Multifuncional, Micropipeta basada en el Método de Incorporación y la estimulación de Canales bacteriana mechanosensitive Ion en Gotita de interfaz Bilayers

1. Preparación de PEG-DMA hidrogeles Seleccione una medición apropiada / mezcla contenedor (frasco, cubilete, etc.) Para la aplicación. Limpiar a fondo el uso de detergente y agua, y luego limpie con limpiadores de tejidos sin pelusa. Use guantes para evitar la contaminación de la cristalería con aceites de los dedos. Enjuague el recipiente con suficiente agua desionizada para eliminar los restos de detergente. Limpie el recipiente con papel sin pelusa para deshacerse del agua, y luego rociar con alcohol isopropílico (IPA, 99,5%) y limpie hasta que esté limpio. Colóquelo en una cámara de vacío para permitir todo el IPA se evapore por completo. Limpiar el resto del equipo de laboratorio utilizado en el proceso de formación de hidrogel con agua destilada. Para preparar un 40% (w / v) solución de PEG-DMA de hidrogel, pesa 4 g de la poli (etilen-glicol) dimetacrilato (PEG-DMA; MW = 1000 g / mol) polímero utilizando una escala de laboratorio. Coloque el pesado PEG-DMA en el frasco y el calor usando un baño de ultrasonidos a las 45-55 ° C hasta que el sólido PEG-DMA ha licuado. Durante el proceso, cubra la abertura del frasco con papel / cera Parafilm para mantener el agua fuera. Una vez que el PEG-DMA ha licuado, añadir solución tampón (KCl 500 mM, MOPS 10 mM, pH 7,0) hasta que el volumen total alcanza unos 10 ml (suficiente para varios experimentos en un período de seis meses). Añadir el agente de curado a 0,5% (w / v). En este caso, añadir 0,05 g del agente de curado a la mezcla de 10 ml. Colocar el matraz de nuevo en el baño de ultrasonidos y permitir que los componentes se disuelven en solución (alrededor de 10 min, 250 vatios). NOTA: Una vez que el agente de curado ha sido añadido a la solución, los hidrogeles curarán (solidificar) si se expone a cualquier fuente de luz durante una cantidad de tiempo suficiente. Para ayudar a combatir esto, envuelva el vial / recipiente con cinta negro y guárdelo en un lugar oscuro. Esta solución se puede almacenar durante varias semanas a temperatura ambiente (22 ° C). 2. Preparación de Liposomes Preparar 10 ml de una solución de lípidos 2 mg / ml mediante la adición de 10 ml de tampón (KCl 500 mM, MOPS 10 mM, pH 7,0) a 20 mg de 1,2-sn -glicero diphytanoyl–3-fosfocolina (DPhPC) sintética lípidos comprar como polvo liofilizado. Hacer vesículas que ambos lípidos y solución tampón se mezclan a fondo (la mezcla debe ser homogénea y turbia cuando se disuelve todo). Freeze (-20 ° C) y descongelar completamente la nueva mezcla de lípidos para un total de seis veces. Deje que el deshielo mezcla a temperatura ambiente, nunca en un ambiente caliente. El uso de un extrusor comercialmente disponible, extruir los lípidos al obligar a toda la suspensión de lípidos primero a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 micras y luego seis veces a través de un filtro de 0,1 micras membrana. Este proceso produce partículas con diámetros de cerca de 100 nm (igual al tamaño de poro del filtro). NOTA: Otros lípidos y proporciones de lípidos se puede preparar usando este meDTO. Los liposomas deben ser almacenados a 4 ° C durante varias semanas. 3. MscL Aislamiento y Reconstitución Streak cabo una placa de agarosa de temperatura, que contiene 100 mg / ml de ampicilina, E. células MJF465 coli con un plásmido que lleva el gen pB10b V23T MscL ampliado con un 6-His tag en el extremo 3 '(C-terminal). Permitir la placa para una noche de cultivo (12-16 horas) a 37 ° C en una incubadora estacionaria. El plásmido se selecciona para y retenido en las células con 100 g / ml de ampicilina en medio LB estándar. El siguiente lugar los días 20 ml de medio LB con 100 mg / ml de ampicilina en una vesícula cultivo (un matraz de 50 ml o lo que está disponible para sostener la cultura). Tome la placa que se cultivó durante la noche y seleccione una colonia de la placa para transferir (inocular) al preparado 20 ml de medio LB con un palo de inoculación estéril. Permitir que la cultura 20 ml de crecer durante la noche (12-16 h) a 37 ° C a 250 rpm en un incubador con agitación. Decantar el 20 ml Overnla cultura de vuelo en 2-4 l de medio LB. La ampicilina ya no es necesaria. Agitar los matraces en una incubadora de agitación a 250 rpm a 37 ° C hasta que OD 600 alcanza 0,5. Añadir isopropílico β-D-tiogalactopiranósido 1-(IPTG) a una concentración final de 0,6 mM y dejar que la cultura de ir a por otra hora (a OD 600 = 0,8-1,0). Ponga los frascos en el hielo para enfriar las culturas y luego recoger las bacterias por centrifugación. Usar seis tubos cónicos de 400 ml (o tantos como permitido por el rotor usado) y centrifugar durante 5-8 min a 7.438 xg que es suficiente para sedimentar las bacterias. Decantar el sobrenadante, y repita el procedimiento hasta que se cosechan todas las células de los medios de comunicación. El número de giros necesarios varía en función de la cantidad de la cultura que se ha crecido y el rotor utilizado. Para un cultivo de 2 L que sólo se necesita hacer girar hacia abajo las células una vez. Transfiera todas las células recogidas en un solo tubo de centrífuga. Resuspender los sedimentos celulares en 20 ~ ml de tampón de prensa francesa (mM KP 100i y 5 mM de MgCl 2, pH 7,4). La suspensión debe ser denso (como crema o leche). Inmediatamente antes de francés de prensado en la suspensión agregar la fluoruro de fenilmetilsulfonilo inhibidor de la proteasa (PMSF) a una concentración final de 2 mM y mezclar vigorosamente. Francés-presione la cultura, en una celda Francés-presión de 35 ml, a 10.000 a 16.000 psi. Centrifugar la suspensión para separar las células intactas a 7438 xg, 10 min a 4 ° C. Ponga el sobrenadante en un tubo separado, y añadir a la misma lisozima y ADNasa (0,2 mg / ml cada uno). Deje caída sobrenadante durante 10 min a temperatura ambiente. NOTA: DNasa es opcional; que reduce la viscosidad para la centrifugación a alta velocidad. La lisozima es crítica; que digiere los restos de pared celular y ayuda a aumentar el rendimiento de la extracción de la membrana hecha con un detergente suave no desnaturalizante. Distribuir la mezcla de sobrenadante en dos tubos de ultracentrífuga y spin ellos en106,883-153,911 xg (dependiendo del rotor) a 4 ° C durante 40 min. Después de la centrifugación se decanta el sobrenadante y el sedimento de color marrón en la parte inferior (la fracción total de membrana) se puede congelar en el tubo para el almacenamiento a largo plazo (- 80 ° C) o se utiliza para la purificación de proteínas inmediata. Preparar 0,5 a 1 L de tampón de alta imidazol: NaCl 100 mM + imidazol 500 mM, se valora a pH 7.2 hasta 7.4 con HCl concentrado. Tenga en cuenta que el imidazol es un buen sustancia tamponante por sí mismo. Preparar 0,5 a 1 L de tampón de baja imidazol: NaCl 100 mM, imidazol 15 mM +, diluyendo apropiadamente el anterior tampón con NaCl 100 mM. No es necesario ajustar el pH. Tome de 100-150 ml de cada tampón en botellas separadas, y añadir 1% (w / v) glucopiranósido b-octilo (OG). Agitar bien la solución y filtrar a través de un filtro de 0,22 micras. Estas soluciones son las soluciones de cromatografía de baja y alta de imidazol. Preparar tampón de extracción, tomar 50 ml de tampón de baja imidazol, y añadir 3% (w / v)OG y filtrar el búfer. Utilice sedimentos de membrana de 0,5 a 2 g de peso húmedo para el aislamiento de proteínas. Añadir 5 a 7 ml de tampón de extracción, resuspender el precipitado, y homogeneizar en un homogeneizador de vidrio-pistón 30 ml impulsada por la mano. Con 5-10 movimientos suaves hacer una suspensión homogénea y sin grumos. Tenga cuidado, es conocida esfuerzo cortante para causar la desnaturalización de proteínas. Centrifugar las partículas insolubles (centrífuga de gama media, rotor de ángulo fijo, 38,478-68,405 xg, a 4 ° C durante 15 minutos). Mientras tanto, tomar 3 ml de perlas Ni NTA (6 ml de suspensión) y lavarlos una vez con el bajo-imidazol tampón (w / o OG) agitando en unos 15 ml con tapón de rosca de tubo. Deje que los granos se depositan en el fondo (~ 5-7 minutos) o girar hacia abajo a 129 hasta 201 xg durante un minuto a 4 ° C. Una vez formado el pellet, se decanta el sobrenadante cuidadosamente a mano y repita el procedimiento. Equilibrar las perlas con 2-3 ml de tampón de extracción OG 3%. Mezclar la mezcla homogeneizada (sedimento de membrana y tampón de extracción) a partir de 3.12 con 3-3.5 ml perlas Ni NTA. Deje que el tambor de mezcla en un tubo con tapón de rosca de 60 min (lote de carga). Girar las perlas hacia abajo a 201 xg (30 seg), decantar el sobrenadante a mano, y lavar las perlas con 1% OG tampón de baja-imidazol de una vez. Sedimentar las perlas como en 3.13 de nuevo y volver a suspender en 20-30 ml de tampón de baja imidazol fresco. Empaque una pequeña columna (equipado con un adaptador de flujo superior) con las cuentas Ni NTA, y dejar que los granos se asientan al abrir la llave de paso para permitir que el flujo a través de extracto (no permita que los granos se sequen). Lave las perlas con una alícuota de 10 ml bajo imidazol de amortiguación (1% OG) con la llave de paso abierta. Cargar la máquina cromatografía con bajos puro y de alta imidazol buffers sobre 25 ml de cada uno a la tasa de flujo de máquina definida (varía por máquina); esto se realiza haciendo pasar el tampón de bajo-imidazol a través del sistema primero. Cero la grabadora óptica a OD 260 (línea de base). Tenga en cuenta que la memoria intermedia es bastante diferente de agua porque imidazol de bajo grado tiene impurities que absorben UV. Inserte el adaptador de corriente a la columna y adjuntarlo a la máquina. Lavar la columna con tampón de nuevo bajo imidazol (a 1 ml / min) hasta que la DO del flujo a través viene alcanza la línea de base (que puede tomar 10 a 20 ml). Esto elimina las proteínas no unidas de la columna. Aplicar un gradiente lineal de imidazol de 20 y 500 mM, durante 30 min, a 1 ml / min. Comience a recoger fracciones de 4 ml cuando OD 600 muestra un incremento. Las dos primeras fracciones están llenos de proteínas unidas débilmente, mientras que MscL-6His comienza elución a ~ 40% de la gradiente lineal. La mayoría de la proteína aparece en las fracciones 3 a 8. NOTA: un aumento lineal de OD se observó debido a la creciente% de imidazol. Aunar las fracciones 3-4, 5-6 y 7-8 en conjunto. Opcionalmente, concentrar las fracciones individualmente. Se concentran las fracciones 6-10 veces utilizando filtros centrífugos. Después de un giro 20 min a 804 xg y a 4 ° C, resuspender cuidadosamente la proteína concentrada,la proteína tiende a pegarse al filtro. Retirar 50 alícuotas, se mezclan con tampón de muestra SDS, y comprobar la pureza de proteínas mediante electroforesis en gel PÁGINA. NOTA: MscL migrará como una banda difusa de aproximadamente 17 kDa a la parte inferior del gel. Use las fracciones concentradas para cuantificar la proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas, siguiendo las instrucciones del fabricante. Un rendimiento típico a partir de un sedimento de membrana 0,8 g es de hasta 0,2 mg de proteína pura en las fracciones combinadas. Reconstituir V23T MscL en liposomas DPhPC través de diálisis. Tome una solución 10 mg / ml de cloroformo y DPhPC alícuota de 0,5 ml (es decir, 5 mg de lípidos) de él en tres desechable de fondo redondo (12 x 130 mm) tubos de vidrio. Seque el lípido bajo la corriente de nitrógeno y eliminar los restos de cloroformo a vacío (4-6 horas). Añadir 15 20 mg de polvo OG al lípido seco en cada tubo, se disuelven en 2 ml de tampón de diálisis (100 mM de KCl, 5 mM KPi, pH 7,2), vórtice, y misonicado ldly. Los lípidos OG-solubilizado deben formar una solución clara. Añadir soluciones concentradas V23T MscL a cada tubo para lograr 1: 100, 1: 300 y 1: 1.000 proteína-lípido ratios y así vórtice. Cortar y lavar tres piezas (~ 12 cm de largo) de tubos de diálisis (MWCO 8000, 7,5 mm de diámetro, tres pares de clips numerados listos.) Coloque las mezclas lípido-proteína solubilizados en el interior del tubo, cerrar cuidadosamente los extremos con clips y diálisis frente a 2 l de tampón (KCl 100 mM, 5 mM KPi, pH 7,2) durante 48 horas a 4 ° C con cuatro cambios de la tampón cada 12 hr. Después de la diálisis, los proteo-liposomas están listos. NOTA: La solución de liposomas se puede complementar con 2 mM de NaN3 (azida de sodio) y se almacenó a 4 ° C. Evite la congelación. 4. Elaboración del depósito de aceite Taladre dos agujeros opuestos (1,0 mm de diámetro) todo el camino a través de la pared de un diámetro de 2 pulgadas, 1,5 cm cil larga acrílicoInder a 1 cm de la parte inferior (Figura 1A). Taladre dos agujeros de 4 mm concéntricos a la previamente perforados agujeros de 1 mm. Las profundidades de los agujeros deben ser de 1 mm cada uno (asegúrese de no perforar hasta el final). Estos agujeros se hacen para adaptarse a las juntas de goma. Lugar y pegamento de dos juntas de goma que tienen diámetros de 1 mm interiores en los agujeros más grandes con el fin de evitar que el aceite se escape. Pegue el cilindro mecanizada a 10 cm x 10 cm de hoja de acrílico fina utilizando cualquier epoxi de usos múltiples (Figura 1). En el día del experimento: 5. Preparación de electrodos Cortar una longitud de 7 cm de dos alambres de plata 250 micras de diámetro y, a continuación, sumerja sus consejos en lejía durante dos horas para formar una plata-cloruro de recubrimiento (AgCl). Un color gris indica que un recubrimiento de AgCl se ha formado (Figura 2E). Usando un cortador de vidrio, dividir un 10 cm de largo, 1 / 0,58 OD / ID mm capil clase de borosilicatolary en dos 5 cm capilares. El uso de una aguja de calibre 34 Microfil llenar los capilares con el hidrogel de PEG-DMA. Para evitar que el hidrogel hidratado de inflamación de los capilares, mantenga una distancia de 3 mm en las puntas y asegúrese de que no haya burbujas de aire en los capilares. Inserte los electrodos de Ag / AgCl en los capilares de hidrogel llenado (Figura 2E). Curar el hidrogel de PEG-DMA a través de la fotopolimerización por radicales libres tras la exposición a luz UV durante 2 min a 1 W utilizando una pistola de punto de UV. 6. Configuración del Experimento NOTA: El experimento se configura bajo una jaula de Faraday a tierra a una conexión a tierra en el amplificador de parche. Adjunte una de las micropipetas a un titular de microelectrodos recta que tiene un conector macho (Figura 2E). Conectar el titular microelectrodo al cabezal de la platina del amplificador de patch (Figura 2A). Para conectar el headstage a tierra, soldar un alambre de cobre aislado de calibre 18 a un conector adecuado para el cabezal de la platina. Montar el cabezal de la platina en un micromanipulador manual de 3 ejes. Fije la placa de montaje de cabezal de la platina (debe ser comprado junto con el micromanipulador o hecho a medida en un taller mecánico) para el micromanipulador y luego conectar el cabezal de la platina a la placa de montaje con los tornillos adecuados. Una el segundo micropipeta al actuador lineal a través de un conector de laboratorio a medida y luego montar tanto en un segundo micromanipulador (Figura 2B). Las micropipetas deben oponen entre sí, alineados, y horizontalmente nivelados. Nota: la marca y el estilo de los manipuladores no importan. En un vial de vidrio, mezclar 0,1 ml de los liposomas DPhPC con 0,01 ml de la solución de proteoliposoma V23T MscL. NOTA: Este paso es necesario para reducir la proporción de proteína a lípido (~ 0,0002), que es fundamental para la formación de un lípido estable bilayer. El uso de una aguja de calibre 34 Microfil, llenar los consejos de ambas micropipetas con proteoliposoma solución (Figura 3). Coloque el depósito en la parte superior de un microscopio vertical, y alimentar a las micropipetas a través de los agujeros opuestos 1 mm (Figura 2B). NOTA: cualquier microscopio podría ser utilizado siempre en las gotas se podían ver con claridad. Llenar el depósito a la superficie con Hexadecane (99%). El Hexadecano no necesita purificación adicional. Para formar las gotitas esféricas en la punta de las micropipetas, utilizar una tercera 10 micras de diámetro micropipeta de vidrio de borosilicato, montado en un tercio micromanipulador, para dispensar solución V23T diluido MscL proteoliposoma (~ 0.00052 ml) en las puntas de las micropipetas y formar el gotitas (Figura 3). Controlar el tamaño de las gotitas (disminuyendo o aumentando el volumen) como se desee y dejar reposar durante 10 min para las monocapas para formar por completo (Figura 3). Llevar las gotitas en contacto, formación de bicapa ocurrirá dentro de 1 a 2 min. 7. Configuración del Software y Equipos Preparar el software mediante la activación de las computadoras, microscopios, controlador oscilador piezoeléctrico, generadores de funciones, amplificador de parches, y el sistema de adquisición de datos de bajo ruido. NOTA: cualquier amplificador parche podría ser utilizada y las siguientes instrucciones son específicamente para la que utilizamos y que aparece en la lista de materiales y equipos. En el panel frontal del amplificador de patch, ajuste las perillas de "Mode" para VHOLD / IHOLD y V-CLAMP. En el panel frontal establecer el "paso bajo" filtro de Bessel a 1 kHz y Ganancia de salida a 2. Ajuste la "Configuración" para TODA LA CÉLULA β = 1. Asegúrese de que el resto de los mandos se ponen a cero o en punto muerto. Muestra todas las mediciones actuales DIB a 5 kHzcon un filtro de Bessel anti-aliasing 1 kHz. Ejecute el software haciendo doble clic en el icono en el escritorio. Haga clic en "Configurar> Digitalizador" para abrir el diálogo "digitalizador" y, a continuación, haga clic en el botón "Cambiar". En el cuadro de diálogo "Cambiar digitalizador" seleccione "Digidata Serie 1440" de la lista "Tipo digitalizador". Haga clic en el botón Scan para detectar el digitalizador. Haga clic en "Aceptar" para salir del cuadro de diálogo "Cambiar digitalizador" y haga clic en "Aceptar" para salir del cuadro de diálogo "digitalizador". Haga clic en "Configuración> Banco Lab". En la pestaña Señales de entrada de la mesa de laboratorio, seleccione analógico en un bajo Canales digitalizador. Ajuste el factor de escala de 0.002. 8. La formación de la bicapa lipídica El uso de un cable BNC, conecte la salida del awgenerador aveform al frente entrada de comando externa conmutada (en el panel posterior del sistema de adquisición de datos). Enviar una forma de onda triangular 10 Hz, 500 mV-pk-pk para el cabezal de la platina. Utilizando el micromanipulador, mover las micropipetas de vidrio horizontalmente para llevar gotitas en contacto hasta que tocan ligeramente y esperar a que se produzca adelgazamiento bicapa (generalmente alrededor de 1 a 2 minutos) (Figuras 3C y 3D). NOTA: La progresión del proceso de formación de bicapa se puede ver visualmente a través del microscopio y puede ser monitorizado por medición de corriente (Figura 4). Ajuste el tamaño bicapa (~ 250 micras de diámetro) mediante el control de la posición de la gotita montado en el actuador, mediante el micromanipulador. Nota: el tamaño bicapa podría estimarse visualmente a través del microscopio. Este método hace que sea más fácil para el investigador para controlar el tamaño de la bicapa fácilmente pormover las gotitas utilizando los micromanipuladores. 9. Dinámica de excitación y MscL Gating Una vez se ha formado la bicapa y es estable (es decir, la bicapa no se rompa o conductora), estimular las gotitas mediante el envío de una señal sinusoidal utilizando un generador de funciones. Para estimular la proteína MscL incorporado en la bicapa, envíe una forma de onda sinusoidal con una amplitud de 175 micras de pico a pico, la frecuencia de 0,2 Hz, y el ciclo de trabajo del 50% a la servo-controlador piezoeléctrico. (Varios tipos de formas de onda podrían ser enviados con diferentes amplitudes, frecuencias y ciclo de trabajo) 10. Procesamiento e Interpretación Resultados Guardar las medidas de corriente, grabadas con el sistema de adquisición de datos, en formato .ABF. Importar datos (en formato .ABF) a Matlab utilizando un archivo de función "abfload", a continuación, analizar y procesar los datos. El archivo "abfload" está disponible gratuitamente en Internet. Estimación tque la tensión en la bicapa y expansión superficial de las gotas, usando videos de la gota durante los ciclos completos de actuación que se graban con una cámara apropiada. Vídeos de proceso en Matlab, por el procesamiento de fotogramas individuales usando técnicas de procesamiento de imágenes para estimar el área de la interfase agua / aceite, así como el ángulo entre las gotitas. NOTA: el uso de un marco 2D tomada del vídeo, detección de la interfaz agua-aceite (es decir, el borde de la gota) y luego calcular el área de superficie de revolución.