توصيف الأيض من الاستقطاب M1 M2 الضامة والعظام نخاع المستمدة من طريق في الوقت الحقيقي التحليل خارج الخلية الجريان
Summary
Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.
Abstract
Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization.
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC).
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage’s metabolic phenotype and inflammatory status.
Introduction
في حين الضامة تلعب دورا محوريا في الأمراض تقريبا كل شيء، والآليات الجزيئية التي تنظم ملامحهم لا تزال غير تهاوت تماما. عرض الضامة التجانس عالية وردا على المكروية تعتمد الظواهر المختلفة 1. LPS (+ IFNγ) يسببها تنشيط كلاسيكي M1 أو M (LPS) الضامة تعزز الالتهابات وحماية المضيف ضد أنواع مختلفة من التهديدات الجرثومية 2. ويستخدم آخرون IFNγ وحدها أو بالاشتراك مع TNF كما المحفزات للحصول M1 الاستقطاب. IL-4 و / أو IL-13 يدفع تنشيط البلاعم البديل وهذه M2 أو M (IL-4) الخلايا هي المكثفات قوية والتحكم والاستجابات المناعية الجارية 3. عرض الضامة الاستقطاب لائحة متميزة من الأيض الخلوي مع الضامة M1 LPS تنشيط تمر التحول الأيضي لتعزيز تحلل 4-6. الأكسدة على العكس، وتعزيز الأحماض الدهنية (FAO) وoxidativ الميتوكوندرياالبريد الفسفرة (OXPHOS) توفر الطاقة المستدامة في IL-4 التي يسببها الضامة M2 7-9. وهكذا، والتمثيل الغذائي تغيير ليس فقط سمة من سمات فرعية بلعم الاستقطاب، بل هو أيضا شرط أساسي لاستقطاب والتنظيم السليم للالتهابات. الأهم من ذلك، تثبيط تحلل أو OXPHOS / وقد تجلى منظمة الأغذية والزراعة لتنال M1 M2 أو التنشيط، على التوالي 8،10. على هذا النحو، وتحديد التغيرات الأيضية في الضامة يمكن تطبيقها كأداة لتقييم حالة الاستقطاب وإمكاناتهم التهابات.
ولذلك يمكن أن تستخدم فحص ثابت الذي يقيس الأيض بلعم التنبؤ بما إذا كانت المخدرات، والجينات بهدم أو يؤثر العلاج الأخرى الاستقطاب البلاعم وظيفة. في هذا الفيديو، يتم استخدام محلل تدفق خارج الخلية لتوصيف ملامح الطاقة الحيوية من السذاجة، M1 و M2 الضامة.
هذه المخطوطة تفاصيل بروتوكول الأمثل الذي يسمح للقياسجميع المعلمات ذات الصلة تحلل (تحلل، تحلل القصوى واحتياطي حال السكر) وخصائص وظيفة الميتوكوندريا (التنفس الكلي، والتنفس الميتوكوندريا القاعدية، إنتاج ATP، تسرب بروتون، التنفس القصوى والقدرة التنفسية الغيار) في فحص واحد. باستخدام هذا الإعداد التجريبية، يمكن مقارنة بين الطاقة الحيوية والسيطرة "تغيير" (مثل الجينات نهدم، overexpression المعدلة وراثيا أو العلاج الدوائي) الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف من المختبر لدينا هو أن نفهم كيف يمكن أن يتأثر الاستقطاب بلعم وظيفة مع الهدف النهائي لتحسين نتائج تصلب الشرايين وحالات الالتهابات الأخرى 12. لتقييم البلاعم الاستقطاب، واحد عادة ما يقيس LPS (+ IFNγ) يسببها وIL-4-الناجم عن التعبير الجيني من M1 و M2 الجينات علامة (QPCR)، ويحدد IL-6، IL-12، TNF وNO إفراز (بواسطة ELISA وGriess رد فعل) ويدرس IL-4 التي يسببها CD71، CD206، CD273 CD301 والتعبير السطحية (التدفق الخلوي) وأرجيناز النشاط 3،13. بالإضافة إلى ذلك، المقايسات موت الخلايا المبرمج (عن طريق Annexin-V / PI تلطيخ)، المقايسات البلعمة (مع حبات الفلورسنت اللاتكس و / أو pHrodo كولاي) وفحوصات تشكيل خلية الرغوة (عن طريق الجاذبة-oxLDL امتصاص، LipidTOX محايد الدهون تلطيخ) لا يمكن أن يؤديها ل تقييم وظائف بلعم 14. بالإضافة إلى ذلك، تحليل التدفق خارج الخلية لا يمكن أن يؤديها لقياس الطاقة الحيوية لمحات من لجنة الهدنة العسكرية المستقطبةrophages كما قراءات وظيفية جديدة وبديلة.
وتظهر هذه المخطوطة أن الاستقطاب بلعم يدفع إعادة برمجة التمثيل الغذائي مع الضامة LPS الناجم عن التحول إلى زيادة تحلل كمصدر للطاقة. على العكس من ذلك، الضامة M2 IL-4 التي يسببها استخدام الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا كمصدر رئيسي للاعبي التنس المحترفين. الأهم من ذلك، إعادة برمجة التمثيل الغذائي لا يوفر فقط طاقة لمتطلبات معينة من M1 و M2 الضامة الاستقطاب. في الواقع، والتغيرات الأيضية تؤثر تركيزات المستقلب التي هي المنظمين مباشرة من النمط الظاهري بلعم 10،15،16. وبالتالي، والتمثيل الغذائي بلعم ليس فقط صفة (كما هو موضح هنا في الشكل 2)، ولكن أيضا سائق متميزة الدول الاستقطاب بلعم ويدعم هذه المعرفة الجديدة والنمو السريع للمنطقة البحث immunometabolism خلال العامين الماضيين.
ومع ذلك، والقياسات قوية لمحات التمثيل الغذائي في ماكروظلت فاجات صعبة وكان محدوديتها. في هذه الدراسة، يتم تطبيق محلل تدفق خارج الخلية لقياس بقوة تحلل، احتياطي حال السكر، والقدرة حال السكر القصوى، وتحمض غير حال السكر، القاعدية والتنفس القصوى، إنتاج ATP، والقدرة التنفسية الغيار، تسرب بروتون والتنفس غير الميتوكوندريا في الوقت الحقيقي في الحد الأدنى من الضامة.
ولذلك، فإننا تعديل وتحسين بروتوكولات الشركة المصنعة على النحو التالي. معيار اختبار الإجهاد ميتو (# 103015-100) يوحي باستخدام المتوسطة مع الجلوكوز والبيروفات وبروتوكولا مع 3 حقن (OM، FCCP، AA / العفن). اخترنا لبدء الفحص مع الجلوكوز / خالية من البيروفات المتوسطة، إضافة الجلوكوز باعتباره الحقنة الأولى في ميناء A (كما هو الحال في تحلل السكر اختبار الإجهاد # 103020-100) وإضافة البيروفات جنبا إلى جنب مع uncoupler FCCP في ميناء C. وبهذه الطريقة ، تستمد جميع المعلمات تحلل ذات الصلة من القياسات ECAR 1-9 وجميع المعلومات ذات الصلة حول mitochondriوظيفة القاعدة من القياسات OCR 15/04.
لاحظ أنه من الأهمية بمكان لحقن البيروفات جنبا إلى جنب مع FCCP لتغذية التنفس القصوى على فك ربط. قبل استخدام هذا البروتوكول المشترك، ينبغي للمرء أيضا التحقق من أن 2-ديوكسي-D-الجلوكوز (2-DG) يخفض مستويات ECAR بعد الفحص إلى القيم القاعدية (1-3) وأن معدلات ECAR سجلت 4-6 هي في الواقع يرجع إلى تحلل. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمرء أن يفهم أن تركيز مركب وأرقام الهواتف المحمولة المستخدمة في هذه المخطوطة هي صالحة للالضامة المشتقة من نخاع العظام وRaw264.7 خطوط الخلايا بلعم وينبغي أن يكون الأمثل لأنواع الخلايا الأخرى. وعلاوة على ذلك، ينبغي للمرء أن يلاحظ أن M-CSF الذي يستخدم لتوليد الضامة المشتقة من نخاع العظام يعزز النمط الظاهري المضادة للالتهابات مثل M2. لذا قد تكون النتائج المقدمة من الضامة المستمدة من نخاع العظم غير قابلة للمقارنة تماما لقياسات مع الضامة المقيمين الأنسجة الضامة الأولية أو خطوط الخلايا التي لا تتطلب M-CSF خلال culturi الخليةنانوغرام.
بالمقارنة مع الطرق القائمة، هذا البروتوكول يتطلب كميات ضئيلة من الضامة ويوفر بسرعة تقريبا جميع خصائص الخلية الأيض الأساسية. هذا ينتج في الخلايا فائض كافية لتنفيذ المقايسات المناعية الأخرى، وحتى الخلايا المستخدمة في الطاقة الحيوية التنميط لا يزال من الممكن استخدامها لأغراض أخرى قصد بعد الفحص. وعلاوة على ذلك، وبشكل خاص 96 شكل لوحة جيد يسمح تقييم ظروف متعددة في الوقت الحقيقي في نفس الوقت. ومع ذلك، فإن الاختلاف بين الآبار الفردية يمكن أن تكون كبيرة، وبالتالي غالبا ما هو المطلوب استخدام ما لا يقل عن 4 آبار في الشرط. اتخذت هذا القيد في الاعتبار، وتحليل تدفق خارج الخلية وصفها لا يزال يسمح لتشغيل أكثر من 10 الظروف التجريبية (ن = 6) في وقت واحد، والتي هي أكثر بكثير من التقنيات التقليدية.
عموما، توفر هذه المقالة مقايسة وظيفية سهلة وقابلة للتكرار الذي يسمح بقياس جميع تحلل ذات الصلة والمعلمة الميتوكوندرياeters في مجموعات فرعية بلعم الاستقطاب. هذه التقنية يمكن أن تكون بمثابة تطبيقها في المستقبل لتقييم وظيفة البلاعم وتقييم أثر التلاعب متميزة (مثل الجينات نهدم والأدوية الجديدة، وما إلى ذلك) في (التمثيل الغذائي) النمط الظاهري والبلاعم و. على هذا النحو، وبيانات التدفق خارج الخلية يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع فحوصات أخرى للسماح توصيف متعمق لحالة تنشيط البلاعم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project “Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis” (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.
Materials
| 23G and 25G needles | Becton Dickinson | #300800 and #300600 | To flushed bone marrow |
| 10 ml syringes | Becton Dickinson | #307736 | To flushed bone marrow |
| Petri dishes | Greiner | #639161 | To culture bone marrow cells |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #C7026 | For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells) |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #35011 | For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells) |
| XFe96 cell culture microplate | Seahorse Bioscience | #101085-004 | 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done |
| recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) | Peprotech | #214-14-B | Used to induced alternative macrophage activation |
| lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | #L2637 | Pro-inflammatory stimulus |
| Seahorse Sensor Cartridge | Seahorse Bioscience | #102416-100 | Contains the probes for pH and O2 measurement |
| Seahorse XF Calibrant | Seahorse Bioscience | #100840-000 | Needed to hydrate the probes overnight |
| XF base medium | Seahorse Bioscience | #102353-100 | Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes |
| L-glutamine | Life Technologies | #25030-081 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | #G8769 | Fuels glycolysis once added to the cells |
| oligomycin A | Sigma | #75351 | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | Sigma | #C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| 100 mM Sodium Pyruvate solution | Lonza | #BE13-115E | Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis |
| Antimycin A | Sigma | #BE13-115EA8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Rotenone | Sigma | #BE13-115EA8674R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Casy Cell Counter | Roche Diagnostics | #05 651 697 001 | Instrument to count cells |
| anti-CD16/CD32 | eBioscience | #14-0161 | Fc receptor block flow cytometry |
| anti-F4/80-APC-eFluor780 | eBioscience | #47-4801 | Antibody to stain macrophages |
| anti-CD11b-FITC | eBioscience | #11-0112 | Antibody to stain macrophages |
References
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
- Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
- Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
- Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436 (2014).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
- Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
- Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
- Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
- Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
- Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
- Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
- Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
- Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).
- Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).
