可溶和不可溶α-突触核蛋白从帕金森脑连续提取

验尸脑组织捐赠给皇后广场脑库神经系统疾病，伦敦大学学院神经学研究所用合乎伦理的协议下由人体组织机构颁发的许可证存储的研究（HTA）英国（编号12198）。看到用于此协议（表1）的情况下的清单。 1.准备缓冲区制备1X TBS（Tris-缓冲盐水）缓冲液： 制备10X TBS作为储备溶液用500mM的Tris-HCl pH 7.4的和1500毫米氯化钠。 称取60.5克三Cl pH 7.6的87.6克氯化钠在800ml的高纯度水。调节pH用1M HCl，并进行最后的蓄积量至1L 通过在蒸馏水稀释储备10倍制备1X TBS的最终浓度。 加入蛋白酶抑制剂（PI），（每50 ml的缓冲液1片）和PHOS停止磷酸酶抑制剂片剂（1片每10 ml缓冲液），以废除的蛋白酶和磷酸酶的非特异性酶促动作的效果。 注意：在这里，我们使用的酶抑制剂来自Roche片剂但同样其它市售抑制剂可根据制造商的说明使用。 制备的TBS-SDS缓冲加入5％w / v的十二烷基硫酸钠（SDS）至1X TBS（pH为7.4）缓冲液。加热使用磁力搅拌器以溶解的SDS溶液到60℃并不断搅拌。 制备的TBS-SDS-尿素缓冲通过添加尿素至8M的w / v到1X TBS-SDS缓冲液（pH7.4）的最终浓度。加热在磁力搅拌器上的溶液到60℃并不断搅拌以溶解尿素。 2.样本同质化和差异超速离心注意：以下工作部分包括人脑组织的根据HTA英国的规则处理。地方标准作业程序遵循所有TIMES。脑样品从匀浆在保持在负压microcabinet冷冻脑块和组织材料解剖。一次性手术服手套，口罩，过鞋保护器和护目镜磨损整个过程。在121℃高压灭菌20分钟进行安全处置后，自人组织废物被丢弃。尖锐件（手术刀片）布置在密封及安全处置适当尖锐物容器。 （从基底节区的约0.5克的重量）取冷冻的人组织的组块，并迅速剁碎成小片段（约1毫米2）在冰上使用小培养皿和无菌解剖刀刀片。使用一个单独的培养皿和手术刀刀片每个样品。收集组织糜在15ml管中，加入10倍体积的冰冷的缓冲1XTBS到管。 均质化，使用机械均化器将样品以20,000rpm离心10秒。冷却在冰上2分钟。重复此步骤三次秒。 注：这是这样做的样品不加热均化。 通过离心澄清，在1000×g离心5分钟，在4℃。丢弃的非均质材料颗粒。 取上清液（粗匀浆），加入到聚碳酸酯离心管（管的大小取决于转子尺寸），并仔细权衡。离心机以100,000×g离心1小时，在4℃。 保留上清液，因为这是TBS可溶部分。 洗涤在五个体积的1X TBS缓冲液和每次离心沉淀两次以100,000×g离心15分钟，在4℃。弃去上清液。 在大约5卷1X TBS-SDS在室温超声颗粒，持续10秒，在20千赫重悬最终的沉淀。 注意：在另外的SDS的缓冲液样品应提请在10℃，以避免SDS沉淀。 超离心机以100,000×g离心30分钟，在25℃下。 保留上清液，因为这是第ËSDS可溶部分。 洗涤沉淀两次在5倍体积的1X TBS-SDS缓冲液在室温。离心机以100,000×g离心15分钟，每次在25℃。 溶解在50μl的使用超声波仪设定为20千赫，10秒以获得完全溶解的1X TBS-SDS-尿素缓冲液中最终的沉淀;这被称为尿素可溶部分。 测定每个级分使用根据制造商的协议市售蛋白质测定试剂盒的总蛋白质含量。稀的TBS-SDS-尿素样品1：1与1X TBS缓冲，以允许与蛋白质测定试剂的相容性。在小等分试样（20微升）在-80℃冷冻的样品，以减少冻融循环。 注意：添加10％甘油以样品被推荐用于长期储存在-80℃。 3.免疫印迹样品和分析结果从TBS，TBS-SDS和TBS-SDS-尿素提取物对10孔4-12％的Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶电泳样本具有MOPS作为使用标准技术运行缓冲液。见Gallagher和Chakravarti（2008）29进行了详细的免疫印迹协议。 负载10微克来自各样品的蛋白质到每个泳道随着分子量标记为TBS和SDS和尿素的级分。 运行凝胶在200V 1小时，或直到从装载缓冲液的蓝染料到达凝胶的底部。 转移从凝胶电泳的蛋白质上的尼龙膜28，预润湿先在100％甲醇中，然后进入含有20％甲醇的转移缓冲液。提供在印迹上的识别标记，以确定该蛋白侧和的分子量大小标记的取向。 夹着与沿着湿滤纸膜中的凝胶。膜的正确位置是与凝胶和阳极之间的膜是至关重要的。 40五，执行转移2小时弥补1X PBS – 吐温（1X PBS-T）缓冲液：溶在200ml 1片剂的PBS水，得到0.01M磷酸盐缓冲液，0.0027氯化钾和0.137氯化钠，pH 7.4。 阻断膜中的5％BSA溶液在1X PBS-T进行30分钟振荡以70rpm。这防止非特异性的第一抗体的结合到膜上。 探测蛋白质印迹用6mlα-顺初级抗体顺-1（BD Biosciences公司;小鼠单克隆抗体）在1：750稀释液（O / N，4℃），接着是一系列的洗涤用1X PBS-T的（ 3×5分钟，每次）28。 孵育适当的HRP缀合的二级抗体的印迹以1：2000稀释30分钟。执行一系列的洗涤（每次3×5分钟），用1X PBS-T。 沉浸在一个黑暗的房间，持续15秒增强化学发光的解决方案印迹。封面印迹用保鲜膜和地点放射自显影胶片对杂交蛋白质方在一个不透光的纸盒捕捉到相应的信号（适当大小带）。 开发以自动显影剂放射自显影膜。 注意：将印迹还可以使用的显影液和定影液从在壳体自动化显影剂机不可用一个商业来源手动开发的。 孵育印迹用6ml印迹剥离缓冲器10分钟以恒定摇动剥离α-顺抗体信号的印迹。按照步骤3.43至3.6.2使用β-肌动蛋白一抗（鼠单克隆）在1：8000稀释。 扫描和转换的最终图像转换成使用NIH ImageJ的用于定量目的（免费下载软件）TIFF图像和测量密度。 注意：软件允许读感兴趣相对面积（适当大小带）的密度和数据可以表示为α-顺密度/β肌动蛋白（一个管家基因），为任意单位或上的一个比它自己的时看家基因无效（如尿素可溶样品的情况下）。 </li>