、細胞増殖アッセイキットを用いて、将来のセルの正規化のために-20℃で分析した細胞培養マイクロプレートを格納します。 簡単に説明すると、蒸留水に成分B 20倍に希釈し、1×細胞溶解緩衝液を調製し、化合物を1×細胞溶解緩衝液で400倍に希釈します。 、ウェルあたり200μlを添加し、室温で5分間インキュベートし、〜180 nm励起と〜520 nmの発光極大を持つ蛍光を測定します。 注：非接着細胞を操作する場合、または乏しい密着性が懸念される場合に、このプロトコルは、全てのアッセイ培地を捨てる必要がないので、直接の細胞増殖キットは、代替として使用することができます。しかし、この直接のプロトコルは、このラボで使用されるプロトコルに比べてわずかにあまり敏感ではありません。 蛍光測定した後、正規化それぞれのセルの数だけでなく、全てのナイーブなマクロファージのウェルの平均細胞数が1に設定された比率。 注：（たとえば、BCAアッセイを用いて）タンパク質定量は、細胞数を正規化するための代替方法として使用することができます。しかし、私たちの手で、このアッセイは、細胞増殖アッセイキットに比べて感度が低いでした。