gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח
Summary
This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.
Abstract
חיידקים אנאירוביים הרבה משיעור aerobes בהרבה נישות אנושיות כגון הבטן, פה, ונרתיק. יתר על כן, זיהומים אנאירוביים נפוצים ולעתים קרובות ממוצא ילידים. היכולת של כמה פתוגנים אנאירובי לפלוש תאים אנושיים נותנת להם אמצעי הסתגלות לברוח חסינות מולדת, כמו גם לווסת מארח התנהגות תא. עם זאת, על מנת להבטיח כי החיידקים אנאירוביים הם חיה במהלך החקירה ניסויית של האירועים יכולים להוות אתגר. Gingivalis Porphyromonas, anaerobe גראם שלילי, הוא מסוגל פולש מגוון של תאים שאינם phagocytic האיקריוטים. מאמר זה מתאר כיצד בהצלחה התרבות ולהעריך את היכולת של פ gingivalis לפלוש תאים אנושיים וריד טבור אנדותל (HUVECs). שני פרוטוקולים שפותחו: אחד למדוד חיידקים שהצלחה יכולה לפלוש ולשרוד בתוך המארח, והשני כדי להמחיש חיידקי אינטראקציה עם תאי מארח. טכניקות אלו מצריכות שימוש בanaerobic קאמרי לספק פ gingivalis עם סביבת אנאירובי לצמיחה אופטימלית.
הפרוטוקול הראשון מבוסס על assay הגנת האנטיביוטיקה, המשמש במידה רבה כדי ללמוד את הפלישה של תאי מארח על ידי חיידקים. עם זאת, assay הגנת האנטיביוטיקה הוא מוגבל; רק חיידקים תאיים שculturable הבא טיפול אנטיביוטי ותמוגה תא מארח נמדדים. כדי להעריך את כל חיידקי אינטראקציה עם תאי מארח, שני חיים ומתים, שפיתחנו פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לבחון אינטראקציה מארח הפתוגן. חיידקים שכותרתו fluorescently עם 2 ', 7'-ביסה (2-carboxyethyl) -5- (ו- 6) -carboxyfluorescein acetoxymethyl אסתר (BCECF-AM) ושימש להדביק תאים האיקריוטים בתנאים אנאירוביים. בעקבות תיקון עם paraformaldehyde וpermeabilization עם 0.2% Triton X-100, תאי מארח מסומנים עם phalloidin TRITC וDAPI לתייג שלד תא התא וגרעין, בהתאמה. הר"י מרובהGES נלקחה בנקודות שונות מוקד (Z-ערימה) מתקבלת להדמיה זמנית-מרחבי של חיידקים. שיטות ששמשו במחקר זה יכול להיות מיושמות על כל anaerobe לעיבוד חקלאי וכל סוג תא האיקריוטים.
Introduction
חיידקים אנאירוביים ליישב כמעט כל משטחים של הגוף האנושי. למרות דומיננטי בצמחייה של קטעי מעיים ומין ושתן שבו ריכוזי חמצן נמוכים, הם קיימים גם ברמות גבוהות על העור, פה, האף והגרון 1. חיידקים אנאירוביים הם גורם נפוץ של זיהומי אנדוגני ולעתים קרובות מבודדים מאתרים נגועים. עם זאת, בגלל אופיים האנין, אנאירוביים יכול להיות קשה לבודד ותרבות. מחקרים שכלל חיידקים אנאירוביים חייבים להיעשות בתנאים מוגבלים. טכניקות אנאירובי-תרבות מודרניות מאפשרות לחוקרים לחקות את הגדרות אנאירובי נדרשו ללמוד הרבה זני מעבדה אנאירובי או אפילו מבודד קליני 2,3.
חיידקים אנאירוביים פתוגניים פיתחו מערכת יחסים דינמיות ושיתוף אבולוציה עם תאי המארח שבו הם מתגוררים. רוב אנאירוביים רגישים להרג על ידי התגובה החיסונית המארח לפני שהגיע infectiרמות היחידות הארגוניות. עם זאת, כמה חיידקים פתוגניים פיתחו מנגנונים לברוח מאו לחתור תחת התגובה החיסונית המארח. הם להשיג מטרה זו באמצעות מנגנונים כגון התחמקות של הכרה חיסונית, נטרול של מתווכים חיסוניים, שינוי של חסינות תא בתיווך, פלישה של תאי מארח, ושינוי של חיסון איתות 4. Porphyromonas gingivalis, anaerobe גראם שלילי מעורב בשני אוראליים ו מחלות extraoral, הוא דוגמא אחת לפתוגן חיידקים המותאם ביותר מסוגל לגרום שינויים פתוגניים במארח 5-7.
כיסים של שלט biofilm נצברו בנקיקים עמוקים שנוצרו בין השיניים וחניכיימיים הרקמה רירית יכול נמל חיידקים אנאירוביים שמוגנים מחמצן אטמוספרי 8. כיסי חניכיים אלו משמשים כנישה לפתוגנים אנאירובי שונים, כגון פ gingivalis 9. פ gingivalis הוא הפתוגן אבן הראשה כי הוא מסוגל לשפץing קהילת חיידקי הפה בדרכים שיקדמו התפתחות והתקדמות של מחלות חניכיים 10. היא מייצרת מספר רב של גורמים ארסי הפועלים נגד קשת רחבה של חלבוני מארח ומספק מנגנונים להתחמקות של הגנות מארח 11. הוא גם מסוגל לפלוש לאפיתל, אנדותל, fibroblastic, ותאי רצועת חניכיים במבחנה 12-14 וin vivo 15. על ידי יעילות פולש תאי מארח, פ gingivalis יכול לברוח חסינות מארח. פלישה אפקטיבית של תאי מארח מאפשרת לא רק החיידק לברוח הגנות מארח, אלא גם משמשת כמאגר לזיהום מחדש בעתיד, כמו גם משנה את התא המארח. מחקרים של המנגנונים המולקולריים המעורבים בהדבקה והפנמה של החיידק על ידי תאי מארח יש צורך. בהבנת האירועים המולקולריים הקשורים בהפנמה של פ מחקר במספר מעבדות מתמקד gingivalis על ידי תאי המארחכמו גם את המנגנונים המשמשים לדיכוי ולחטוף את התגובה החיסונית ולשרוד את מנגנוני הגנת מארח העוינים.
יש מבחני רבים מסוגלים לזהות ולאפיין פתוגנים המסוגלים פולש תאי מארח. עם זאת, מחקרים במבחנה עם פתוגנים אנאירובי מציבים בעיות ניסיוניות רבות לחוקר בעיקר משום שקשה לבצע מחקרים המסתמכים על מכשירים מגושמים בהיעדר חמצן. זה מורכב על ידי העובדה שתאים האיקריוטים דורשים חמצן כדי לגדול, וכך צריך להיות מוכנות בנפרד בחממות בתרבית רקמה. דרך אחת למנוע מכשולים כזה תהיה לבצע מחקרים בחמצן באטמוספרה, אבל זה יהפוך את הצמיחה של חיידקים אנאירוביים בלתי אפשרית. שיטה נוספת תהיה להשתמש חיידקים נהרגו חום להדביק וללמוד אינטראקציות מארח תאים. עם זאת, קיימים הבדלים בין חיידקים נהרגו חום ובת קיימא שיקטינו את הרלוונטיות של interacti מארח הפתוגןב -16 ב. היא מרכזית ללמוד חיידקי קיימא עם ביטוי ללא שינוי באינטראקציה עם תאי מארח; לכן, שיטות לculturing פ gingivalis בהגדרת אנאירובי מקבל. כמו כן, שני פרוטוקולים חסכוניים פשוטים הם הפגינו להערכת יכולתה של פ gingivalis להיות מופנם על ידי תאים אנושיים טבור וריד אנדותל (HUVECs). הפרוטוקול הראשון מבוסס על assay הגנת האנטיביוטיקה הפופולרי. למרות assay הוא פשוט, ניתנים שיקולים בעת שימוש במייקרו-אורגניזמים אנאירובי. הפרוטוקול השני דורש שימוש במיקרוסקופ סריקת ניאון כדי לחזות אינטראקציה והפנים פ gingivalis. לכל assay מגבלות ויתרונות שיידונו לספק חוקר מתווה ללימוד הפולשנות של חיידקים אנאירוביים. למרות שכתב היד הנוכחית לומדת פ gingivalis וHUVECs, פרוטוקולים אלה יכולים לשמש להרבה חיידקים אנאירוביים אחרים גם כןכעבור סוגים אחרים של תאי מארח.
Protocol
Representative Results
Discussion
כל השיטות הנ"ל יכולות לשמש כדי לתכנן מבחני ספציפיים על מנת להעריך את האינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאים האיקריוטים. עם זאת, יש כמה שיקולים לבצע בהצלחה את הניסויים. הם ראשון זני חיידקים לשימוש במחקר.
זה חיוני בהשוואה של ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).
Materials
| Vinyl Anaerobic Chamber-Type B | Coy Laboratory Products | Model 2000 incubator | |
| TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Circular Coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. . Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
- Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
- Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
- Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
- Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
- Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
- Lamont, R. J., Yilmaz, &. #. 2. 4. 6. ;. Z. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
- Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
- Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
- Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
- Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
- Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
- Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
- Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
- Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
- Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
- Gospodarowicz, D. C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
- Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
- Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
- Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2′,7′-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
- He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
- Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
- Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
- Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
- Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
- Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
- Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
- Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
- Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
- Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
- Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
- Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).
