Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

El cerebelo se encuentra en el extremo anterior de la parte posterior del cerebro y es responsable de la integración de procesamiento sensorial y motora en el cerebro madura, así como la regulación de los procesos cognitivos superiores ^1. En los mamíferos y las aves, posee una morfología elaborado y está fuertemente foliada, un producto de la extensa amplificación de tránsito de progenitores durante el desarrollo que produce más de la mitad de las neuronas en el cerebro adulto. El cerebelo ha sido objeto de estudio para los neurobiólogos durante siglos y en la era molecular asimismo ha recibido mucha atención. Esto se refiere no sólo a su biología inherentemente interesante, pero también al hecho de que está fuertemente implicado en la enfermedad humana, incluyendo trastornos genéticos del desarrollo tales como trastornos del espectro autista ^{2 y} lo más prominente que el cáncer cerebelosa, meduloblastoma ^3, que es el cerebro pediátrica más frecuente tumor. Es importante destacar que es un excelente sistema modelo dentro which para estudiar la asignación de destino y la neurogénesis durante el desarrollo cerebral ^4. En los últimos años, también se ha establecido como un sistema modelo para el estudio comparativo del desarrollo del cerebro, debido a la gran diversidad de formas de cerebelo visto a través de la filogenia de los vertebrados ^10.5.

El cerebelo se desarrolla desde el medio dorsal de rhombomere 1 en el cerebro posterior ¹¹ y su desarrollo se compone de dos poblaciones progenitoras primarias, el labio rómbico y la zona ventricular. El labio rómbico se extiende alrededor de la región dorsal del neuroepitelio del cerebro posterior en la frontera con la placa de techo. Es el lugar de nacimiento de las neuronas excitadoras glutamatérgicas del cerebelo ^12.14. La zona ventricular da lugar a las neuronas del cerebelo GABAérgicas inhibitorias, lo más prominente las neuronas de Purkinje grandes ^14,15. Más adelante en el desarrollo (desde aproximadamente el día embrionario 13,5 en el ratón; e6 en chick ^16), Progen glutamatérgicaITORS migran tangencialmente desde el labio rómbico y formar una capa pial de progenitores: una zona progenitor secundaria llamada la capa de gránulos externa (EGL). Es esta capa que sufre la extensa amplificación de tránsito que lleva a la gran cantidad de neuronas granulares se encuentran en el cerebro maduro.

Proliferación en el EGL larga se ha relacionado con la localización sub-pial que resulta de la migración tangencial desde el labio rómbico ^17, con el interruptor de salida del ciclo celular y la diferenciación neuronal de células progenitoras que se asocia con su salida de la capa de EGL exterior hacia el centro EGL ^18. La migración tangencial extensivo de células granulares post-mitótico en el eje medial-lateral se produce en el medio y EGL ^interior 19, antes de la migración radial definitiva en la capa de gránulos interior de la corteza cerebelosa maduro. La migración de células del labio rómbico sobre la superficie cerebelosa es dependiente de la señalización de CXCL12 de la pia ^{20-22 de} </sup> Y células granulares expresan el receptor CXCR4 CXCL12. Su migración tangencial es, pues, que recuerda a la de la migración tangencial neocortical poblaciones interneuronas inhibitorias ^23-25. Curiosamente, los estudios de microscopía electrónica ¹⁷ han sugerido que las células EGL con una morfología proliferativa mantienen contacto pial, que une el comportamiento celular con capacidad proliferativa en una forma que recuerda de los progenitores basales de la corteza de mamíferos ^26. Esto se refleja en la estratificación antes mencionado de la EGL en tres subcapas que se definen por ambientes extracelulares distintos y donde los precursores de los gránulos tienen distinta expresión génica signaturas ^18.

Proliferación de los progenitores en el oEGL se produce con una distribución normal de tamaños de clones de tal manera que cuando los progenitores son individualmente marcadas genéticamente al final del desarrollo embrionario en el ratón, dan lugar a un promedio de 250-500 g mediana de postmitoticneuronas ranule ^27,28. Proliferación depende de la señalización de SHH mitogénica de las neuronas de Purkinje subyacente ^29-32. La capacidad de responder a SHH ha demostrado ser totalmente dependiente de la expresión autónoma de células del factor de transcripción Atoh1, tanto in vitro como in vivo ^{33 34,35.} Del mismo modo, salida del ciclo celular y la diferenciación se ha demostrado que dependen de la expresión del factor de transcripción aguas abajo NeuroD1 ^36, que es probable que un represor directa de Atoh1 ^37.

A pesar de este progreso, y un considerable avance en el desciframiento de la base biológica de células de salida del ciclo celular ^{38 a 42,} el mecanismo molecular fundamental (s) que subyacen a la decisión de salir del ciclo celular y la transición de un progenitor a una neurona diferenciación y la la migración tangencial postmitotic asociada en el EGL interior, así como el interruptor de tardea la migración radial, siendo incompleta entendido. Esto es en gran medida debido a la intratabilidad experimental de la EGL: se está desarrollando tarde, y difícil de dirigir genéticamente ya que muchas de las mismas moléculas neurogénicos también son cruciales antes en la vida de los precursores de gránulos en el labio rómbico. Para superar este problema, numerosos autores han desarrollado in vivo y ex vivo electroporación como un método para dirigir el cerebelo postnatal en roedores ^43-48. Aquí, pioneros en el uso de la electroporación ex vivo en chick para estudiar la EGL, que representa considerables ventajas en términos de coste y conveniencia. Nuestro método de electroporación y cultivo ex vivo rebanada de tejido cerebeloso chica utiliza el tejido diseccionado a partir del día embrionario 14 pollitos en el pico de la proliferación de EGL. Este método permite la orientación genética de la EGL independientemente del labio rómbico y será el escenario para la disección genética de la transición del gránuloprogenitoras de neuronas gránulo postmitotic en el cerebelo.