Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

Le cervelet se trouve à l'extrémité antérieure du cerveau postérieur et est responsable de l'intégration du traitement sensoriel et moteur dans le cerveau mature ainsi que la régulation des processus cognitifs supérieurs ^1. Chez les mammifères et les oiseaux, il possède une morphologie complexe et est fortement feuilleté, un produit de grande amplification des progéniteurs de transit au cours du développement, qui produit plus de la moitié des neurones dans le cerveau adulte. Le cervelet a été un sujet d'étude pour les neurobiologistes pour des siècles et dans l'ère moléculaire a également reçu beaucoup d'attention. Cela concerne non seulement à sa biologie intrinsèquement intéressante, mais aussi au fait qu'il est fortement impliqué dans les maladies humaines, y compris les troubles génétiques de développement tels que les troubles du spectre autistique ^{2 et} plus en évidence le cancer du cervelet, médulloblastome ^{3, qui est} le cerveau pédiatrique la plus répandue tumeur. Surtout, il est un excellent système de modèle au sein de which pour étudier la répartition de sort et la neurogenèse au cours du développement du cerveau ^4. Au cours des dernières années, il a également été établi comme un système modèle pour l'étude comparative du développement du cerveau, en raison de la grande diversité des formes cérébelleux vu à travers la phylogénie des vertébrés ^5-10.

Le cervelet se développe à partir de la moitié dorsale de rhombomère 1 dans le cerveau postérieur et de développement ¹¹ est constitué de deux populations de cellules progénitrices primaires, la lèvre rhombique et la zone ventriculaire. La lèvre rhombique étend autour de la région dorsale de la neuroépithélium du cerveau postérieur à la frontière avec la plaque de toit. Il est le lieu de naissance des neurones excitateurs glutamatergiques du cervelet ^12-14. La zone ventriculaire donne lieu à des neurones inhibiteurs GABAergiques cérébelleux, le plus en évidence les grands neurones de Purkinje ^14,15. Plus tard dans le développement (d'environ jour embryonnaire 13,5 chez la souris; e6 en poussin ^16), glutamatergique Progenvisi- migrer tangentiellement à partir de la lèvre rhombique et forment une couche piale progéniteurs: une zone de progéniteur secondaire appelée la couche de granulés externe (EGL). Il est de cette couche qui subit l'amplification très étendue de transit qui conduit à le grand nombre de neurones granulaires présents dans le cerveau mature.

Prolifération dans le EGL a longtemps été associé à l'emplacement du sous-pial qui résulte de la migration tangentielle à partir de la lèvre rhombique ^17, avec le commutateur de sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale de progéniteurs étant associée à leur sortie de la couche EGL extérieur dans le milieu EGL ^18. La migration tangentielle étendue de cellules granulaires post-mitotiques dans l'axe médio-latérale se produit dans la moyenne et interne EGL ^19, avant la migration radiale finale dans la couche intérieure de granules du cortex cérébelleux mature. Migration de cellules de la lèvre rhombique sur la surface du cervelet dépend signalisation CXCL12 de la ^pie-20-22 </sup> Cellules granulaires et expriment le récepteur CXCR4 CXCL12. Leur migration tangentielle est donc sans rappeler celui de la migration des populations tangentiellement néocortex des interneurones inhibiteurs ^23-25. Curieusement, études au microscope électronique ^{17 ont} suggéré que les cellules EGL avec une morphologie proliférative maintenir le contact pial, reliant le comportement des cellules avec une capacité de prolifération d'une manière qui rappelle les progéniteurs basales du cortex des mammifères ^26. Ceci se reflète dans la stratification précitée de la EGL en trois sous-couches qui sont définies par des environnements extracellulaires distinctes et où granulés précurseurs ont l'expression du gène ¹⁸ signatures distinctes.

Prolifération des progéniteurs dans la oEGL se produit avec une distribution normale des tailles de clones de sorte que lorsque les progéniteurs sont génétiquement marquées individuellement à la fin du développement embryonnaire chez la souris, ils donnent lieu à une moyenne médiane de 250 à 500 g postmitotiqueneurones ranule ^27,28. Prolifération dépend de signalisation SHH mitogénique sous-jacents neurones de Purkinje ^29-32. La capacité à répondre à SHH a été montré pour être entièrement dépendant de cellule autonome expression du facteur de transcription Atoh1, à la fois in vitro et in vivo ^{33 34,35.} De même, la sortie du cycle cellulaire et de la différenciation a été démontré que l'expression dépendant du facteur de transcription en aval NeuroD1 ^36, ce qui est probablement un répresseur directe de Atoh1 ^37.

Malgré ces progrès, et le progrès considérable à déchiffrer la base biologique de la cellule de sortie du cycle cellulaire ^38-42, le mécanisme moléculaire fondamentale (s) qui sous-tendent la décision de quitter le cycle cellulaire et la transition d'un ancêtre à un neurone de différenciation, et la la migration tangentielle postmitotique associé dans le EGL intérieure ainsi que l'interrupteur tardà la migration radiale, restent mal compris. Ceci est dans une large mesure en raison de l'intransigeance de l'EGL expérimentale: il est tard en développement et difficiles à cibler génétiquement puisque bon nombre des mêmes molécules neurogènes sont également cruciales tôt dans la vie des précurseurs de granulés à la lèvre rhombique. Pour surmonter ce problème, de nombreux auteurs ont développé in vivo et ex vivo électroporation comme une méthode pour cibler le cervelet postnatale chez les rongeurs ^43-48. Ici, nous Pioneer l'utilisation des ex vivo électroporation dans poussin pour étudier le EGL, ce qui représente des avantages considérables en termes de coût et de commodité. Notre méthode d'électroporation et ex vivo tranche culture de tissu cérébelleux poussin utilise le tissu disséqué jour embryonnaire 14 poussins au sommet de EGL prolifération. Cette méthode permet le ciblage génétique de l'EGL indépendamment de la lèvre rhombique et préparera le terrain pour la dissection génétique de la transition de granuleprogéniteur de neurone post-mitotiques granule dans le cervelet.