Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

1. Anzucht und Polarisationsknochenmark-Makrophagen Tag 0: Isolieren Oberschenkel und Schienbein Knochen 6-10 Wochen alten Mäusen von Interesse (C57BL / 6 in diesem Test). Entfernen Muskelgewebe aus den Knochen und legen Sie die Knochen in einer 9 cm Petrischale mit eiskaltem PBS gefüllt. Übertragen Sie die Knochen in eine 9 cm Petrischale mit 70% Ethanol gefüllt und schütteln Sie die Platte für 30 Sekunden. Übertragen Sie die Knochen in eine frische 9 cm Petrischale mit eiskaltem sterilem PBS gefüllt. Schneiden Sie die Oberschenkel und Schienbein an beiden Enden mit einer sterilen Schere. Spülen Sie die Knochen mit 10 ml eiskaltem sterilem PBS mit einem 10-ml-Spritze und einer 25 G-Nadel. Sammeln Sie das Knochenmark in einem 50-ml-Tube. Übertragen Sie die Knochenmarkszellen zu einem neuen 50-ml-Röhrchen mit einer 23 G-Nadel. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer 25 G-Nadel. Anmerkung: Diese Schritte sind erforderlich, um Zellklumpen und Knochenreste zu entfernen. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die supernatant und Resuspendieren der Zellen in 40 ml Zellkulturmedium (RPMI-1640 plus 2 mM L-Glutamin, 10% FCS, Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml) und 15% filtriert L-929-Zellen ( ATCC, CCL-1) -conditioned Medium anstelle enthaltenden M-CSF (oder alternativ 10 ng / ml rekombinantem M-CSF von L-929-Zellen konditionierten Medium). Hinweis: Die Erzeugung von L-929-Zellen konditionierten Medium wurde zuvor in dieser Zeitschrift im Jahr 2013 11 detaillierte Kultur die Zellen von einer Maus in zwei 15 cm Petrischalen (keine Zellkultur-behandelten Platten, da Makrophagen nicht aus diesem Kunststoff lösen) in 20 ml Kulturmedium pro Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator. 10 ml frisches Zellkulturmedium an Tag 3, ohne Entfernen der 20 ml älteren Zellkulturmedium. Ersetzen Sie die alte mittel jeder Platte mit 20 ml frischem Kulturmedium an Tag 6. Auf diese Weise wird nicht haftenden Zellen entfernt werden. Tag 8: Trennen Sie die Zellen durch Inkubation 5 min bei 37 ° C in 10 ml einer Citratsalzlösung (135 mM Kaliumchlorid plus 15 mM Natriumcitrat in H 2 O, autoklaviert) und wasche mit 10 ml PBS. Graf reifen Knochenmark-Makrophagen (BMDM) am Tag 8 mit Hilfe eines Zellzählers. Stellen Sie sicher, die Bildung von reifen (CD11b + F4 / 80 +) BMDM durch visuelle Inspektion oder durch Durchflusszytometrie. Block 10 5 Zellen, die mit anti-CD16 1/100 / CD32 in PBS für 20 min in 100 ul PBS, inkubiert mit 1/200 Anti CD11b-FITC und 1/200 Anti-F4 / 80-APC-Cy7 bei RT Wasch und Analyse mittels Durchflusszytometrie. Hinweis:. Das Kultivieren der Maus Knochenmark-Makrophagen im Detail weiter oben in dieser Zeitschrift, die von Ying et al 11 erschienen. Samen 50.000 Zellen (optimale Zellzahlen optimiert werden müssen) pro Vertiefung in einer Zellkulturmikroplatte in 100 & mgr; l Kulturmedium. Saatgut nicht Zellen in Untergrundkorrektur Brunnen (A1, A12, H1, H12) und legte nur Medium (keine Zellen) in diesen Brunnen. Tipp: Halten Sie die Pipette in einem Winkel aKampf auf halber Höhe der Seite der Vertiefungen für die meisten homogenen Zellschicht. Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur in einer Zellkultur Haube für 1 Stunde zu begleichen. Dies wird auch zu fördern Zellverteilung und Randeffekte zu reduzieren. Überwachen Anhaften unter Verwendung eines Mikroskops und Kultur in ein 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Drei Stunden nach dem Plattieren stimulieren Zellen für 24 h mit 10 ng / ml LPS, oder 20 ng / ml rekombinantes Maus-IL-4 an M1 oder M2 Makrophagen erzeugen sind. Schließen unbehandelte naiv (M0) Makrophagen als Kontrolle. Beurteilen richtigen M1 und M2 Makrophagen Polarisation durch Messen LPS-induzierte Sekretion von IL-6, IL-12, TNF (ELISA) und IL-4-induzierte Arginase-1-Aktivität und / oder MMR (CD206) und MGL (CD301) Oberflächenexpression (Durchflusszytometrie), wie zuvor beschrieben, 3,11. Anmerkung: An diesem Punkt können die Zellen (vor) sein -behandelten pharmakologische Verbindungen von Interesse oder Makrophagen können mit anderen Faktoren stimuliert werden. Da könnte die Variation zwischen getrennten Vertiefungen subs seintantial, ist es ratsam, mindestens 4 und idealerweise 6 Vertiefungen pro Bedingung verwenden. 2. Herstellung der extrazellulären Flux Assay Hydrat der Sensorkartusche einen Tag vor der Durchführung des Assays: Legen Sie die Sensorkassette auf den Kopf neben der Versorgungsplatte. Füllen jeder Vertiefung der Versorgungsplatte mit 200 ul Kalibrierlösung und senken Sie die Sensorkartusche auf die Versorgungsplatte Eintauchen der Sensoren in der Kalibrierlösung. Stellen Sie sicher, das Kalibrierungslösung hoch genug ist, um die Sensoren eingetaucht und in eine nicht-CO 2 Inkubator bei 37ºC O / N zu halten. Vorbereitung Assaymedium am Tag des Assays wie folgt: Warm 50 ml XF Basismedium auf 37 ° C. Gib 500 & mgr; l 200 mM L-Glutamin, eine 2 mM Endkonzentration zu erhalten. Einstellen des pH auf 7,4 mit 1 N NaOH und Sterilisieren mit einem 0,2 um Filter und halten das Assay-Medium bei 37 ° C. Entfernen Sie vorsichtig das Zellkulturmedium von den polarisierten Makrophagen und speichern Sie sie bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung (zB ELISA, um die ordnungsgemäße Makrophagenpolarisation zu untersuchen). Die Zellen mit 100 & mgr; l Assay-Medium zu waschen, fügen Sie 180 ul Assay-Medium pro Vertiefung und unter dem Mikroskop die Zellen wurden nicht abgewaschen zu überprüfen. Setzen Sie den Zellkulturplatte in einem 37 ° C Inkubator ohne CO 2 für 1 h vor dem Testlauf. Bereiten Sie 10 x Injektionsmischungen A bis D wie in Tabelle 1 auf 37 ° C beschrieben, warm, den pH-Wert auf 7,4 und Filter zu sterilisieren. Stellen alle Verbindungen, die in diesen Gemischen bei 10-facher Endkonzentration in der Zellkulturvertiefungen und diese Konzentrationen zu optimieren für jeden Zelltyp. Laden Sie die Sensorkartusche mit den mitgelieferten Ladeführungen mit angegebenen Volumen (Tabelle 1) der vorbereiteten 10x Spritzmischungen in Anschlüsse A, B, C und D, welche nach Süctively. Gemisch / Einspritzung Verbindungen Volume hinzugefügt zu 10x Mischung (ul) zu erhalten Volume Assay-Medium (ml) Volume während der Lauf injiziert (ul) Endkonzentration im Test EIN 2,5 M (45%) Glucose 300 2.7 20 25 mM B 5 mM Oligomycin A (OM) 9 3.0 22 1,5 & mgr; C 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 & mgr; 100 mM Natriumpyruvat-Lösung 300 1 mM D 5 mM Antimycin A (AA) </td> 15 3.0 28 2,5 & mgr; 5 mM Rotenon (Rot) 7.5 1,25 & mgr; M Tabelle 1 Injection Mischungen. 3. Bioenergetische Charakterisierung polarisierte M1 und M2 BMDM mit einem extrazellulären Flux Analyzer Erstellen Sie einen Test-Vorlage mit der Assay-Assistent mit 2 Minuten und MIX 3 Minuten MEASURE Zeiten und (mindestens) 3-Mix und Geschwindigkeitsmessungen Schleifen vor jedem der 4 Injektionen (Tabelle 1) und nach der letzten Injektion. Anmerkung: Diese Konzentrationen gelten für Knochenmark stammenden Makrophagen und Raw264.7 Makrophagenzellinien, sollte aber für jeden Zelltyp optimiert werden. Zugabe Pyruvat in FCCP Mischung benötigt wird, um eine maximale Atmungs Kraftstoff. Starten Sie den Lauf durch Drücken der Start unten und folgen Sie den Anweisungen des Gerätes. Ersten Last das AutoRidge Platte mit den hydratisierten Sonden, um die Kalibrierung von Vorrichtungen und nächste Ladung der Zellplatte zu ermöglichen. Nach der Verwendung sorgfältig verwerfen alle Assaymedium und Speichern der analysierten Zellkulturmikro bei -20 ° C für zukünftige Zelle Normalisierung unter Verwendung der Zell-Proliferation-Assay-Kit, wie im einzelnen durch den Hersteller beschrieben. Kurz gesagt, bereiten eine 1x Zell-Lyse-Puffer durch Verdünnen Komponente B 20-fach in destilliertem Wasser und verdünnte Verbindung A 400-fach in der 1x Zell-Lyse-Puffer. Fügen Sie 200 ul pro Vertiefung inkubieren 5 min bei RT und messen Fluoreszenz mit ~ 180 nm Anregung und ~ 520 nm Emissionsmaxima. Hinweis: Bei der Arbeit mit nicht-haftenden Zellen oder wenn schlechte Haftung ist ein Anliegen, das direkte Zellproliferation Kit kann als Alternative verwendet werden, da dieses Protokoll nicht löschen dabei alle Testmedium erfordert. Doch dies ist direkte Protokoll etwas weniger empfindlich gegenüber der in dieser Übung verwendete Protokoll. Nach Fluoreszenzmessung, zu normalisierendie Zellzahl in jeder Vertiefung als ein Verhältnis, in welchem ​​die durchschnittliche Zellzahl aller naiven Makrophagen Vertiefungen auf 1 gesetzt wird. Achtung: Die Proteinquantifizierung (zB unter Verwendung eines BCA-Assay) könnte als eine Alternative, um Zellen zählt Normalisierung verwendet werden. Doch in unseren Händen dieser Test war weniger empfindlich gegenüber dem Zellproliferationsassay-Kit.