تحكم بوساطة رني من الأفلاتوكسين في الفول السوداني: طريقة لتحليل الإنتاج السموم الفطرية والتعبير التحوير في الفول السوداني /<em> الرشاشيات</em> Pathosystem
Summary
ونحن لشرح طريقة لتحليل السموم الفطرية والتعبير التحوير في بذور الفول السوداني التي تحتوي على إشارات RNA للتدخل لإسكات الجينات الأفلاتوكسين التوليف في الفطر فلافس. لم يتم الإبلاغ عن السيطرة بوساطة رني من السموم الفطرية في النباتات سابقا.
Abstract
وتشير تقديرات منظمة الأغذية والزراعة التابعة للأمم المتحدة أن 25٪ من المحاصيل الغذائية في العالم ملوثة الأفلاتوكسين. الذي يمثل 100 مليون طن من المواد الغذائية التي يجري تدميرها أو تحويلها إلى الاستهلاك غير البشرية كل عام. الأفلاتوكسين المسرطنة قوية المتراكمة عادة من قبل الفطريات فلافس وA. الطفيلي في الحبوب والمكسرات والمحاصيل الجذرية وغيرها من المنتجات الزراعية. تم استخدام إسكات خمس جينات الأفلاتوكسين التوليف التي تدخل الحمض النووي الريبي (رني) في النباتات الفول السوداني للسيطرة على تراكم الأفلاتوكسين بعد التلقيح مع A. فلافس. في السابق، لم يكن هناك أي طريقة لتحليل فعالية رني في الفول السوداني الفردي الأحداث المعدلة وراثيا، وهذه عادة ما تنتج البذور قليلة، والأساليب التقليدية للتجارب ميدانية كبيرة في ظل ظروف مواتية الأفلاتوكسين وليس خيارا. في هذا المجال، واحتمال العثور على بذور ملوثة بشكل طبيعي في كثير من الأحيان 1/100 إلى 1/1،000. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتم توزيع تلوث الافلاتوكسين بشكل موحد. يستخدم أسلوب لدينا عدد قليل من البذور المعدلة وراثيا في الحدث، مع قطع صغيرة معالجتها في الوقت الحقيقي PCR (RT-PCR) أو تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة، وتحليل تراكم الأفلاتوكسين بواسطة فائقة الأداء اللوني السائل (UPLC). خطوط الفول السوداني، معربا عن رني 288-72 و288-74، وأظهر ما يصل إلى الحد 100٪ (p≤0.01) في الأفلاتوكسين ب 1 و ب 2 مقارنة بالمجموعة الضابطة التي تراكمت حتى 14000 نانوغرام. ز -1 الأفلاتوكسين ب 1 عندما تلقيح مع aflatoxigenic A. فلافس. كمرجع، فإن مجموع الحد الأقصى المسموح به من السموم الفطرية للاستهلاك البشري في الولايات المتحدة هو 20 نانوغرام. ز -1. يصف هذا البروتوكول تطبيق مراقبة بوساطة رني من السموم الفطرية في بذور الفول السوداني المعدلة وراثيا وطرق تقييمها. ونحن نعتقد أن تطبيقه في تربية الفول السوداني وغيرها من المحاصيل سوف يجلب التقدم السريع في هذا المجال الهام من العلوموالطب والتغذية البشرية، وسوف تسهم إسهاما كبيرا في الجهود الدولية للسيطرة على السموم الفطرية، والسموم الفطرية المحتملة الأخرى في المحاصيل الغذائية الرئيسية.
Introduction
ويتعرض ما يقرب من 4.5 مليار شخص مزمن لالأفلاتوكسين 1، والمواد المسببة للسرطان أقوى المعروفة في الطبيعة 2. هذه السموم الفطرية تلوث 25٪ من المحاصيل الغذائية في العالم 3، بما في ذلك الذرة والمنيهوت والأرز والمكسرات والحبوب والتوابل. 4. الأفلاتوكسين سبب التقزم لدى الأطفال 5، يضعف الجهاز المناعي 6، موجودة في 58٪ من الكبد، سرطان في الخزعات الإنسان 7،8، وقتل مئات الاشخاص خلال تفشي الدورية للتسمم أفلاتوكسيني 9،10. الأفلاتوكسين هي السموم الفطرية المستمدة متعدد الكيتيد تنتج عادة عن طريق فلافس وA. الطفيلي. ويتم إنتاج السموم الفطرية B 1 و B 2 بواسطة A. فلافس، في حين A. الطفيلي كما تنتج G 1 و 2 G. ويبين التركيب الكيميائي لهذه المركبات واللوني يظهر انفصالهما قبل UPLC في الشكل 1. </strأونج>
الشكل 1. الأفلاتوكسين ورني إدراج الأعلى: التركيب الكيميائي (يسار) ومثال اللوني (يمين) من السموم الفطرية المستمدة متعدد الكيتيد الأكثر شيوعا أربعة: B 1، B 2، G 1 و 2 G، التي تنتجها الرشاشيات الطفيلي، A وينتج فلافس B 1 و B 2 القاع: رسم تخطيطي من شظايا الجينات في رني بناء p5XCAPD المستخدمة للتحول الفول السوداني، وأرقام تحت السهام أرقام الانضمام الجينات جزء في فلافس الجينوم الرشاشيات؛ PIV2: إنترون البطاطا. أزواج الأساس؛: BP RT_5X_1 وRT_5X_2: في الوقت الحقيقي مواقع PCR التمهيدي الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الخسائر الاقتصادية في الصادرات بسبب السموم الفطرية في الفول السوداني وحده تتجاوز 450 مليون $ دولار أمريكي اذا حسبت على أساس 4 نانوغرام. ز -1 الحد من الأفلاتوكسين يسمح للاستهلاك البشري في الاتحاد الأوروبي 11. من المعروف أن السموم الفطرية لمدة 60 عاما 12؛ ومع ذلك، على الرغم من وضعت العديد من الممارسات الزراعية للحد من تأثيرها، بما في ذلك تطبيق السلالات الفطرية الأخرى 13،14، لا توجد طريقة ثابت من السيطرة موجودا، والأصناف النباتية المقاومة غير متوفرة. اختبار الأصول الوراثية النباتية لمقاومة السموم الفطرية أمر صعب للغاية، لأنه حتى في ظل ظروف مواتية لغزو الممرض، وتراكم السموم الفطرية لا يمكن التنبؤ بها ولا تتبع التوزيع الطبيعي. وبالتالي، تتطلب عادة التجارب المساحات المنزرعة كبيرة، ومئات من البذور وعينات متعددة من 100-1،700 ز للحد من تقلب من 15،16 البيانات.
كان التدخل RNAاكتشف في عام 1998 17؛ وفوائد "إسكات" يجري حاليا بحث في عدد من التطبيقات الجديدة، على سبيل المثال، في العلاجات الإنسان ضد سرطان الثدي النقيلي 18، سرطان الكبد 19، سرطان الدم النخاعي 20، وحماية النباتات من الحشرات والديدان الخيطية 22 21. في النباتات، يمكن أن إشارات تدخل RNA السفر خلية إلى أخرى، مع RNA الصغيرة التدخل (سيرنا) وارتفاع الجزيئي RNA الوزن هي المسؤولة عن الجين posttranscriptional النظامية إسكات 23،24، حتى داخل مسببات الأمراض الفطرية التي هي على اتصال وثيق مع مضيفه مصنع 25. وقد وصفت فعالية رني على إسكات بوساطة مصنع للجينات للفطريات الممرض في عدد قليل من pathosystems النبات، لهذه، والفحص البصري للأعراض في الأجزاء الهوائية للنباتات (يترك) يسمح الكمي المرض، أي oomycete Bremia في الخس 26 ، بوسينيا في القمح <suP> 27 والفيوزاريوم في الموز 28. أصعب بكثير هو تقييم فعالية رني للسيطرة على السموم الفطرية في النباتات، وعلى الأخص السموم الفطرية في الفول السوداني كما تظهر لا يترك أي أعراض للعدوى، وأجهزة غزت (بذور) تحت عدة بوصات من التربة، وحدوث عدوى لا يمكن التنبؤ بها، والكيميائي فقط تحليل يمكن تحديد وجود الأفلاتوكسين. بالإضافة إلى ذلك، كل حدث المعدلة وراثيا في الفول السوداني ينتج عادة عدد قليل من البذور (4-6 في النبات)؛ وبالتالي، الاختبار التقليدي لتراكم سمة عدم الأفلاتوكسين في مؤامرات ميدانية كبيرة ودائم المواسم الزراعية بأكملها، واستخدام المئات من البذور غير ممكن. ووصف طريقة هنا لتحليل في أقل من أسبوع واحد، وبذور الفول السوداني رني لحضور التحوير ولعدم تراكم الأفلاتوكسين سمة، وذلك باستخدام عدد قليل فقط البذور.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تجلى إسكات الجينات في مسببات الأمراض الفطرية 27،43، ولكن النبات المضيف رني بوساطة، لا توجد المنشورات التي تبين جدوى تحكم رني بوساطة من تراكم السموم الفطرية في النباتات. وكان أحد العوامل المحددة لهذه الدراسات في الفول السوداني لعدم وجود طريقة لتقييم تراكم النمط الظاهري عدم الأفلاتوكسين في النباتات الفردية، كما تظهر أوراق أي أعراض على العدوى الفطرية القرون تحت الأرض. وبالإضافة إلى ذلك، وتراكم توزيع يست عادة من السموم الفطرية، والحاجة للحصول على عينات كبيرة للتحليل الكيميائي 15،16 أعاقت القياس الكمي لتأثير رني المحتمل على محطة واحدة. الطريقة المعروضة هنا يتكون من 72 ساعة التجارب باستخدام خمسة بذور لأداء ثلاث عينات 24 ساعة بعد الفترة في ثلاث نسخ (الجدول 1، الشكل 7). مقارنة لتحليل الأفلاتوكسين النموذجية التي تتطلب ما لا يقل عن 100 غرام من البذور، وأسلوبنا هو مناسبة خاصة لindividuaأحداث ل المعدلة وراثيا من النباتات الفول السوداني التي تنتج في البداية لا يزيد عن اثنين أو ثلاثة قرون.
وقد تجلى إسكات بوساطة الحمض النووي الريبي التوليف الأفلاتوكسين عن طريق تحويل وراثيا فلافس وA. الطفيلي. منذ aflR غير منظم الرئيسي لإنتاج الأفلاتوكسين في A. فلافس وA. الطفيلي 44،45، فإنه يصبح هدفا للاهتمام لإسكات بوساطة الحمض النووي الريبي في النباتات. ومع ذلك، فقد ثبت الاختلافات الجينية في aflR بين الرشاشيات الأنواع 46، وتلك المتغيرات الجينية يمكن الهروب إسكات إذا لم يكن هناك تسلسل الكمال مطابقة مع الإشارة رني المنتجة في البلد المضيف النبات. وهكذا، كان aflR واحدا من الأهداف لإسكات في ناقلات p5XCAPD، ولكنه لم يكن الوحيد. يكرر مقلوب من الجين aflR أدخلت A. فلافس وA. أدى الطفيلي عن طريق التحول في إسكات والحد الأدنى أو أي منتجأيون من الأفلاتوكسين 47 (ماكدونالد وآخرون، 2005b). أيضا، منع إسكات الجينات aflD إنتاج الأفلاتوكسين بنسبة تصل إلى 98٪ في A. فلافس وA. الطفيلي في التحول المباشر 48. لزيادة احتمال النجاح في نظامنا، تحولت الفول السوداني مع تكرار شظايا مقلوب خمس جينات لها دور في إنتاج الأفلاتوكسين في A. فلافس. هنا يتبين أن استخدام p5XCAPD الذي يستهدف لإسكات جينات عديدة في مسار تخليق الأفلاتوكسين، و 90٪ انخفاض مستويات -100٪ من الأفلاتوكسين ب 1 و ب 2 تحققت في خط 288-72، وانخفاض مستويات 60-100٪ تراكمت في خط 288-74 مقارنة بالمجموعة الضابطة، عندما تم تلقيح النبتات نصف مع A. فلافس، أرقام 4 و 7. والأهم من ذلك، الكشف عن هذه الطريقة فروق ذات دلالة إحصائية في تراكم الأفلاتوكسين من خطوط 288-72، 288-74 مقابل السيطرة في كافة مراحل التجربة من خلال تطبيق statis حدوديالتشنجات اللاإرادية، الشكل (7). ونظرا لصغر حجم العينة، من المهم تسليط الضوء على الحاجة إلى استخدام وسيلة قوية للكشف عن السموم الفطرية، وقد تم تحليل هذه التجارب من قبل UPLC التي لديها ارتفاع القرار، وخمسة أضعاف الأداء العالي وحساسية أعلى ثلاث مرات من HPLC 49.
التعبير عن رني إدراج في 288-74 تم الكشف فقط في الفلقات غير الناضجة (الأصفر) في 24 ساعة الحضانة. لم يتم الكشف عن إدراج رني بواسطة RT-PCR على النبتات ناضجة من 288-74 في 24 ساعة، أو على أي مجموعة النضج في 48 ساعة، الشكل (6). وقد لوحظ هذه الظاهرة نفسها في رني خطوط الفول السوداني المعدلة وراثيا أخرى (أرياس، RS، 2015 غير منشورة)، حيث تم الكشف عن عادة النصوص رني فقط على النبتات غير ناضجة في 24 ساعة. وعولج عينات الحمض النووي الريبي مع الدناز قبل التوليف [كدنا، كانت البيانات تطبيع إلى مستوى الأكتين التعبير وأي دليل على تلوث DNA لوحظ. كان ينبغي أن يكون DNA الموجودة في العينات، ينبغي عليهتم الكشف في العينات ساعة 48 أيضا، ولكن باستمرار أن الأمر لم يكن كذلك. التعبير تحت سيطرة 35S-المروج ليست دائما موحدة. يمكن أن تتأثر الظروف البيئية 50، ونوع الأنسجة والمرحلة التنموية 51،52. وفي الوقت نفسه، في مسار التدخل RNA، فإن معدل تسوس مرنا ومعدل تسوس سيرنا يمكن أن تختلف بشكل كبير 53. فمن الممكن أن التدهور السريع للمرنا من خلال آلية التدخل RNA يمكن أن يمنع الكشف عن مرنا في 48 ساعة الحضانة. إذا كان غياب التعبير في 48 ساعة نظرا لانخفاض 35S-المروج مدفوعة النسخ، أو إلى تدهور سريع من الرنا المزدوج الجديلة التي المقامر ينتظر الجواب. وبالتالي، فإن الكشف عن الرنا الصغيرة عالية الإنتاجية تسلسل تعطي فكرة أفضل عن العمليات التي تجري من خلال رني 54 في هذه التجارب. ومع ذلك، منذ RNA إسكات ينتشر بشكل منتظم، وذلك أساسا من خلال اللحاء من photosyntأكره المصادر إلى السكروز المصارف (في هذه الحالة بذور الفول السوداني) 55، يمكن أن يحدث إسكات الأفلاتوكسين التوليف في البذور دون التعبير المحلي للرني إدراج. لا يزال الكثير من الأبحاث إلى أن يتم تحديد مستوى الحد الأدنى من الرنا التدخل الصغيرة (الرناوات siRNAs) اللازمة لمنع تراكم الأفلاتوكسين في البذور. ومن المهم أن نؤكد على حقيقة أن كلا من والتعبير مرنا للرني بناء (الشكل 6)، وأظهر تراكم السموم الفطرية B 1 و B 2 (الشكل 7) نتائج مختلفة عن غير ناضجة (الصفراء) مقابل. ناضجة (البني) النبتات. نباتات الفول السوداني لها النمو غير محدد، أي أنها تقدم عند الحصاد مجموعة من القرون النضج، الشكل 2. وبالإضافة إلى ذلك، والبذور من جماعات النضج المختلفة تختلف في تركيبتها الكيميائية، على سبيل المثال، 2،4٪ سكروز في البذور غير الناضجة، و 1.9٪ في البذور الناضجة تحت نفس الظروف الميدانية 56،57. وهكذا، لفهم الكفاءه الفعليةذ السيطرة بوساطة RNA تراكم الأفلاتوكسين، فمن المهم تحليل مجموعة النضج بشكل منفصل.
A دفاع الطبيعي للبذور الفول السوداني هو إنتاج phytoalexins، والتي تختلف في تنوع المركبات المنتجة وكمياتها النسبية تبعا لنضج البذور والظروف البيئية 58-61، وكان أعلى بشكل خاص في الأجنة مقارنة النبتات 62. يكون الأجنة أيضا على تركيزات أعلى بكثير من الأحماض النووية، سواء DNA و RNA من النبتات (أرياس RS، غير منشورة). كما بذور الفول السوداني تنضج، والتغيرات في علم وظائف الأعضاء، والتركيب الكيميائي تحدث 63. مضادات الأكسدة الفينولية في شكل تيستا الفول السوداني العفص مكثف مع نشاط كابح الفطريات 64؛ وهذا هو أيضا واضح في لون ميزوكارب التي تعكس مراحل النضج والأصفر إلى الأسود 35، ومحتواه من العفص والمركبات الفينولية يزيد مع استحقاق 65. وبالتالي، وجود رتهت أو الأجنة في التجربة، نظرا خصائصها المضادة للميكروبات، يمكن أن يقتصر نمو الفطريات، وبالتالي المبالغة في تقدير تأثير رني إسكات، وبالتالي، تم إزالتها. أيضا، إزالة تيستا والأجنة تساعد لحد من مصادر التباين في التحليل، ونصف فلقة الذي يحمل فإن الجنين يكون أكثر phytoalexins والمزيد من المحتوى RNA.
بالإضافة إلى تحليل من قبل الجماعات النضج وإزالة تيستا والجنين في هذه التجارب، من المهم أن نشير إلى عدد قليل من أكثر الملاحظات: أ) على الرغم من ظهور نتائج لمدة تصل إلى 96 ساعة الحضانة، فمن المستحسن استخدام ما لا يزيد عن 72 ساعة للحصول على نتائج متسقة، والحصول على تدهور البذور بنسبة 96 ساعة. وب) في حين أن نصف النبتات من نفس البذور، وعلى الرغم من العينة عشوائيا، لا تشكل عينات مستقلة تماما، وأظهر RT-PCR وتراكم الأفلاتوكسين ضمن أحداث المعدلة وراثيا الحد الأدنى الاختلاف بين البذور. أيضا، الاعتماد على الجراثيم الفطرية دقيق، وحجم اللقاحالصورة من 2 ميكرولتر، وتطبيق جراثيم على السطح قطع من النبتات تجنب نازف على جانبي مهمة للتأكد من يتعرضون للجراثيم نبتت إلى الأنسجة النباتية. يجب أن يكون الماء / أجار على لوحات عند 1.5٪ (ث / ت)، ليونة أجار يسبب جريان المياه من الجراثيم كما هو مبين في الإطار الأخير من الشكل 4 (القاع). يجب توافر البذور المعدلة وراثيا عن حدث معين تكون محدودة، ويمكن أن يتم أخذ العينات في نسختين بدلا من ثلاث نسخ الحصول على نتائج مماثلة (أي الشكل 7). ومع ذلك، فإن عينات من ثلاث نسخ يساعد على التقليل من الخطأ المعياري. والقيد الوحيد من هذا الأسلوب هو أنه يتطلب نظام حساسة للغاية (UPLC) للكشف عن الأفلاتوكسين / الكمي، ولكن في نفس الوقت وهذا يقلل من احتمال المبالغة في تقدير تأثير رني أن الأفلاتوكسين لا يتم الكشف عن طريق وسائل أقل حساسية.
في الختام، هذا الأسلوب يقدم لأول مرة نهج يمكن الاعتماد عليها لدراسةتأثير رني في السيطرة على السموم الفطرية. تقليل الوقت لتجربة من الموسم الزراعي بأكمله إلى أقل من أسبوع واحد، وهذه الطريقة سوف يتسارع بشكل كبير للبحث عن رني الفول السوداني / الرشاشيات pathosystem نحو التخفيف و / أو القضاء على السموم الفطرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.
Materials
| Primers, oligonucleotides | DNA Technologies, Coralville, IA, USA | n/a | |
| Dneasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69106 | |
| Czapek Dox agar medium | Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | CM0095 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | BP 1423 | |
| Freezer -80°C | n/a | n/a | |
| Aluminum Oxide, Al2O3 | Fisher Scientific | A941 | |
| SPE Reservoirs 1.5 mL | Grace Davison Discovery Scientific | 210011 | |
| Frits for 1.5 mL SPE reservoir | Grace Davison Discovery Scientific | 211401 | |
| Autosampler vials | Waters Corporation, Milford, MA | 186005221 | |
| Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software | Thermo Electron Corp., San Jose, CA | ||
| Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A6636; A9887; A0138; A0263 | |
| Systat Software 12.2 | SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA | ||
| Trizol reagent | Invitrogen, CA | 15596-018 | |
| SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix | Invitrogen, CA | 11752-050 | |
| ABI 7500 Real-Time PCR | Lifetechnologies, Grand Island, NY | 4406984 | |
| Luria Broth-Miller | Fisher Scientific | R453642 | |
| pENTR1A | Invitrogen, CA | A10462 | |
| LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-020 | |
| T4 DNA Ligase | NEB Biolabs | M0202L | |
| Gelrite | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1919 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406 | |
| QIAcube robot workstation | Qiagen, Valencia, CA | 9001292 | |
| Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin | Goldbio, St. Louis, MO | cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, CA | 11304-029 |
References
- Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. The American Journal of Clinical Nutrition. 80, 1106-1122 (2004).
- American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Research. 40, 1-12 (1980).
- Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , (2013).
- Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5, 1447-1461 (2013).
- Gong, Y. Y., et al. Determinants of aflatoxin exposure in young children from Benin and Togo, West Africa: the critical role of weaning. International Journal of Epidemiology. 32, 556-562 (2003).
- Eaton, D. L., Groopman, J. D. . The toxicology of aflatoxins: human health, veterinary, and agricultural significance. , (1994).
- Murugavel, K. G., et al. Prevalence of aflatoxin B1 in liver biopsies of proven hepatocellular carcinoma in India determined by an in-house immunoperoxidase test. Journal of Medical Microbiology. 56, 1455-1459 (2007).
- Wang, J. S., et al. Hepatocellular carcinoma and aflatoxin exposure in Zhuqing Village, Fusui County, People’s Republic of China. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 10, 143-146 (2001).
- Azziz-Baumgartner, E., et al. Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004. Environmental Health Perspectives. 113, 1779-1783 (2005).
- Lye, M. S., Ghazali, A. A., Mohan, J., Alwin, N., Nair, R. C. An outbreak of acute hepatic encephalopathy due to severe aflatoxicosis in Malaysia. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 53, 68-72 (1995).
- Villers, P. Aflatoxins and safe storage. Frontiers in Microbiology. 5, 158 (2014).
- Kensler, T. W., Roebuck, B. D., Wogan, G. N., Groopman, J. D. Aflatoxin: A 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology. Toxicological Sciences. 120, S28-S48 (2011).
- Dorner, J. W., Cole, R. J., Wicklow, D. T. Aflatoxin reduction in corn through field application of competitive fungi. Journal of Food Protection. 62, 650-656 (1999).
- Cotty, P. J., Bhatnagar, D. Variability among atoxigenic Aspergillus flavus strains in ability to prevent aflatoxin contamination and production of aflatoxin biosynthetic-pathway enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2248-2251 (1994).
- Whitaker, T. B. Standardisation of mycotoxin sampling procedures: an urgent necessity. Food Control. 14, 233-237 (2003).
- Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Science. 31, 59-63 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Rafael, D., et al. EMT blockage strategies: Targeting Akt dependent mechanisms for breast cancer metastatic behaviour modulation. Current Gene Therapy. , (2015).
- Li, G., Chang, H., Zhai, Y. P., Xu, W. Targeted silencing of inhibitors of apoptosis proteins with siRNAs: a potential anti-cancer strategy for hepatocellular carcinoma. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention: APJCP. 14, 4943-4952 (2013).
- Koldehoff, M. Targeting bcr-abl transcripts with siRNAs in an imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patient: challenges and future directions. Methods in Molecular Biology. 1218, 277-292 (2015).
- Zhang, J., et al. Pest control. Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science. 347, 991-994 (2015).
- Ajjappala, H., Chung, H. Y., Sim, J. S., Choi, I., Hahn, B. S. Disruption of prefoldin-2 protein synthesis in root-knot nematodes via host-mediated gene silencing efficiently reduces nematode numbers and thus protects plants. Planta. 241, 773-787 (2015).
- Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annual Review of Genetics. 41, 305-330 (2007).
- Vazquez, F., Hohn, T. Biogenesis and biological activity of secondary siRNAs in plants. Scientifica. , (2013).
- Tinoco, M. L. P., Dias, B. B. A., Dall’Astta, R. C., Pamphile, J. A., Aragao, F. J. L. In vivo trans-specific gene silencing in fungal cells by in planta expression of a double-stranded RNA. BMC Biology. 8, (2010).
- Govindarajulu, M., Epstein, L., Wroblewski, T., Michelmore, R. W. Host-induced gene silencing inhibits the biotrophic pathogen causing downy mildew of lettuce. Plant Biotechnology Journal. , (2014).
- Yin, C., Jurgenson, J. E., Hulbert, S. H. Development of a host-induced RNAi system in the wheat stripe rust fungus Puccinia striiformis f. sp. tritici. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24, 554-561 (2011).
- Ghag, S. B., Shekhawat, U. K., Ganapathi, T. R. Host-induced post-transcriptional hairpin RNA-mediated gene silencing of vital fungal genes confers efficient resistance against Fusarium. wilt in banana. Plant Biotechnology Journal. 12, 541-553 (2014).
- Filichkin, S. A., et al. Efficiency of gene silencing repeats vs. transitive RNAi in Arabidopsis: direct inverted vectors. Plant Biotechnology Journal. 5, 615-626 (2007).
- Sciaky, D., Montoya, A. L., Chilton, M. D. Fingerprints of Agrobacterium Ti Plasmids. Plasmid. 1, 238-253 (1978).
- Clark, D. J., Maaloe, O. DNA Replication and Division Cycle in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 23, 99-112 (1967).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum. 15, 473-497 (1962).
- Srinivasan, T., Kumar, K. R. R., Kirti, P. B. Establishment of efficient and rapid regeneration system for some diploid wild species of Arachis. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 101, 303-309 (2010).
- Gomes, A. L. V., et al. Single-tube nested PCR using immobilized internal primers for the identification of dengue virus serotypes. Journal of Virology Methods. 145, 76-79 (2007).
- Williams, E. J., Drexler, J. S. A non-destructive method for determining peanut pod maturity. Peanut Science. 8, 134-141 (1981).
- Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. Journal of AOAC International. 85, 642-645 (2002).
- Biselli, S., Hartig, L., Wegner, H., Hummert, C. Analysis of Fusarium. toxins using LC-MS-MS: Application to various food and feed matrices. LC GC North America. 23, 404-413 (2005).
- Arias, R. S., Sobolev, V. S., Orner, V. A., Dang, P. M., Lamb, M. C. Potential involvement of Aspergillus flavus laccases in peanut invasion at low water potential. Plant Pathology. 63, 353-363 (2014).
- Dang, P. M., Chen, C. Y., Holbrook, C. C. Evaluation of five peanut (Arachis hypogaea) genotypes to identify drought responsive mechanisms utilising candidate-gene approach. Functional Plant Biology. 40, 1323-1333 (2013).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C-T method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Amaike, S., Keller, N. P. Aspergillus flavus. Annual Review of Phytopathology. 49, 107-133 (2011).
- Nowara, D., et al. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis. Plant Cell. 22, 3130-3141 (2010).
- Woloshuk, C. P., et al. Molecular characterization of aflR, a regulatory locus for aflatoxin biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2408-2414 (1994).
- Price, M. S., et al. The aflatoxin pathway regulator AflR induces gene transcription inside and outside of the aflatoxin biosynthetic cluster. FEMS Microbiology Letters. 255, 275-279 (2006).
- Ehrlich, K. C., Montalbano, B. G., Cotty, P. J. Sequence comparison of aflR from different Aspergillus. species provides evidence for variability in regulation of aflatoxin production. Fungal Genetics and Biology. 38, 63-74 (2003).
- McDonald, T., Brown, D., Keller, N. P., Hammond, T. M. RNA silencing of mycotoxin production in Aspergillus and Fusarium species. Molecular Plant Microbe Interactions. 18, 539-545 (2005).
- Abdel-Hadi, A. M., Caley, D. P., Carter, D. R., Magan, N. Control of aflatoxin production of Aspergillus flavus. and Aspergillus parasiticus. using RNA silencing technology by targeting aflD. (nor-1) gene. Toxins (Basel). 3, 647-659 (2011).
- Swartz, M. E. Ultra performance liquid chromatography (UPLC): An introduction: Separation Science Redefined. LCGC North America. , 8-14 (2005).
- Maghuly, F., Khan, M. A., Fernandez, E. B., Druart, P., Watillon, B., Laimer, M. Stress regulated expression of the GUS-marker gene (uidA) under the control of plant calmodulin and viral 35S promoters in a model fruit tree rootstock: Prunus incisa x serrula. Journal of Biotechnology. 135, 105-116 (2008).
- de Mesa, M. C., Santiago-Doménech, N., Pliego-Alfaro, F., Quesada, M. A., Mercado, J. A. The CaMV 35S promoter is highly active on floral organs and pollen of transgenic strawberry plants. Plant Cell Reports. 23, 32-38 (2004).
- Sunilkumar, G., Mohr, L., Lopata-Finch, E., Emani, C., Rathore, K. S. Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promoter in cotton as revealed by GFP. Plant Molecular Biology. 50, 463-474 (2002).
- Groenenboom, M. A. C., Maree, A. F. M., Hogeweg, P. The RNA silencing pathway: The bits and pieces that matter. PLoS Computational Biology. 1, 155-165 (2005).
- Zhao, D., Song, G. Q. High-throughput sequencing as an effective approach in profiling small RNAs derived from a hairpin RNA expression vector in woody plants. Plant Science: an International Journal of Experimental Plant Biology. 228, 39-47 (2014).
- Kamthan, A., Chauduri, A., Kamthan, M., Datta, A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Frontiers in Plant Science. 6, 208 (2015).
- Manda, A., Bodapati, P. N., Rachaputi, N. C., Wright, G., Fukai, S. . Aflatoxins and their relationship with sugars in peanut (Arachis hypogaea L). , (2004).
- Uppala, S. S. . Factors affecting pre-harvest aflatoxin contamination of peanut (Arachis hypogaea L). , (2011).
- Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56, 1949-1954 (2008).
- Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55, 2195-2200 (2007).
- Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57, 62-68 (2009).
- Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105, 117-128 (1989).
- Sobolev, V. S. Production of phytoalexins in peanut (Arachis hypogaea) seed elicited by selected microorganisms. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 1850-1858 (2013).
- Basha, S. M. M., Cherry, J. P., Young, C. T. Changes in free amino acids, carbohydrates, and proteins of maturing seeds from various peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars. Cereal Chemistry. 53, 586-596 (1976).
- Lansden, J. A. Aflatoxin inhibition and fungistasis by peanut tannins. Peanut Science. 9, 17-20 (1982).
- Yen, G. C., Duh, P. D., Tsai, C. L. Relationships between antioxidant activity and maturity of peanut hulls. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 41, 67-70 (1993).
