Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

1. I macrofagi coltura e polarizzante midollo osseo Day 0: femore e tibia Isolare ossa di 6-10 settimane di età i topi di interesse (C57Bl / 6 in questo test). Rimuovere il tessuto muscolare dalle ossa e posto le ossa in un nove centimetri Petri-piatto pieno di ghiaccio freddo PBS. Trasferire le ossa per un piatto di nove centimetri di Petri riempite con il 70% di etanolo e agitare leggermente la piastra per 30 sec. Trasferire le ossa per un nuovo 9 centimetri piastra di Petri pieno di ghiaccio freddo PBS sterile. Tagliare il femore e tibia ad entrambe le estremità con le forbici sterili. Sciacquare le ossa con 10 ml di ghiacciata PBS sterile utilizzando una siringa da 10 ml e un ago 25 G. Raccogliere il midollo osseo in un tubo da 50 ml. Trasferire le cellule del midollo osseo in un tubo da 50 ml con un ago 23 G. Ripetere questa fase con un ago da 25 G. Nota: sono necessari Questi passaggi per eliminare grumi di cellule e residui ossei. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il supernatant e risospendere le cellule in terreno 40 ml coltura cellulare (RPMI-1640 più 2 mM L-glutammina, 10% FCS, penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 mcg / ml) e 15% filtrato L-929 cellule ( ATCC CCL-1) medium contenente -conditioned M-CSF (o in alternativa 10 ng / ml M-CSF ricombinante invece di L-929 a medio-cell condizionata). Nota: La generazione di medio-cell condizionata L-929 è stato dettagliato in precedenza in questa rivista nel 2013. 11 Coltivare le cellule da un mouse a due 15 centimetri piastre di Petri (non utilizzare piastre di coltura trattata con cellule da macrofagi non si staccherà da questa plastica) in 20 ml di terreno di coltura per piastra in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Aggiungere 10 ml fresco mezzo di coltura cellulare il giorno 3, senza rimuovere i 20 ml più vecchio mezzo di coltura cellulare. Sostituire il vecchio mezzo di ogni piatto con 20 ml di terreno di coltura fresco il giorno 6. In questo modo, saranno rimosse le cellule non aderenti. 8 ° giorno: Staccare le cellule incubando loro 5 min a 37 ° C in 10 ml di soluzione salina di citrato (cloruro di potassio 135 mM e 15 mM citrato di sodio in H 2 O, autoclavato) e lavare con 10 ml di PBS. Conte macrofagi osso maturo derivate dal midollo (BMDM) il giorno 8 con un contatore di cellule. Verificare la formazione di una matura (CD11b + F4 / 80 +) BMDM mediante ispezione visiva o mediante citometria a flusso. Block 10 5 cellule con 1/100 anti-CD16 / CD32 in PBS per 20 minuti a 100 l di PBS, incubare con 1/200 anti-CD11b-FITC più 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 a temperatura ambiente, lavaggio e analizzare mediante citometria a flusso. Nota: i macrofagi derivate dal midollo osseo di topo Coltura è stato pubblicato in dettaglio in precedenza in questa rivista da Ying et al 11.. Seed 50.000 cellule (conta delle cellule ottimali devono essere ottimizzate) per bene in una micropiastra coltura cellulare in 100 microlitri terreno di coltura. Non seminare cellule in pozzi di correzione di fondo (A1, A12, H1, H12) e mettere a medio solo (non le cellule) in questi pozzi. Suggerimento: Tenere la pipetta in un angolo unincontro a metà strada lungo il lato dei pozzi per strato cellulare più omogeneo. Permettono alle cellule di stabilirsi a temperatura ambiente in una cappa di coltura cellulare per 1 ora. Ciò promuoverà la distribuzione uniforme delle cellule e ridurre gli effetti di bordo. Monitorare l'adesione utilizzando un microscopio e la cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Tre ore dopo la placcatura, stimolare le cellule per 24 ore con 10 ng / ml LPS, o 20 ng / ml il mouse ricombinante IL-4 per generare M1 o M2 macrofagi, rispettivamente. Includere trattati naïve (M0) macrofagi come controllo. Valutare corretta M1 e M2 macrofagi polarizzazione misurando LPS-indotta secrezione di IL-6, IL-12, TNF (ELISA) e IL-4-indotta arginase-1 e / o MMR (CD206) e MGL (CD301) espressione di superficie (citometria a flusso) come descritto in precedenza 3,11. Nota: A questo punto, le cellule possono essere (pre) -treated con composti farmacologici di interesse o macrofagi possono essere stimolati con altri fattori. Dal momento che, la variazione tra pozzetti separati potrebbe essere substantial, è consigliabile utilizzare almeno 4 e idealmente 6 pozzetti per condizione. 2. Preparazione del saggio extracellulare Flux Idratare la cartuccia della sonda un giorno prima di eseguire il test: Posizionare la cartuccia della sonda a testa in giù accanto al piatto di utilità. Riempire ciascun pozzetto della piastra di servizio con 200 ml di soluzione calibrante e abbassare la cartuccia del sensore sulla piastra utility immergendo i sensori nella soluzione calibrante. Verificare il livello della soluzione calibrante è abbastanza alto per mantenere i sensori sommerse e posto in un non-CO 2 a 37 ° C incubatore O / N. Preparare terreno di coltura il giorno del test come segue: Caldo medio 50 ml XF di base a 37 ° C. Aggiungere 500 microlitri 200 mm L-glutammina si porta sul 2 mM concentrazione finale. Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1 N e sterilizzare con un filtro da 0,2 micron e mantenere il terreno di coltura a 37 ° C. Rimuovere delicatamente il terreno di coltura cellulare dai macrofagi polarizzati e conservarlo a -20 ° C per un uso futuro (ad esempio ELISA esaminare corretto macrofagi polarizzazione). Lavare le cellule con 100 microlitri terreno di coltura, aggiungere 180 microlitri terreno di coltura per pozzetto e verificare sotto il microscopio che le cellule non sono state spazzate via. Posizionare la piastra di coltura cellulare in un 37 ° C incubatore senza CO 2 per 1 ora prima la sessione d'analisi. Preparare 10 x composto iniezione miscele A fino D come descritto in Tabella 1, riscaldare a 37 ° C, regolare il pH a 7,4 e filtro sterilizzare. Rendere tutti composti in queste miscele a 10 volte la concentrazione finale nei pozzetti di coltura cellulare e ottimizzare queste concentrazioni per ogni tipo di cellula. Caricare la cartuccia della sonda con le guide di carico forniti con volumi indicati (Tabella 1) dei preparati 10x miscele composte iniezione nei porti A, B, C e D, faucibusctively. Miscela / Iniezione Composti Volume aggiunto per ottenere 10x miscela (ml) Volume del dosaggio medio (ml) Volume iniettato durante il funzionamento (ml) Concentrazione finale nel saggio UN 2,5 M (45%) di glucosio 300 2.7 20 25 MM B 5mM oligomicina A (OM) 9 3.0 22 1.5 micron C 5 FCCP mM 9 2.7 25 1.5 micron Soluzione 100 mM sodio piruvato 300 1 mM D 5 mM Antimicina A (AA) </td> 15 3.0 28 2,5 micron 5 rotenone mm (Rot) 7.5 1.25 micron Tabella 1. miscele di iniezione. 3. Caratterizzazione bioenergetica di Polarized M1 e M2 BMDM utilizzando un extracellulare Flux Analyzer Creare un modello di test con la procedura guidata test con due minuti MIX e 3 volte minuti di misurare e (almeno) 3 misurazioni mix e dei tassi di cicli prima di ciascuno dei 4 iniezioni (Tabella 1) e dopo l'ultima iniezione. Nota: Queste concentrazioni sono valide per i macrofagi del midollo osseo e RAW264.7 linee cellulari dei macrofagi, ma dovrebbe essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Aggiunta piruvato nella miscela FCCP è necessaria per alimentare la respirazione massima. Inizia la corsa spingendo il fondo di avvio e seguire le istruzioni dell'apparato. In primo luogo di carico della vetturaPiastra cartuccia con le sonde idratati per permettere la calibrazione da apparecchi e successivo carico la piastra di cella. Dopo il test, scartare accuratamente tutto terreno di coltura e memorizzare la coltura cellulare analizzato micropiastra a -20 ° C per una futura normalizzazione cella utilizzando il kit di analisi proliferazione cellulare come descritto in dettaglio dal fornitore. Brevemente, preparare una memoria di cella-lisi 1x diluendo componente B 20 volte in acqua distillata e diluire composto A 400 volte nel tampone di lisi cellulare 1x. Aggiungere 200 ul per pozzetto, incubare 5 minuti a temperatura ambiente e misurare la fluorescenza con ~ 180 nm di eccitazione e ~ 520 massimi di emissione nm. Nota: Quando si lavora con le cellule non aderenti o scarsa aderenza è un problema, il kit di proliferazione cellulare diretto può essere usato come alternativa poiché questo protocollo non richiede scartando tutto terreno di coltura. Tuttavia, questo protocollo diretta è leggermente meno sensibile rispetto al protocollo utilizzato in questo laboratorio. Dopo la misurazione della fluorescenza, normalizzareil numero di cellule in ciascun pozzetto come rapporto in cui la conta cellulare media di tutti i pozzetti macrofagi naive è impostato a 1. Nota: Proteine ​​quantificazione (ad esempio utilizzando un test BCA) potrebbe essere usato come un modo alternativo per normalizzare le cellule conteggi. Tuttavia, nelle nostre mani questo saggio era meno sensibile rispetto al kit saggio di proliferazione cellulare.