Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

1. Het kweken en Polarizing Bone Marrow-afgeleide macrofagen Dag 0: Isoleer bovenbeen en onderbeen botten 6-10 weken oude muizen van belang (C57BL / 6 in deze test). Verwijder spierweefsel uit de botten en plaats de botten in een 9 cm petrischaal gevuld met ijskoude PBS. Breng de botten om een ​​gerecht 9 cm Petri gevuld met 70% ethanol en schud de plaat gedurende 30 sec. Breng de botten vers 9 cm petrischaal gevuld met ijskoude steriele PBS. Snijd de femur en tibia aan beide uiteinden met steriele scharen. Spoel de botten met 10 ml ijskoude steriele PBS met behulp van een 10 ml spuit en een 25 G naald. Verzamel het beenmerg in een 50 ml buis. Breng de beenmergcellen in nieuw 50 ml buis met behulp van een 23 G naald. Herhaal deze stap met een 25 G naald. Opmerking: Deze stappen zijn nodig om de cel klonten en bot te verwijderen. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi de supernatant en resuspendeer de cellen in 40 ml celkweekmedium (RPMI-1640 plus 2 mM L-glutamine, 10% FCS, penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml) en 15% gefiltreerd L-929 cellen ( ATCC CCL-1) -geconditioneerd medium met M-CSF (of als alternatief 10 ng / ml recombinant M-CSF in plaats van L-929-cellen geconditioneerd medium). Opmerking: Het produceren van L-929-cellen geconditioneerd medium werd eerder in dit tijdschrift in 2013 11 gedetailleerd Kweken van de cellen van één muis in twee 15 cm petrischalen (niet gebruikte celkweek behandelde platen aangezien macrofagen niet losmaken van deze kunststof) in 20 ml kweekmedium per plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Voeg 10 ml vers celkweekmedium op dag 3, zonder de oudere 20 ml celkweekmedium. Vervang het medium van elke plaat met 20 ml vers kweekmedium op dag 6. Hierdoor wordt niet-hechtende cellen worden verwijderd. Dag 8: Los cellen door incubatie hen 5 min bij 37 ° C in 10 ml citraat zoutoplossing (135 mM kaliumchloride plus 15 mM natriumcitraat in H 2 O, geautoclaveerd) en wassen met 10 ml PBS. Count volwassen beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) op dag 8 met behulp van een cel teller. Controleer de vorming van volwassen (CD11b + F4 / 80 +) BMDM door visuele inspectie of door flowcytometrie. Vak 10 5 cellen met 1/100 anti-CD16 / CD32 in PBS gedurende 20 min in 100 pi PBS, geïncubeerd met anti-CD 11 b 1/200-FITC plus 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 bij kamertemperatuur, wassen en analyseren door flowcytometrie. Opmerking: Het kweken van muis beenmerg afgeleide macrofagen werd eerder in dit tijdschrift gepubliceerd in detail door Ying et al 11.. Seed 50.000 cellen (optimaal celtellingen moeten worden geoptimaliseerd) per putje in een celcultuur microplaat in 100 pl kweekmedium. Heeft cellen in de achtergrond correctie putten (A1, A12, H1, H12) geen zaad en zet alleen medium (geen cellen) in deze putten. Tip: Houd de pipet in een hoek eenbout halverwege de zijkant van de putten voor de meest homogene cellaag. Laat de cellen om zich te vestigen bij RT in een celkweek kap voor 1 uur. Dit bevordert zelfs mobiele distributie en de rand te verminderen. Monitor hechting met behulp van een microscoop en cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Drie uur na plateren stimuleren cellen gedurende 24 uur met 10 ng / ml LPS, of 20 ng / ml recombinant muis IL-4 aan M1 of M2 macrofagen respectievelijk genereren. Omvatten onbehandelde naïeve (M0) macrofagen als controle. Evalueer goede M1 en M2 macrofaag polarisatie door meting van LPS-geïnduceerde afgifte van IL-6, IL-12, TNF (ELISA) en IL-4 geïnduceerde arginase-1 activiteit en / of MMR (CD206) en MGL (CD301) oppervlakexpressie (stromingscytometrie) zoals eerder beschreven 3,11. Opmerking: Op dit punt kan cellen (pre) zijn -behandeld farmacologische verbindingen van belang of macrofagen worden gestimuleerd met andere factoren. Daar zou de variatie tussen de afzonderlijke putten zijn substantial, verdient het aanbeveling om ten minste 4 en bij voorkeur 6 putjes gebruikt per conditie. 2. Bereiding van de extracellulaire Flux Assay Hydrateren de sensorcartridge een dag voor het uitvoeren van de test: Plaats de sensor cartridge ondersteboven naast het hulpprogramma plaat. Vul elk putje van het hulpprogramma plaat met 200 ul kalibratieoplossing en laat de sensor cartridge op het nut plaat onderdompelen de sensoren in de kalibratieoplossing. Controleer de kalibratieoplossing niveau hoog genoeg is om de verzonken sensoren en in een niet-CO 2 37 ° C incubator O / N houden. Bereid testmedium op de dag van de assay als volgt: Warm XF 50 ml basismedium tot 37 ° C. Voeg 500 ul 200 mM L-glutamine een 2 mM eindconcentratie te krijgen. Stel de pH tot 7,4 onder toepassing van 1 N NaOH en steriliseren met een 0,2 uM filter en houd het testmedium bij 37 ° C. Verwijder het celkweekmedium van de gepolariseerde macrofagen en het op -20 ° C voor toekomstig gebruik (bijvoorbeeld ELISA juiste macrofaag polarisatie te onderzoeken). Was de cellen met 100 ul assay medium, voeg 180 ul assaymedium per putje en controleren onder de microscoop dat cellen niet weg werden gewassen. Plaats de celkweek plaat in een 37 ° C incubator zonder CO 2 gedurende 1 uur voorafgaand aan de test run. Bereid 10 x injectie verbindingsmengsels A tot D zoals beschreven in tabel 1, warm tot 37 ° C, de pH op 7,4 en filter steriliseren. Maak alle verbindingen in deze mengsels 10x de eindconcentratie in de putjes celkweek en optimaliseren van deze concentraties voor elk celtype. Laad de sensorcartridge met de meegeleverde laad- geleiders aan aangegeven volumes (tabel 1) van de bereide 10x injectie verbindingsmengsels in poorten A, B, C en D, respectively. Mengsel / Injection Verbindingen Volume toegevoegd aan 10x mengsel (pl) krijgen Volume bepaling (ml) Volume geïnjecteerd tijdens de run (pl) De eindconcentratie in de assay EEN 2,5 M (45%) glucose 300 2.7 20 25 mM B 5 mM oligomycin A (OM) 9 3.0 22 1,5 pM C 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 pM 100 mM Natriumpyruvaat oplossing 300 1 mM D 5 mM antimycin A (AA) </td> 15 3.0 28 2,5 uM 5 mM rotenone (Rot) 7.5 1,25 uM Tabel 1. Injectie mengsels. 3. Bioenergetische Karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 BMDM met een extracellulaire Flux Analyzer Maak een test sjabloon met de test tovenaar met 2 minuten MIX en 3 minuten MEASURE keer en (minstens) 3 mix en snelheidsmetingen lussen voor elk van de 4 injecties (tabel 1) en na de laatste injectie. Opmerking: Deze concentraties gelden voor beenmerg afgeleide macrofagen en RAW264.7 macrofaag cellijnen, maar moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype. Het toevoegen van pyruvaat in het FCCP mengsel nodig om maximale ademhaling brandstof. Start de run door de startknop onderkant en volg de instructies van het apparaat. Eerste lading van de autocartridge plaat met de gehydrateerde sondes om de kalibratie van apparatuur en volgende lading van de cel plaat mogelijk te maken. Na de test zorgvuldig alle testmedium ontdoen en opslaan geanalyseerd celkweek microplaat bij -20 ° C voor toekomstig cell normalisatie met de celproliferatie assay kit zoals beschreven door de leverancier. In het kort bereidt een 1x cel-lysis buffer door verdunning component B 20-voudig gedestilleerd water en verdunde verbinding A 400-voudig in 1x cel-lysis buffer. Voeg 200 ul per putje, incubeer 5 min bij RT en meten van fluorescentie met ~ 180 nm excitatie en ~ 520 nm emissie maxima. Opmerking: Bij het werken met niet-hechtende cellen of slechte hechting een probleem, de directe celproliferatie kit kan worden gebruikt als alternatief omdat dit protocol niet vereist weggooien alle testmedium. Maar deze directe protocol iets minder gevoelig ten opzichte van het protocol in dit lab. Na fluorescentiemeting normaliserenhet aantal cellen in elk putje als een verhouding waarbij het gemiddelde aantal cellen van naïeve macrofaag putjes wordt ingesteld op 1. Opmerking: Protein kwantificeren (bijvoorbeeld met een BCA assay) kan worden gebruikt als een alternatieve manier om cellen tellingen normaliseren. Maar in onze handen deze test minder gevoelig ten opzichte van de celproliferatie assay kit.