JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

Published: November 19, 2015
doi:
10.3791/53362
, , , , , ,
1Department of Mechanical Engineering,Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Biomedical Engineering and Sciences,Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biology,University of Maryland, 4College of Engineering,University of Georgia, 5Department of Engineering Sciences and Mechanics,Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Bakteriyel mechanosensitive kanallar biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel dönüştürücüler olarak kullanılabilir. Damlacık arayüz bilayers (Dıb'leri), bu tür cihazlara hücre ilham yapı blokları, birleştirmek ve mechanosensitive kanallar teşvik etmek, yeni platformlar temsil etmektedir. Burada, biz, Dıb'leri oluşturan mekanik stimülasyonu altında mechanosensitive kanalların çalışma izin yeni bir mikropipet tabanlı bir yöntem göstermektedir.

Abstract

MsCl, büyük bir iletkenliğe mechanosensitive kanalı (MSC), bakteri ani hipo-osmotik şok hayatta yardımcı olan bir yerde osmolite salma valfidir. Keşfedilmiştir ve sıkı yaklaşık üç yıl için patch-clamp tekniği kullanılarak araştırılmıştır. Geçirgenliği yanıta hücre zarına uygulanan gerilme çevirme Temel rolü yapay membran bazlı biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel transdüktör olarak işlev için güçlü bir aday yapar. Bu tür aygıtlara yapı blokları olarak hizmet veren, damlacık ara biriminde iki katlı tabakalar (Dıb'leri) MsCl kanallarının dahil edilmesi ve uyarılması için yeni bir platform olarak kullanılabilir. Burada, ilave MsCl kanallarının aktivitesini Dıb'leri oluşturulması ve ölçmek için bir mikropipet dayalı bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, iki karşılıklı (ortak eksenli bir konuma) borosilikat cam mikropipet uçlarına sabitlenmiş lipid kaplı, sıvı damlacıklarının meydana gelir. Damlacıklar temas ettirildiği zaman, bir lipid iki katmanlı arayüzükurdu. Bu teknik, kimyasal bileşime ve her bir damlacık boyutu üzerinde kontrol, hem de iki tabakalı arayüzünün bir boyut sunar. Harmonik piezoelektrik aktüatör bağlı mikropipetler birine sahip istenen salınım uyaran sunmak için yeteneği sağlar. Deformasyon sırasında damlaların şekil analizi sayesinde, ara yüzeyde oluşan gerilim tahmin edilebilir. Bu tekniği kullanarak, DIB sisteminde MsCl kanallarının ilk etkinlik bildirilmektedir. MS kanalları Bunun yanı sıra, kanalların diğer tip aktiviteler, bu platformun çoklu işlevselliğini kanıtlayarak, bu yöntem kullanılarak incelenebilir. Burada sunulan yöntem, temel zar özelliklerinin ölçümü sağlayan simetrik ve asimetrik membranların oluşumu üzerinde daha fazla kontrol sağlar ve teşvik ve mechanosensitive kanalları incelemek için alternatif bir yoldur.

Introduction

Son on yılda, yapay lipid iki katmanlı montajı ölçüde damlacık arayüzü iki tabakalı yönteminin geliştirilmesi yoluyla ileri olmuştur. Istikrarlı ve sağlam olarak bilinen, Dıb'leri (Mueller) boyalı klasik ve katlanmış (Montal-Mueller) düzlemsel bilayers 1 alternatif model sistemler olarak kendilerini empoze. Lipit katmanlarını oluşturmak için damlacıkları kullanma fikri 1960'larda 2 büyük olsa da, yakın zamana kadar popülerlik kazandı değildir. İlk başarılı girişim Bayley gruptan 4-6 damlacıkların bir ağ kullanarak iki tabakalı oluşumunu gösteren çeşitli çalışmalar takip Takeushi grubunda 3, tarafından rapor edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, kapsülleme teknikleri yeni uyaranlara duyarlı malzeme sistemlerinin 10 yapı taşları olarak Dıb'leri kullanarak kavramını öncülük Leo grubunun 7-9, tarafından önerilmiştir. Daha önceki çalışmalarda, Dıb'leri elektrik 9,11, kimya yanıt yeteneklerini kanıtladılar10,12 ical ve optik uyaranlar 13. DIB 10,14 sulandırılmış zaman farklı uyaranlara duyarlı fonksiyonları ile çeşitli biyomoleküllerin etkin bir teşvik edilmiştir. Önemli bir soru ortaya çıkar bu başarılı girişimleri ışığında: mekanik uyarana cevap DIB, uygun biyomoleküllerin dahil edilmiştir ki? Bir DIB etkiyen arayüzey kuvvetleri diğer iki tabakalı sistem 15,16 olarak farklıdır. Bu nedenle, damlacıklar tarafından tutulan iki tabakalı gerilim Su-lipit yağ ara yüzlerinde gerilimin düzenlenerek kontrol edilebilir; boyalı veya katlanmış iki tabakalı sistemler ile uygulanamaz bir kavram.

Yaygın osmolite bırakma vanaları ve bakteriyel sitoplazmik membran temel unsurları olarak bilinen MsCl kanalları, artan membran gerilimi 17,18 tepki. Hipo-osmotik şok durumunda, birkaç kanal küçük hücre membranında bulunan 19 mas oluşturabilirsive geçirgenlik tepkisi hızlı lizis 20 bakteri tasarruf iyonları ve küçük molekülleri serbest bırakmak için. Biyofizik, MsCl iyi incelenir ve belirgin yama kelepçe tekniği 21-23 ile öncelikle karakterizedir. MsCl en yolluk mekanizması 24,25 açıklayan Güvenilir yapısal modeller kendi homolog kristal 28 modelleme yapısı 26,27, ve kapsamlı deneylerle 24,29-31 sonuçlarına göre önerdi almaktadır. ~, Uygulanan gerilim altında 10 mN / m, zar geçiş sarmallarının sıkı bir demet oluşur kapalı kanal, bir p 28 bir su dolu ileten ve gözenekleri 21,24,32 oluşturan büyük ölçüde eğik sarmallarının bir halka dönüşür. Ayrıca, iç TM1 etki kesişme yerleştirilmiş sıkı bir kapının hidrofobiklik, kanal 33 aktivasyon eşiğini belirler olduğu tespit edilmiştir. Buna bağlı olarak, bulunmuştur ki, kapının hidrofobikliğini azaltarak, tension eşiği 22 indirdi olabilir. MsCl bu özelliği öncelikle ilaç dağıtım amaçlı çeşitli kontrol valfleri 34 tasarımı mümkün kıldı. Tüm yukarıda belirtilen özellikleri için ve elektrofizyolojik faaliyetler içine hücre zarı aşırı gerilimleri tercüme onun temel rolü dayalı MsCl Dıb'leri bir mekanoelektriksel transdüser olarak büyük bir uyum yapar.

Bu yazıda, mekanik uyarım altında birleşmiş MsCl kanallarının aktivitesini Dıb'leri oluşturmak ve ölçmek için orijinal bir mikropipet tabanlı yöntem mevcut. Biz ilk defa, mekanik uyarıcı ve Dıb'leri 35 içinde MsCI ve V23T düşük eşikli mutant fonksiyonel rekonstitüsyondan KYB'lerin yanıt rapor.

Deneysel sistem karşılıklı iki borosilikat cam mikropipet uçlarına sabitlenmiş lipid kaplı, sıvı damlacıklarının meydana gelir. Damlacıklar temas ettirildiği zaman, bir lipid iki katmanlı arayüzü fo olduğuonaylanmamis. Bu teknik, her damlacık (dökme) kimyasal bileşimi ve boyutu üzerinde kontrol, hem de iki tabakalı arayüzünün bir boyut sunar. Buna ek olarak, her bir broşür koşullarında çeşitli lipid bileşimleri ile asimetrik membranlar kolayca oluşturulabilir. , Harmonik piezoelektrik aktüatörün bağlanmış mikropipetler birine sahip bir önceden programlanmış tek siklus ya da titreşimli uyarıcı uygulamak olanağı sağlar. Gerginlik onu destekleyen hem damlacıkların sıkıştırma yoluyla yapay membran teslim edilir. Damlacık deformasyonun bir neticesi olarak, su-lipit yağlı arayüzler artış, ve aynı zamanda damlacıklar arasındaki açının alanları membran gerilimi ve geçici MsCl aktivasyonunda bir artışa neden azalır. Deformasyon sırasında damlaların şekil analizi sayesinde, ara yüzeyde oluşan gerilim tahmin edilebilir. Bu makaledeki odak DIB mekano-transdüksiyon özelliklerine olsa bile, biz de vurgulayan diğer tip biyoörneğin alamethicin gibi moleküller, bu çok fonksiyonlu platform tarafından aktive edilebilir. Biz hazırlanması montaj ve adım adım bir şekilde bu yeni yöntem ile ölçüm tüm teknik özellikleri, burada sunulmuştur.

Protocol

PEG-DMA Hidrojeller hazırlanması 1. Uygulama için uygun bir ölçme / karıştırma kabı (şişesi, beher, vs.) Seçin. Deterjan ve su kullanarak iyice temizleyin ve sonra tüy bırakmayan bir doku silecekler ile silin. Parmak uçlarından yağlar ile cam kirletmesini önlemek için eldiven giyin. Deterjan kalıntılarını çıkarmak için yeterli deiyonize su kabı durulayın. Daha sonra, su kurtulmak izopropil alkol (IPA,% 99.5) ile sprey ve temiz kadar silmek için, havsız doku ile konteyner silin. IPA tamamen buharlaşması için izin vermek için bir vakum odasında yerleştirin. Damıtılmış su ile hidrojel oluşturan yöntemde kullanılan laboratuar ekipmanları kalan temizleyin. Bir laboratuar ölçeği kullanılarak bir polimer; poli (etilen-glikol) dimetakrilat (MW = 1000 g / mol PEG-DMA), 4 g ağırlığında PEG-DMA hidrojel çözeltisi (ağırlık / hacim)% 40 hazırlamak. 4 bir sonikatör banyosu kullanılarak şişeye ve ısı içine tartılır PEG-DMA yerleştirinKatı PEG-DMA kadar 5-55 ° C sıvılaştırılmış etti. Sürecinde, suyu dışarıda tutmak için Parafilm / yağlı kağıt ile balonun açılış kapsamaktadır. PEG-DMA sıvılaştırılmış sonra, tampon çözeltisi (500 mM KCI, 10 mM MOPS, pH 7,0) toplam hacmi ~ (altı aylık bir süre boyunca birçok deneyde için yetecek kadar) 10 ml ulaşana kadar ekleyin. % 0,5 sertleştiriciyi (ağırlık / hacim). Bu durumda, 10 mi karışımına sertleştirici madde 0.05 g ekleyin. Lütfen sonikatör banyosuna içine yerleştirilir ve parçaları (10 dakika, 250 watt civarında) çözelti içinde çözünmesi için izin verir. Not: sertleştirme ajanı solüsyona eklendikten sonra yeterli bir zaman miktarı için bir ışık kaynağına maruz kalması durumunda, hidrojeller (katılaşması) tedavi edecek. Bu mücadele yardımcı olmak için, siyah bant ile flakon / kabı sarın ve karanlık bir yerde saklayın. Bu çözelti, oda sıcaklığında (22 ° C) birkaç hafta muhafaza edilebilir. Lipos 2. hazırlanmasıomes 1,2-diphytanoyl- sn -glisero-3-fosfokolin (DPhPC) sentetik 20 mg tamponu 10 ml (500 mM KCI, 10 mM MOPS, pH 7.0) ilave edilerek, bir 2 mg / ml lipid çözeltisi 10 ml hazırlayın lipidler liyofilize bir toz halinde satın alınmıştır. Emin hem lipid veziküller ve tampon çözelti iyice (her şey çözülür zaman Karışım homojen ve puslu görünmelidir) karıştırılır olun. Dondurulmuş (-20 ° C) alınmakta ve altı kez olmak üzere toplam yeni lipit karışımı çözülme. Hiçbir zaman ise ortam sıcaklığı, oda sıcaklığında karışım çözülme olsun. Bir ticari olarak temin edilebilen ekstruder kullanarak, 0,1 um'lik bir membran filtresinden önce 0,4 um polikarbonat membran filtresinden ve daha sonra altı kez bütün lipid süspansiyonunun zorlayarak lipidleri a'ya. Bu işlem, (filtrenin gözenek boyutu eşit) 100 nm'ye yakın çapa sahip parçacıklar elde edilir. Not: diğer lipidler ve lipidden oranları, bu Beni kullanılarak hazırlanabilirmetod ile. Lipozomlar birkaç hafta boyunca 4 ° C'de depolanmalıdır. 3. MsCl İzolasyon ve Sulandırma Bir sıcaklık agaroz plakası üzerinden Şerit içeren 100 ug / ml ampisilin, E. 3 'ucunda (C-ucu) bir 6-His etiketi ile uzatılmış V23T MsCl geni taşıyan bir plazmid ile pB10b coli MJF465 hücreleri. Sabit bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca kültür (12-16 saat) plaka izin verin. Plasmidi için seçilmiş ve standart LB ortamında 100 ug / ml ampisilin ile hücrelerde saklanır. Bir kültürleme vezikül 100 ug / ml ampisilin ile LB ortamı ertesi gün bir yerde 20 ml (50 ml'lik bir şişe ya da ne mevcut kültür tutmak için). Gecede kültüre edildi plaka almak ve steril bir aşılama sopayla hazırlanan 20 ml LB medya (aşılamak) aktarmak için plaka bir koloni seçin. 20 ml kültür, bir çalkalama inkübatöründe 250 rpm'de 37 ° C'de gece boyunca (12-16 saat) büyümeye izin verin. 20 mi overn süzünLB ortamı 2-4 L'lik ight kültürü. Ampisilin artık gereklidir. OD 600 0.5 ulaşıncaya kadar 37 ° C'de 250 rpm'de bir çalkalama inkübatöründe şişeler çalkalayın. 0,6 mM nihai konsantrasyona kadar izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ilave edilir ve Kültür (OD 600 = 0.8-1.0 kadar) bir saat daha bırak. Kültürleri soğuk ve daha sonra santrifüj yoluyla bakteri toplamak için buz üzerinde şişeler koyun. Bakteri pelet için yeterlidir 7438 xg'de 5-8 dakika ve santrifüj (kullanılan rotor tarafından izin verildiği gibi ya da çok) altı 400 ml konik tüpler kullanın. Süpernatant Durusu ve medya tüm hücreleri hasat kadar işlemi tekrarlayın. Gerekli dönüşlerin sayısı büyümüş kültürün miktarı ve kullanılan rotor üzerindeki göre değişir. 2 L'lik bir kültür için, sadece bir kez hücreler aşağı spin için gereklidir. Tek bir santrifüj tüpüne tüm hasat hücreleri aktarın. ~ Fransız pres tamponu (100 mM KP 20 ml hücre pelet yeniden süspansei, 5 mM MgCl2, pH 7.4) eklenmiştir. Süspansiyon (krem veya süt gibi) yoğun olmalıdır. Hemen Süspansiyon 2 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar proteaz inhibitörü fenilmetilsülfonil florid (PMSF) ekleme ve kuvvetli bir şekilde karıştırın Fransız presleme işleminden önce. Fransız basın 10,000 16,000 psi bir 35 ml'lik Fransız basınç hücresinde kültürü,. 7438 xg, 4 ° C'de 10 dk kesintisiz hücreleri ayırmak için süspansiyon aşağı doğru döndürün. Ayrı bir tüp içinde süpernatant koyun ve buna lizozim ve DNaz (0,2 mg / ml her biri) ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca süpernatan takla olsun. NOT: DNaz isteğe bağlıdır; yüksek hızlı santrifüj için viskoziteyi azaltır. Lizozim önemlidir; hücre duvarının kalıntıları sindirir ve hafif denatüre edici olmayan deterjan ile yapılan membran ekstraksiyon verimini artırmaya yardımcı olur. İki ultrasantrifüjdeki tüpler içine süpernatant karışımı dağıtın ve onları dönmeye40 dakika boyunca 4 ° C 'de (rotor bağlı olarak) 106,883-153,911 xg. Santrifüj işleminden sonra süpernatan boşaltıldı ve altta kahverengimsi bir pelet (Total bir membran fraksiyonu), uzun süreli depolama için tüp içinde dondurulabilir (- 80 ° C) ya da ani, protein saflaştırma için kullanılmıştır. Yüksek imidazol tamponu 0,5-1 L hazırlayın: 100 mM NaCI + 500 mM imidazol, konsantre HCI ile pH 7.2-7.4 kadar titre edilir. Imidazol başına iyi bir tamponlama maddesi olduğuna dikkat edin. Uygun şekilde 100 mM NaCl, yukarıda tampon seyreltilerek, 100 mM NaCI + 15 mM imidazol: Düşük imidazol tamponu 0,5-1 L hazırlayın. Hiçbir pH ayarlaması gereklidir. Ayrı şişeler, her tampon 100-150 ml alın ve B-oktil glukopiranosid (KK) (ağ / hac)% 1 ekleyin. De çözeltisi ilave edin ve 0,22 um filtreden filtre. Bu çözümler düşük ve yüksek imidazol kromatografi çözümlerdir. Ekstraksiyon tamponu hazırlayın Düşük imidazol tampon maddesi 50 ml alır ve% 3 eklemek (w / v)OG ve tampon süzün. Protein izolasyonu için 0.5-2 g ıslak ağırlık membran topakları kullanın. Ekstraksiyon tamponu 5-7 ml ekleyin pelletini, ve 30 ml elle tahrik edilen bir cam piston homojenleştiricide homojen hale getirilmesi. 5-10 nazik vuruş ile topaklar olmadan homojen bir süspansiyon yapmak. Dikkatli kullanın, kayma gerilmesi protein denatürasyonu neden olduğu bilinmektedir. (15 dakika 4 ° C'de, orta sınıf santrifüj, sabit açılı rotor, 38,478-68,405 xg) çözünmeyen parçacıklar aşağı doğru döndürün. Bu arada, Ni NTA boncuk (süspansiyon 6 ml) 3 ml almak ve düşük imidazol tamponu 15 ml bunları sallayarak (/ OG o w) vidalı kapaklı tüp ile bir kez yıkayın. Boncuk altındaki (~ 5-7 dakika) yerleşmek ya da 4 ° C'de bir dakika boyunca 129-201 xg onları aşağı spin edelim. Pelet oluşturulduktan sonra, dikkatlice elle süpernatant süzün ve işlemi tekrarlayın. % 3 OG ekstraksiyon tamponu 2-3 ml boncuk dengelenmesi. 3'den homojenleştirilmiştir karışımı (membran pelet ve ekstraksiyon tamponu) karıştırın.3-3.5 ml Ni NTA boncuklar ile 12. 60 dakika boyunca (parti-yükleme) bir vidalı kapaklı bir tüp içinde karışım takla olsun. 201 xg (30 sn) de boncuk aşağı Spin elle süpernatant süzün ve bir kez% 1 OG düşük imidazol tampon ile boncuk yıkayın. Yine 3.13 gibi boncuk Pelet ve taze düşük imidazol tampon 20-30 ml onları tekrar süspansiyon. Ni NTA boncuklar ile (bir üst akış adaptörü ile donatılmış), küçük bir sütun Paketi ve boncuklar ile ekstre akışını (boncuk kurumasına izin vermez) izin stopcock açarak razı olsun. Açık durdurma horoz ile 10 ml düşük imidazol tampon (% 1 OG) bir kısım ile boncuk yıkayın. Makine belirlenen akış hızında saf düşük ve yüksek imidazol tamponlar ile her yaklaşık 25 ml kromatografi makinesi yükleyin (makine başına değişir); bu ilk sistem üzerinden düşük imidazol tampon geçirilerek yapılır. Sıfır OD 260 (başlangıçta) optik kaydedici. Düşük dereceli imidazol i çünkü tampon sudan oldukça farklı olduğunu unutmayınUV absorbe mpurities. Sütun akış adaptörünü takın ve makineye takın. Düşük imidazol tamponu ile tekrar sütuna yıkayın taban çizgisi ulaşır gelir boyunca akış OD kadar (1 ml / dak) (10-20 ml alabilir). Bu sütundan ilişkisiz proteinleri kaldırır. 1 ml / dakika, 30 dakika boyunca, 500 mM imidazol, 20 arasındaki bir doğrusal eğimi uygulanır. OD 600 bir artış gösterdiğinde 4 ml'lik fraksiyonlar toplanarak başlayın. MsCl-6His lineer gradyan% 40 ° 'de elüsyon başlamasına rağmen ilk iki fraksiyon, gevşek bağlı proteinler doludur. Proteininin büyük bir kısmı 3 ila 8 fraksiyonları görünür. Not: OD doğrusal bir artış nedeniyle imidazol artan% gözlenmiştir edilecektir. 3-4, 5-6, 7-8 ve birlikte kesirler Havuz. İsteğe bağlı olarak, tek tek fraksiyonlar konsantre edilir. Fraksiyonları santrifüj filtreleri kullanarak 6-10 kat konsantre ol. 804 xg ve 4 ° C'de 20 dakika spin sonra, dikkatli bir şekilde, derişik protein tekrar süspansiyonProtein filtre sopa eğilimindedir. 50 ul alikotları Çekilen SDS numune tamponu ile karıştırın ve PAGE jel elektroforezi kullanılarak protein saflık için kontrol edin. NOT: MsCl jel altına yaklaşık 17 kDa bulanık bir bant olarak göç edecek. Imalatçının talimatları izlenerek bir protein tahlili kiti kullanılarak protein ölçmek için konsantre edilir fraksiyonlar kullanın. 0.8 g membran pelet tipik bir verimi, birleştirilmiş fraksiyonlardan saf protein 0.2 mg kadardır. Diyaliz sırasında DPhPC lipozomlara V23T MsCl sulandırın. Üç tek yuvarlak taban (12 x 130 mm) cam tüplere bunun bir 10 mg / ml kloroform DPhPC çözeltisi ve kısım 0,5 ml (yağ yani 5 mg) al. Bir azot akımı altında lipid kurutun ve vakum altında (4-6 saat), kloroform kalıntılarını çıkarın. Diyaliz tamponu (100 mM KCI, 5 mM KPi, pH 7.2), girdap ve mi, 2 ml içinde çözülür, her bir tüp içinde, kuru lipid toz OG 15 20 mg eklemeldly sonikasyon. RG-çözünebilir lipitler berrak bir çözelti oluşturmalıdır. , 100: 1: 300 ve 1: 1 elde etmek için her bir tüp, konsantre V23T MsCl çözümler ekleyin 1000 protein için lipitte oranları ve vorteks de. (Hazır numaralı klip üç çift var, MWCO 8000, 7,5 mm çap.) Kesme ve diyaliz boru üç adet (~ 12 cm uzunluğunda) yıkayın Dikkatle klipler ile uçlarını kapatmak ve dört değişikliklerle 4 ° C 'de 48 saat süre ile tampon 2 L (100 mM KCI, 5 mM KPi, pH 7.2) karşı diyaliz, boru içine çözündürülmüş lipid-protein karışımları yerleştirin Her 12 saat tampon. Diyalizden sonra, proteo-lipozomlar, hazırdır. Not: lipozom solüsyonu NaN3 2 mM (sodyum azit) ile takviye edilmiş ve 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Dondurma kaçının. Petrol Rezervuar 4. imalatı 2 inç çaplı duvarından karşılıklı iki delik (çapı 1,0 mm) tüm yol Delici, 1,5 cm uzunluğunda akrilik silindirtaban (Şekil 1A) 1 cm inder. Konsantrik Matkap iki 4 mm delik daha önce 1 mm delik delinmiştir. Delik derinlikleri 1 mm, her (tüm yol delmek için değil emin olun) olmalıdır. Bu delikler lastik contalar sığacak şekilde yapılır. Yağ sızıntısını önlemek için daha büyük deliklere 1 mm iç çaplara sahip bir yer ve yapıştırıcı iki lastik conta. 10 cm x 10 cm herhangi amaçlı epoksi kullanarak, ince akrilik levha (Şekil 1) işlenmiş silindir Tutkal. Deney günü: Elektrotlar 5. Hazırlık Gümüş klorür (AgCI) kaplaması oluşturmak üzere iki saat boyunca çamaşır suyu kendi ipuçları sokmak daha sonra iki 250 mikron çaplı gümüş tellerin 7 cm uzunluğunda kesin ve. Bir gri renk bir AgCl kaplama (Şekil 2E) oluşmuştur belirtir. Cam kesici kullanarak, 10 cm uzunluğunda, / 0,58 1 OD / ID mm borosilikat sınıfı capil bölünmüşİki 5 cm kılcal damarlar içine lary. 34 ayar Microfil iğne PEG-DMA hidrojel ile kılcal doldurun kullanma. Kılcal dışına şişme gelen hidrate hidrojel önlemek için, ucunda 3 mm açıklık tutmak ve kılcal hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hidrojel dolu kılcal damarlar (Şekil 2E) içine Ag / AgCl elektrotlar yerleştirin. UV bir nokta tabancası kullanılarak W 1 ile 2 dakika boyunca UV ışığına maruz kalma üzerine serbest radikal fotopolimerizasyon yoluyla PEG-DMA hidrojel Cure. 6. Deneme Oluşturma NOT: Deney yama amplifikatörü bir toprak bağlantısına topraklı bir Faraday kafesinin altında ayarlanır. Bir erkek konnektör (Şekil 2E) sahip düz bir mikroelektrot sahibine mikropipetler birini takın. Yama amplifikatör (Şekil 2A) headstage mikroelektrot tutucu bağlayın. Hea bağlamak içinyere dstage, headstage için uygun bir konnektörüne 18 gauge yalıtılmış bakır tel lehim. 3 eksenli manuel mikromanipülatör headstage monte edin. Headstage Montaj plakasını takın (bu mikromanipülatör ile birlikte satın veya özel bir makine atölyesi yapılmalıdır) mikromanipülatör ve sonra uygun vidaları kullanarak montaj plakasına headstage bağlayın. Bir laboratuvar yapımı bağlayıcı aracılığıyla lineer aktüatör ikinci mikropipet takın ve daha sonra ikinci bir mikromanipülatör (Şekil 2B) hem monte edin. Mikropipetler hizalanmış, birbirine karşıt ve yatay tesviye edilmelidir. Not: manipülatör marka ve stil önemi yok. Cam bir şişe içinde, V23T MsCl proteoliposome çözeltisi 0.01 ml DPhPC lipozomlar 0,1 ml karıştırılır. NOT: Bu kademe, bir kararlı bir lipid bilaye oluşumu için kritik protein için lipitte oranı (~ 0.0002) azaltmak için gerekenr. 34 ayar Microfil iğne kullanarak, proteoliposome çözüm (Şekil 3A) her iki mikropipetler ipuçları doldurun. Dik bir mikroskop üstünde rezervuar yerleştirin ve karşıt 1 mm'lik deliklerden (Şekil 2B) ile mikropipetler besleyin. NOT: Mikroskop sürece damlacıkları açık bir şekilde görülebilir de kullanılabilir. Hekzadekan (% 99) ile birlikte yüzeye doldurun. Heksadekan daha fazla saflaştırma gerekli değildir. Üçüncü 10 um çaplı borosilikat cam mikropipet kullanın mikropipetler ucunda misket şeklinde olan damlaların oluşturulması için, mikropipetler ucunda seyreltilmiş V23T MsCl proteoliposome çözeltisi (~ 0.00052 mi) dağıtır ve oluşturmak üzere bir 3 mikromanipülatör üzerine monte damlacıkları (Şekil 3). (F istediğiniz gibi (azalan veya hacmini arttırarak) damlacıkların boyutunu denetlemek ve onları tek tabakaları tamamen oluşturmak için 10 dakika boyunca dinlendirinŞEKIL 3). Temas damlacıkları getirin, iki tabakalı oluşumu 1 ila 2 dakika içinde ortaya çıkar. 7. Yazılım ve Ekipmanları Kurma Bilgisayarlar, mikroskop, piezoelektrik osilatör kontrolör, fonksiyon jeneratörleri, yama amplifikatör ve düşük gürültü veri toplama sistemi açarak yazılımı hazırlayın. NOT: Herhangi bir yama amplifikatör kullanılabilir ve şu talimatlar malzeme ve teçhizat listesinde listelenen biz kullanılan ve biri için özel olarak bulunmaktadır. Yama amplifikatör ön panelinde, VHOLD / IHOLD ve V-CLAMP için "Mod" topuzlar ayarlayın. Ön panelde "Lowpass" Bessel 2 1 kHz ve Çıktı Kazanç için Filtre ayarlayın. BÜTÜN HÜCRE p = 1 "Yapılandırma" olarak ayarlayın. Topuzlar kalan sıfıra veya nötral pozisyonda ayarlanmış olduğundan emin olun. 5 kHz tüm KYB akım ölçümleri Örnek1 kHz Bessel anti-aliasing filtresi ile. Masaüstündeki simgesine çift tıklayarak yazılımı çalıştırın. "Digitizer" iletişim kutusunu açmak için "Configure> Digitizer" tıklatın ve sonra "Değiştir" butonuna tıklayın. "Değişim Digitizer" diyaloğunda "Digitizer Type" listesinden "Digidata 1440 Serisi" seçeneğini seçin. Sayısallaştırıcıyı algılamak için Tara düğmesini tıklatın. "Değişim Digitizer" iletişim kutusundan çıkın ve ardından "Dijitalleştirici" iletişim kutusundan çıkmak için "Tamam" a tıklayın "Tamam" a tıklayın. "Yapılandırma> Lab Bench" tıklayın. Laboratuar Bench Giriş Sinyalleri sekmesinde, Digitizer Kanalları altında Å içinde Analog seçin. 0.002 ölçek faktörünü ayarlayın. Çift katlı lipid 8. oluşumu BNC kablosu kullanarak, aw çıkışını bağlamakdış komut girişi ön aveform jeneratör (veri toplama sisteminin arka panelde) açık. Headstage bir 10 Hz, 500 mV pk-to-pk üçgen dalga formu gönder. Mikromanipülatör kullanarak, hafifçe dokunmak ve (genellikle yaklaşık 1 dakika ila 2) (Şekil 3C ve 3D) gerçekleşmesi inceltme bilayeri beklemek kadar temas damlacıkları getirmek için yatay cam mikropipetler taşıyın. Not: iki katmanlı oluşum sürecinde ilerlemesi mikroskopla görsel olarak görülebilir ve akım ölçümü (Şekil 4) tarafından takip edilebilir. Iki tabakalı boyutunu ayarlayın (~ çapı 250 mikron) mikromanipülatör kullanarak, aktüatör üzerine monte damlacık konumunu kontrol ederek. Not: iki tabakalı boyutu görsel mikroskop aracılığıyla tahmin edilebilir. Bu yöntem, daha kolay bir araştırmacı tarafından kolaylıkla iki katmanlı boyutunu kontrol etmek için yaparmikromanipülatörler kullanarak damlalar hareketli. 9. Dinamik Uyarma ve MsCl Gating Iki tabakalı kurdu ve (bilayeri yani kırılma veya iletken olmayan) istikrarlı sonra, bir fonksiyon jeneratörü kullanılarak sinüsoidal sinyal göndererek damlacıklar uyarırlar. Iki tabakalı dahil MsCl proteinini teşvik etmek, piezoelektrik servo kontrol ünitesine bir 175 mikron peak-tepe genliği, 0.2 Hz frekansında ve% 50 duty cycle ile sinüs dalga formu gönderin. (Dalga Çeşitli türleri farklı genliklerde, frekansları ve görev çevrimi ile gönderilebilir) 10. işlenmesi ve Yorumlama Sonuçlar .ABF Biçiminde, veri toplama sistemi kullanılarak kaydedilen akım ölçümleri, kaydedin. Bir fonksiyon dosya "abfload" seçeneğini kullanarak Matlab İthalat verileri (.ABF formatında), daha sonra analiz ve verileri işlemek. "Abfload" dosyası çevrim için kullanılabilir. Tahmini tUygun bir kamera kullanılarak kaydedilir tam tahrik döngüleri sırasında damlacık videoları kullanarak iki katmanlı ve damlacıkların alansal genişleme o gerginlik. Su / yağ arayüzünün alanının yanı sıra damlacıklar arasındaki açıyı tahmin görüntü işleme teknikleri kullanılarak tek tek kareleri işleyerek Matlab Süreç videoları. NOT: Video alınan 2B kareyi kullanarak, su-yağ arabirimi (damlacık yani kenar) tespit ve sonra devrim tarafından yüzey alanını tahmin ediyoruz.

Representative Results

1 Şekil ve çift katlı lipid membran mekanik uyarılması sırasında protein aktivitesini kaydetmek için 2 ekran deney düzeneği ve ekipman kullanılan. Bizim ölçümlerde içine elektriksel gürültü en aza indirmek için, iş istasyonu, bir laboratuvar yapımı Faraday kafesi içine yerleştirilir, Axopatch 200 B Amplifikatör bir toprak bağlantısına topraklı. Istikrarlı bir yalıtım çift katlı lipid oluşumu bu çalışmada önemli bir adımdır. Bu düzenlemede, bir lipit tek katmanlı bir organik çözücü bir banyo içerisine batırılmıştır, sıvı damlacıklarının yağ / su ara yüzeyinde toplanır. Damlacıklar temas halinde yerleştirilir, fazla yağ elendiği, ve bir iki molekül, kalın lipid ikili tabakasına göre karşıt bir lipid mono tabakalar, ince bir. Iki tabakalı karakterizasyonu kullanılan en yaygın tekniktir gerilim kelepçe olduğunu. Mevcut ölçülür ve voltaj-kelepçe ile, çift-tabakanın gerilimi sabit bir değerde muhafaza edilmektedir. Şekil 4 </strong> İlk iki katmanlı oluşumunun tipik bir gerçek zamanlı akım kayıt canlandırıyor. Belirli kapasitans (~ 0.6 jxF / cm 2) DPhPC çift katlı lipid 5 bilen kurdu iki tabakalı alanı hesaplanabilir. Iki tabakalı alan damlacıkları (Şekil 4A) pozisyonunu değiştirerek kontrol edilebilir. Piezoelektrik erişim düzeneğini kullanarak, farklı frekanslarda, amplitüdleri ve görev çevrimlerinde dalga formu (sinüs, kare, üçgen, vb.) Farklı türleri, döner damlacıklar tatbik edilir ve eksenel olarak salınım ve böylece iki tabakalı gerilimi ve alan değişmiş olabilir olabilir (Şekil 4B). DIB mekanik olarak uyarıldığında zaman zarından sabit DC potansiyeli korurken, MsCl düşük eşik (kazanç fonksiyon-) V23T mutant ağırlıklı alt iletken devletleri ve bazen tam açılış etkinlikleri de dahil olmak üzere güvenilir faaliyetleri oluşturur (Şekil 5) . Bu evhastalar saflaştırılmış V23T MsCl ile yeniden sağlam iç E.coli membran ve lipozomlardan patch-clamp tekniği kullanılarak kaydedilen özdeştir. Şekil 5'te sonuçlar mevcut tüm sivri tepe sıkıştırma gözlenmiştir, çünkü bu geçitleme, geriliminde bir artış tepki olarak ortaya çıkar kanıtlamaktadır. Pik sıkıştırma da damlacıkların göre alansal genişlemesi maksimumdur ve bu nedenle, ara yüzeyde gerilimi gözlenir. Bir DC gerilimi zar 36 boyunca uygulandığında Alamethicin bir voltaj kapılı iyon kanalı ve en çok çalışılan peptidlerin biri zar geçirgenliğini artırır. Transmembran proteinlerin ve peptidlerin barındırmak için lipid iki katmanlı arayüzünün becerisi aynı zamanda peptid alamethicin ile voltaj-akım kayıtları yolluk performans ile test edilir. Alamethicin 100 ng / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar fosfolipid çözeltisi ile karıştırılır. 6 kapsamında akım ölçümleri göstermektedir gerilim kelepçe (115 mV). Bu deneyde, küçük damlacıklar iki katmanlı arayüzü ve böylece daha yüksek bir direnç ve daha küçük kapasitans elde etmek için ayrı çekilir. Alamethicin peptid yolluk davranışı akımı (Şekil 6) ayrık adımlarda gösterilir. Arsa sağ tarafındaki histogram temelde kanalın kendisinin birinci iletkenlik seviyesi taban seviyesine (0,0962 nS) 'dan iletkenlikteki değişiklik gösterir. Şekil 1:. Ana bölümden ve yağ haznesi boyutları anlatan şematik yağ haznesi Virginia Tech makine dükkanında imal edilir. Bu akrilik levhanın yüzeyine yapıştırılmış bir işlenmiş silindirik akrilik tüptür. Boyutları ve tasarımı, farklı uygulamalar ve ikiden fazla mikropipetler uyum için değiştirilebilir./53362/53362fig1large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2:. Deneysel kurulum ve mikropipetler hazırlanması (A) mekanik şekillendirme uyarıcı ve arayüz bilayers tanımlamak için standart iş istasyonu bir mikroskop, 3-eksenli manipülatörler, bir dijital kamera, piezoelektrik osilatör, titreşim izolasyonu tablo ve Faraday kafesi içerir (gösterilmemiş). (B) Deney düzeneği yatay heksadekan bir yağ banyosu içine yerleştirilmiş iki karşılıklı PEG-DMA hidrojel dolu mikropipetler oluşur. Mikropipetler her elektrik bağlantısı sağlamak için bir Ag / AgCI elektrot içerir. Proteoliposome çözeltisi ile doldurulmuş bir üçüncü mikropipet diğer mikropipetler ucundaki damlacıkların meydana getirilmesi için kullanılır. (C) DIB geçerli yanıt ölçülebiliryama amplifikatörü ve düşük gürültü veri toplama sisteminin bir arada kullanarak. (D) A mikropipetlerin ucunda oluşan sulu damlacıklarını gösteren resmi kapattı. (E) Ag / AgCİ elektrotlar ağartıcı iki 250 | im'lik gümüş tel ucu daldırma ile yapılır. Elektrodlar katılaşmaya UV ışığı ile sertleştirilir PEG-DMA hidrojel, dolu iki borosilikat cam kılcal damarlar yoluyla beslenir. Erkek konnektörü ile düz bir mikroelektrod tutucu yama amplifikatör headstage için mikropipetlerin biri bağlamak için kullanılır. Şekil 3:. Damlacık arayüz iki katmanlı oluşumunu gösteren resim (A) proteoliposomes dolu bir 10 um mikropipet mikropipet uçları yakınına mikroskop altında konumlandırılır. Mikropipet bağlı bir şırınga kullanarak, küçük hacimli dağıtımproteoliposomes istenen hacme misket şeklinde olan damlaların oluşturulması için. Damlacıklar on dakika oturmak için izin vererek tek tabakalı formu edelim. Temas damlacıkları getirin; arayüzde tüm petrol elimine edilir sonra iki tabakalı oluşturacaktır. Iki tabakalı oluşturulduğu birlikte, arayüz her iki kimyasal bileşimi, bir mikro-boyutlu mikropipet kullanılarak arzu edilen kimyasal enjekte edilmesiyle kontrol edilebilir (B). (C) ilk temas anında damlacıkları. (D) lipid iki katmanlı oluşturulur damlacıkları. Şekil 4: Gerçek zamanlı ölçümleri ilk incelme ve arayüz sonraki genişleme hem de gösteren bir üçgen elektrik potansiyelin uygulanması yoluyla iki tabakalı oluşumu sırasında ölçülen (A) Akım.. Ölçülen akımın büyüklüğü Capaci ile doğru orantılıdırmesafe, ve iki katmanlı arayüzü böylece alanı. Arayüzü ve tersi alanı daha büyük damlacıklar bir araya getirilir yakın. Mekanik uyarma uygulanması üzerine (B), iki tabakalı bir arayüz artar alanı ve uyarıcı sinyali ile aynı frekansta azalır. Şekil 5:. Gerçek zaman ölçümleri, mekanik uyarma ile iki katmanlı bir yanıt olarak MsCl bir V23T mutantı yolluk göstermektedir mevcut yanıt şekli sonucunda iki tabakalı kapasitans bir sinüzoidal bir değişiklik ile de ilgilidir sinüzoidaldır iki tabakalı alan değişikliği. Geçerli sivri, her döngünün zirvesinde ortaya çıkan, V23T mutant alt iletkenlik yolluk gösterir. Diğer bir kutupsal yolluk iki tabakalı arayüzünde geriliminde bir artışı yansıtır pik sıkıştırma meydana gösterir. <p class="jove_content"> Şekil 6:. Voltaj kelepçe ve anonim Alamethicin kanallarının yolluk aktivitesi için iletkenlik seviyeleri gelen histogram altında Akım ölçümleri Alamethicin peptid yolluk davranışı akımında ayrı aşamalı bir artış ile gösterilir. Iletkenlik seviyeleri Virginia Tech 7 bizim araştırma grubu tarafından yapılan daha önceki ölçümlerle çok iyi maç.

Discussion

Mechanosensation yaşayan organizmaların gelişti ilk duyusal iletim yollarının biri anlamına gelir. Okuyan ve DIB mekano-elektriksel özelliklerini anlamak için bu olguyu kullanarak, fonksiyonel uyaranlara duyarlı malzemeler doğru önemli bir adımdır. Bu mekanoelektriksel dönüştürücü ve çift katlı lipid arayüzünde gerginlik artışı tespit etmek için bir zorlanma göstergesi olarak DIB bir mechanosensitive kanalı, MsCl, birleşmesini ve aktivasyonunu içerir. Bir başka not, MS kanallarının fonksiyon kalınlığı, içsel eğrilik ve kompresibilite dahil lipit bilayers temel malzeme özelliklerine düzenlenir olabilir. Yukarıda bahsedilen ışığında, mikropipet bazlı bir tekniktir araştırmacı Dıb'leri MS kanallar çalışma ve çift katlı lipid yapısına, aynı zamanda, lipid-protein etkileşimleri kavranmasını sağlar yeteneği sağlayan değerli bir araç sağlar.

Son üç on yıl içindes, patch-kelepçe o gerilim ve gerginlik hem kenetlenmesini sağlar beri, MS kanallarını incelemek için birincil yöntem oldu. Ancak, patch-kelepçe hantal ekipman ve minyatür, duyusal ve dönüşüm cihazlarının mühendislik için gerekli bir özellik için uygun değildir gerektirir. Onların basitlik, kararlılık ve kompakt nedeniyle Dıb'leri MsCl aktivitesini incelemek için uygun bir ortam oluşturmaktadır. Burada, damlacıklar ve iki katmanlı arayüzü boyutunu her damla kimyasal kompozisyonunu ve dinamik uyarılması yoluyla arayüzünde gerginliği kontrol etme yeteneği ile, bir mikropipet tabanlı tekniği önererek DIB oluşum teknikleri önceki gelişmeler uzatmak. Tekniği eş eksenli cam kapilerleri karşıt uçlarına, proteoliposomes içeren sulu damlacıkları ankraj oluşur. Temas ara yüzeyde bir lipid iki katmanlı formları getirdi damlacıkları organik çözücünün bir banyoda üstüne yerleştirilmiştir.

Mikropipetler p bağlandıklarıdamlacıkların, yatay yer değiştirmesine izin iezoelectric osilatörler. Dinamik Su-yağ ara yüzeyinde ara yüzey geriliminde bir artış ve bu nedenle iki tabakalı geriliminde bir artış damlacıklar sonuçları sıkıştırılması. İki önemli yönleri benzer ve yakın zamanda yayınlanan iletişim kabarcık iki tabakalı (CBB) tekniği 37 bu yöntemi ayırt. Burada sunulan tekniği kullanarak, iki katmanlı boyutu mikromanipülatörler kullanılarak kontrol edilir ve böylece damlacıklar hacimleri CBB yönteminde aksine, sabit kalır. Buna ek olarak, CBB tekniği daha basit ve inşa etmek kolaylaşır, bu yazıda sunulan yöntemde gerekli değildir basınç pompaları için çağırır.

Biz birleştirmek ve bir yama pipet veya kimyasal modifikasyonlar 38 kullanılmadan ilk kez bakteriyel MsCl uyarabilen. Sistem sağlam asimetrik çift katlı lipid membranların oluşumunu kolaylaştırmaktadır beri, daha yakından l taklitBiyolojik membranların bulunan IPID asimetri. Bu MsCl aktivitesi kontrollü membran bileşimi ya da asimetri etkilerini incelemek için bize izin verir. Ayrıca, görüntü işleme teknikleri ile, bu yöntem iki tabakalı arayüzünde gerilimi tahmin etmenize yardımcı olur. DIB toplu ve yüzey kuvvetleri arasındaki interconversion prensiplerini anlamada Bu teknik asist, temel zar özelliklerinin ölçümleri kolaylaştırır ve gerginlik membran MsCl yanıtının anlayışı geliştirir.

Bu yöntem MsCl incelemek için bir adım daha yakın biyomoleküler uyaranlara duyarlı malzeme sistemi doğru ve farklı fizyolojik ortama bizi alır da, sisteme sınırlamalar vardır. Bu sistemde Gerilim nedeniyle yağ / su ara yüzeyinde gerilimini azaltmak için, eğilimi her damla, lipozomların şeklinde lipid rezervuarın varlığı sıkıştırılır edilemez. Bu nedenle, bu mechanosensitive kanallarda stimüle edilebilirsadece dinamik bir rejimde Dıb'leri bölgesindeki. Sistemdeki hava kabarcıklarının varlığı önemli ölçüde deney hassasiyet ve tekrarlanabilirlik etkiler. Hidrojeller mevcut hava kabarcıkları Elektrik bağlantısı varsa kaybına neden olabilir.

Biz MsCl uyarılması için mikro-pipet bazlı yöntemin kullanımını tarif ederken, bu teknik MS kanalların diğer tip incelemek için kullanılan ve biyomoleküllerin çeşitli çalışma için araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere bir potansiyele sahip olabilir. Örneğin, benzer kurulum kanalsız damlacık arayüzü iki tabakalı zarın mekanoelektriksel tepkisini incelemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. Çeşitli proteinler yeniden ve her biyomolekülün sulandırma ortamları farklılık göz önüne alarak, bu son derece kontrollü kurulumu kullanarak aktive edilebilir. Bu makalede açıklanan yöntemi yalnızca araştırmacı hayal gücünüzle sınırlı bir ölçüde geniş bir uygulama potansiyeline dokunur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yayında bildirilen Araştırma Bilimsel Araştırma Temel Girişimi Hibe FA9550-12-1-0464 Hava Kuvvetleri Ofisi tarafından desteklenmektedir.

Materials

0.22 µm filter Corning 430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P Purchased as lyophilized powder
34-gauge microfil World Precision Instruments MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels ThermoFisher 3141 Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz Keysight Technologies 33220A
Ampicillian ThermoFisher BP1760 ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610000
Axio Scope.A1 Carl Zeiss –
AxioCam HSm Carl Zeiss –
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices –
BCA protein assay kit Pierce  23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Dialysis tubing 7 Spectra/Por 132113 MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system Molecular Devices –
DNAse Sigma-Aldrich DN25
DPhPC Avanti 850356C
E-625 PZT Servo-Controller  Physik Instrumente E-526
FPLC System Pharmacia Biotech –
HCl J.T. Baker 9535-33
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Homoginizer Wheaton 357426 15 mL
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Affymetrix 17886
IRGACURE® 2959 IRGACURE® 555047962
Isopore Membrane Filters  EMD Millipore VCTP02500
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
KCl Sigma-Aldrich P3911 ACS Grade
KH2PO4 Mallinckrodt 7100 ACS Grade
Kimble-Chase Kontes 420401-1515 Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System Electro-Lite, corp. 81170
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators Thorlabs PCS-520N
MgCl2 ThermoFisher M33 ACS Grade
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration Sigma-Aldrich M1254-100G
N2 Gas Airgas UN1066
NaCl EMD SX0420-1 ACS Grade
Ni NTA agarose beads Qiagen 1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID McMaster-Carr 8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator Physik Instrumente P-601
PAGE gel Bio-Rad 456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film Parafilm® PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate Polysciences, Inc. 15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk Sterlitech Corporation PCTB0425100
Potassium Chloride  Sigma-Aldrich P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm World Precision Instruments GO1-100
SDS Sigma-Aldrich L5750
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Azide Affymetrix 21610
Test tubes ThermoFisher 14-961-27 12 x 130 mm
Tryptone ThermoFisher BP1421
Ultracal 30K Millipore UFC803024 Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089
Water Purifier Barnstead D11931
Yeast ThermoFisher BP1422
β-octylglucopyranoside Anatrace O311S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).
  2. Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution. Nature. , (1966).
  3. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis. ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).
  5. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).
  6. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nat Nano. 4, 437-440 (2009).
  7. Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates. ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).
  8. Sarles, S. A., Leo, D. J. Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates. ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).
  9. Sarles, S. A. . Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).
  10. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).
  11. Sarles, S. A. The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers. SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).
  12. Sarles, S. A., Leo, D. J. Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials. SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).
  13. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).
  14. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).
  15. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. BIOPHYS J. 12, 432 (1972).
  16. Tien, H. T., Ottova, A. L. The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes. J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).
  17. Perozo, E. Gating prokaryotic mechanosensitive channels. NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).
  18. Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. Mechanosensitive channels in microbes. ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).
  19. Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria. PLoS ONE. 7, e33077 (2012).
  20. Levina, N., et al. Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity. The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).
  21. Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses. BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).
  22. Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL. J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).
  23. Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL. J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).
  24. Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations. PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).
  25. Kubalski, A., Martinac, B. . Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).
  26. Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282, 2220-2226 (1998).
  27. Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).
  28. Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. Structural models of the MscL gating mechanism. BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).
  29. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  30. Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension. NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).
  31. Corry, B., Jayatilaka, D. Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL. BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).
  32. Wang, Y., et al. Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL. eLife. 3, e01834 (2014).
  33. Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating. J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).
  34. Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. A light-actuated nanovalve derived from a channel protein. Science. 309, 755-758 (2005).
  35. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System. MRS Proceedings. 1621, (2014).
  36. Fox, R. O., Richards, F. M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution. Nature. 300, 325-330 (1982).
  37. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Sci Rep. 5, (2015).
  38. Barriga, H. M., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).

Tags

MicropipetteDroplet Interface BilayersMechanosensitive Ion ChannelsMscLMembrane TensionPiezoelectric ActuatorMembrane PropertiesAsymmetric MembranesBiomolecular Devices

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Najem, J. S., Dunlap, M. D., Yasmann, A., Freeman, E. C., Grant, J. W., Sukharev, S., Leo, D. J. Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. J. Vis. Exp. (105), e53362, doi:10.3791/53362 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image