אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת
Summary
Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.
Abstract
Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization.
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC).
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage’s metabolic phenotype and inflammatory status.
Introduction
בעוד מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי כמעט בכל מחלות, המנגנונים המולקולריים המווסתים את הפנוטיפ שלהם הם עדיין לא פרומים באופן מלא. המקרופאגים להציג גבוהה ההטרוגניות ובתגובה למייקרו-הסביבה לאמץ פנוטיפים שונים 1. LPS (+ IFNγ) -induced מופעל קלסי מקרופאגים M1 או M (LPS) לקדם ולהגן על דלקת המארח נגד סוגים שונים של איומי חיידקים 2. אחרים משתמשים IFNγ לבד או בשילוב עם TNF כגירויים לעורר קיטוב M1. IL-4 ו / או IL-13 גורם הפעלת מקרופאג חלופית וM2 אלה או M (IL-4) תאי מדכאי ובקרים של תגובות חיסוני מתמשכות 3 חזקים. מקרופאגים מקוטבים להציג רגולציה שונה של חילוף חומרים תאיים עם מקרופאגים M1 מופעלים-LPS עוברים מתג חילוף חומרים לגליקוליזה המשופרת 4-6. חמצון של חומצות שומן לעומת זאת, משופרים (FAO) וoxidativ המיטוכונדריהזירחון הדואר (OXPHOS) מספק אנרגיה מתמשכת במקרופאגים M2 מושרה-IL-4 7-9. לפיכך, חילוף חומרים משתנים הוא לא רק מאפיין של תת מקרופאג מקוטב, הוא גם תנאי מוקדם לקיטוב נכון ורגולציה דלקתית. חשוב לציין, העיכוב של גליקוליזה או OXPHOS / FAO הודגם לפגוע בהפעלת M1 או M2, בהתאמה 8,10. ככזה, שינויים מטבוליים זיהוי במקרופאגים יכולים להיות מיושמים ככלי להערכת מצב הקיטוב שלהם ופוטנציאל דלקתי.
Assay עקבי המודד את חילוף החומרים מקרופאג לכן יכול לשמש כדי לחזות אם תרופה, גן להפיל או טיפול אחר משפיע על קיטוב מקרופאג ותפקוד. בסרטון הזה, מנתח שטף תאי משמש כדי לאפיין את פרופילי bioenergetics של מקרופאגים הנאיביים, M1 ו- M2.
כתב יד זה מפרט פרוטוקול מותאם המאפשר המדידהשל כל הפרמטרים הרלוונטיים גליקוליזה (גליקוליזה, גליקוליזה המקסימלי ומילואים glycolytic) ומאפיינים של המיטוכונדריה פונקציה (נשימה כוללת, נשימה המיטוכונדריאלי בסיסית, ייצור ATP, דליפת פרוטון, נשימה מקסימלי ויכולת נשימה חילוף) בassay אחד. השימוש בהגדרת ניסוי זה, ניתן להשוות בין bioenergetics שליטה ו'שינה '(למשל גן להפיל, ביטוי יתר מהונדס או טיפול תרופתי) תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה של המעבדה שלנו היא להבין כיצד קיטוב ותפקוד מקרופאג יכולים להיות מושפע במטרה האולטימטיבית כדי לשפר את התוצאה של טרשת עורקים ומצבים דלקתיים אחרים 12. כדי להעריך קיטוב מקרופאג, אחד בדרך כלל מודד את LPS (+ IFNγ) -induced וIL-4-Induced ביטוי גנים של M1 וגני סמן M2 (qPCR), קובע IL-6, IL-12, TNF ואין הפרשה (על ידי ELISA וGriess תגובה) ובוחן CD71, ביטוי CD206, CD273 וCD301 פני השטח (על ידי cytometry זרימה) וarginase פעילות מושרה IL-4 3,13. בנוסף, מבחני אפופטוזיס (על ידי Annexin-V / הכתמת PI), מבחני phagocytosis (עם חרוזי ניאון לטקס ו / או coli pHrodo א) ומבחני היווצרות תאי קצף (על ידי ספיגת DiI-oxLDL, מכתים שומנים ניטראלי LipidTOX) יכולים להתבצע ל להעריך פונקציונלי מקרופאג 14. בנוסף, ניתוח שטף תאי ניתן לבצע כדי למדוד bioenergetics פרופילים של מק מקוטבrophages כקריאת נתונים פונקציונליים חדשה ואלטרנטיביות.
כתב יד זה מראה כי קיטוב מקרופאג גורם תכנות מחדש חילוף חומרים עם מקרופאגים המושרה LPS מעבר לגליקוליזה גדלה כמקור האנרגיה שלהם. לעומת זאת, מקרופאגים M2 מושרה-IL-4 להשתמש זרחון חמצוני המיטוכונדריה כמקור העיקרי של ה- ATP. חשוב לציין, תכנות מחדש חילוף חומרים לא רק מספק אנרגיה לדרישות מסוימות של מקרופאגים מקוטבים M1 ו- M2. ואכן, שינויים מטבוליים משפיעים ריכוזי המטבוליט שרגולטורים ישירים של פנוטיפ מקרופאג 10,15,16. לפיכך, חילוף החומרים מקרופאג הוא לא רק אופייני (כפי שמוצג כאן באיור 2), אלא גם נהג של מצבי קיטוב מקרופאג מובחנים והידע החדש הזה תמך בצמיחה המהירה של תחום מחקר immunometabolism במהלך השנים האחרונות.
עם זאת, מדידות חזקות של פרופילים מטבולים במאקרופאגים נשארו קשים ולא היו להם מגבלות. במחקר זה, מנתח שטף תאי מוחל למדוד גליקוליזה, מילואים glycolytic, קיבולת glycolytic מקסימלי, החמצה שאינה glycolytic, בסיסיים ונשימה מקסימלי, ייצור ATP, יכולת נשימה חילוף, דליפת פרוטון ונשימה אינה המיטוכונדריה בזמן אמת וחסונה בכמות מינימאלית של מקרופאגים.
לכן, אנו שונו ושופרו פרוטוקולים של היצרן כדלקמן. המבחן הסטנדרטי מתח מיטו (# 103,015-100) מציע להשתמש בינוני עם גלוקוז ופירובט ופרוטוקול עם 3 זריקות (OM, FCCP, AA / רוט). אנו בוחרים להתחיל assay עם גלוקוז / בינוני ללא פירובט, להוסיף סוכר כבזריקה ראשונה בנמל (כמו במבחן # מתח גליקוליזה 103,020-100) ולהוסיף פירובט יחד עם uncoupler FCCP בנמל ג בדרך זו , כל הפרמטרים גליקוליזה הרלוונטיים נגזרים ממדידות ECAR 1-9 וכל המידע הרלוונטי אודות mitochondriפונקצית אל ממדידות OCR 4-15.
שים לב שזה קריטי להזריק פירובט יחד עם FCCP דלק נשימה מקסימלי על שחרר. לפני השימוש בפרוטוקול משולב זה, יש גם לוודא ש2-Deoxy-D-גלוקוז (2-DG) מוריד את רמות ECAR לאחר assay לערכים הבסיסיים (1-3) וכי שיעורי ECAR נרשמו 4-6 אכן בשל לגליקוליזה. בנוסף, יש להבין כי ריכוזי המתחם ומספרים סלולריים בשימוש בכתב היד הזה תקפים למקרופאגים נגזרות מח עצם ושורות תאי מקרופאג Raw264.7 וצריך להיות מותאמים לסוגי תאים אחרים. יתר על כן, יש לציין כי M-CSF שמשמש להפקת מקרופאגים נגזרות מח עצם מקדם פנוטיפ אנטי דלקתי כמו-M2. התוצאות שהוצגו ממקרופאגים נגזרות מח העצם עשויות אפוא להיות לא ניתן להשוות באופן מלא למדידות עם מקרופאגים תושב רקמות ראשוניות או מקרופאגים שורות תאים שאינם דורשות M-CSF במהלך culturi תאng.
בהשוואה לשיטות קיימות, פרוטוקול זה דורש כמויות מינימליות של מקרופאגים ומספק במהירות כמעט את כל מאפייני תא חילוף חומרים בסיסיים. כתוצאה מכך מספיק תאים עודפים לבצע מבחני אחרים חיסוניים ואפילו תאים המשמשים לאפיון bioenergetics עדיין יכול לשמש לשני תכליתי לאחר assay. יתר על כן, בפורמט המסוים צלחת 96 גם מאפשר הערכת תנאים מרובים בזמן אמת באותו הזמן. ובכל זאת, הווריאציה בין בארות בודדות יכולה להיות משמעותית ולכן השימוש בלפחות 4 בארות לכל מצב הוא לעתים קרובות רצוי. נלקח בחשבון מגבלה זו, ניתוח השטף תאי תאר עדיין מאפשר להפעיל יותר מ -10 תנאי ניסוי (n = 6) בבת אחת, וזה הרבה יותר מאשר טכניקות מסורתיות.
בסך הכל, מאמר זה מספק assay התפקודי קל ושחזור המאפשר מדידה כל גליקוליזה הרלוונטית ופרמטר המיטוכונדריהאטות בתת מקרופאג מקוטב. טכניקה זו יכולה לשמש כיישום עתיד כדי להעריך את תפקוד מקרופאג ולהעריך את ההשפעה של מניפולציות שונות (להפיל, תרופות חדשות כגון: גן, וכו ') על הפנוטיפ של מקרופאג (חילוף חומרים). ככזה, ניתן להשתמש בנתונים שטף תאיים בשיתוף עם מבחני אחרים, כדי לאפשר אפיון מעמיק של מצב הפעלת מקרופאג.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project “Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis” (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.
Materials
| 23G and 25G needles | Becton Dickinson | #300800 and #300600 | To flushed bone marrow |
| 10 ml syringes | Becton Dickinson | #307736 | To flushed bone marrow |
| Petri dishes | Greiner | #639161 | To culture bone marrow cells |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #C7026 | For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells) |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #35011 | For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells) |
| XFe96 cell culture microplate | Seahorse Bioscience | #101085-004 | 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done |
| recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) | Peprotech | #214-14-B | Used to induced alternative macrophage activation |
| lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | #L2637 | Pro-inflammatory stimulus |
| Seahorse Sensor Cartridge | Seahorse Bioscience | #102416-100 | Contains the probes for pH and O2 measurement |
| Seahorse XF Calibrant | Seahorse Bioscience | #100840-000 | Needed to hydrate the probes overnight |
| XF base medium | Seahorse Bioscience | #102353-100 | Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes |
| L-glutamine | Life Technologies | #25030-081 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | #G8769 | Fuels glycolysis once added to the cells |
| oligomycin A | Sigma | #75351 | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | Sigma | #C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| 100 mM Sodium Pyruvate solution | Lonza | #BE13-115E | Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis |
| Antimycin A | Sigma | #BE13-115EA8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Rotenone | Sigma | #BE13-115EA8674R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Casy Cell Counter | Roche Diagnostics | #05 651 697 001 | Instrument to count cells |
| anti-CD16/CD32 | eBioscience | #14-0161 | Fc receptor block flow cytometry |
| anti-F4/80-APC-eFluor780 | eBioscience | #47-4801 | Antibody to stain macrophages |
| anti-CD11b-FITC | eBioscience | #11-0112 | Antibody to stain macrophages |
References
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
- Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
- Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
- Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436 (2014).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
- Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
- Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
- Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
- Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
- Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
- Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
- Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
- Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).
- Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).
