液滴界面二重層中に細菌機械受容イオンチャネルの取り込みおよび刺激のための多機能、マイクロピペットベースの方法

PEG-DMAヒドロゲルの調製アプリケーションに適した計測/混合容器（フラスコ、ビーカー、 など 。）を選択します。洗剤と水を使って徹底的にきれいにしてから、糸くずの出ない組織ワイパーで拭いてください。 指先から油とガラス製品の汚染を避けるために手袋を着用してください。洗剤残留物を除去するのに十分な脱イオン水でコンテナを洗浄します。 イソプロピルアルコール（IPA、99.5％）をスプレーし、きれいになるまで拭き、その後、水を取り除くため、糸くずの出ないティッシュでコンテナを拭きます。すべてIPAが完全に蒸発することを可能にするために真空チャンバー内に配置します。蒸留水でハイドロゲル形成プロセスで使用される実験装置の残りの部分を清掃してください。 40％（w / v）のPEG-DMAヒドロゲル溶液を調製し、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート4gの重さ（PEG-DMAを、MW = 1,000グラム/モル）実験室スケールを用いてポリマー。 4で超音波洗浄器を用いて、フラスコと熱に計量し、PEG-DMAを配置固体PEG-DMAまで5-55℃の液化しました。処理中に、水を保つためにパラフィルム/ワックスペーパーでフラスコの開口部を覆います。 PEG-DMA液化したら、総体積が（6ヶ月の期間にわたっていくつかの実験のために十分な）〜10ミリリットルに達するまで、（500ミリモルのKCl、10mMのMOPS、pH7.0）に緩衝液を加えます。 （w / v）の0.5％の硬化剤を加えます。この場合には、10 mlの混合物に硬化剤を0.05gを加えます。バックソニケーター浴中にフラスコを置き、コンポーネント（10分、250ワット前後）溶液に溶解させます。 注：硬化剤を溶液に添加された後のに十分な時間、任意の光源にさらされた場合、ヒドロゲルは（固化）硬化します。これに対処しやすくするために、黒いテープでバイアル/容器をラップし、暗い場所に保管してください。この溶液を室温（22℃）で数週間保存することができます。 Liposの調製omes 1,2- diphytanoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DPhPC）合成の20 mgの緩衝液10ml（500ミリモルのKCl、10mMのMOPS、pHが7.0）を添加することにより、2 mg / mlの脂質溶液10mlを調製脂質は凍結乾燥粉末として購入しました。 （すべてが溶解したとき、混合物が均一とかすんで見えるはずです）両方の脂質小胞と緩衝液を十分に混合していることを確認します。 フリーズ（-20℃）し、完全に6回の合計のための新たな脂質混合物を解凍。決して加熱環境下で、室温で混合物の解凍をしてみましょう。 市販の押出機を用いて、0.1μmのメンブランフィルターを介して第1の0.4ミクロンのポリカーボネート膜フィルターに通し、その後6回全脂質懸濁液を強制することによって、脂質​​を押し出します。このプロセスは、（フィルタの孔サイズに等しい）は100nm付近の直径を有する粒子が得られます。 注：他の脂質および脂質比は、この私を用いて調製することができますTHOD。リポソームは、数週間のために4℃で保存する必要があります。 3. MSCLの単離と再構成 100μg/ mlのアンピシリン、Eを含むストリークアウト温度アガロースプレートを、 3 '末端（C末端）に6-Hisタグで拡張V23T MSCL遺伝子を運ぶpB10bプラスミドで大腸菌 MJF465細胞。静止インキュベーター内で37℃で培養一晩（12〜16時間）にプレートを許可します。プラスミドを選択するための標準LB培地中で100μg/ mlのアンピシリンを有する細胞内に保持されます。培養小胞（50ミリリットルフラスコまたは何の文化を保持するのに利用可能である）で100μg/ mlアンピシリンを含むLB培地の翌日場所20ミリリットル。一晩培養したプレートを取り、滅菌接種スティックを用いて調製20ミリリットルのLB培地に（接種）を転送するためにプレートからコロニーを選択します。 20ミリリットルの文化は振盪インキュベーター中で250rpmで37℃で一晩（12〜16時間）を成長させます。 overn 20ミリリットルをデカントLB培地の2-4 LにIGHT文化。アンピシリンは、もはや必要とされません。 OD 600が 0.5に達するまで37℃、250rpmで振盪培養器で振盪フラスコ。 0.6mmの最終濃度にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を追加し、（OD 600 = 0.8から1.0へ）文化は別の時間のために行ってみましょう。 文化を冷却した後、遠心分離により細菌を収集するために氷の上にフラスコを置きます。細菌をペレット化するのに十分である7438×gで5-8分間遠心（使用ローターによって許可されたかのような多くの）6 400ミリリットルコニカルチューブを使用してください。上清を除去し、メディアからのすべての細胞を回収するまでの手順を繰り返します。必要なスピンの数を増殖させ、ロータが用いられてきた培地の量に基づいて変化します。 2リットルの培養のために、それは一度だけ、細胞をスピンダウンするために必要とされます。単一の遠心分離管にすべて回収した細胞を転送します。 フレンチプレスバッファー（100mMのKPの〜20ml中の細胞ペレットを再懸濁しiおよび5mMのMgCl 2、pH7.4中）。サスペンションは、（クリームや牛乳など）、緻密でなければなりません。すぐに懸濁液を最終濃度2mMにプロテアーゼ阻害剤フッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）を追加し、激しく混ぜるフランス語プレスの前に。 フレンチプレス万〜​​16,000 psiで35ミリリットルフレンチ圧力セル内の文化、。 7438×gで、4℃で10分で破壊されていない細胞を分離するためにサスペンションをスピンダウン。 別のチューブに上清を入れ、それリゾチームおよびDNアーゼ（0.2 mg / mlの各）に追加します。室温で10分間上清タンブルをしてみましょう。 注：DNアーゼはオプションです。それは、高速遠心分離のために粘度を低下させます。リゾチームは非常に重要です。それは細胞壁の残りを消化し、穏やかな非変性界面活性剤を用いて行った膜抽出物の収率を増加させるのに役立ちます。 2超遠心チューブに上清ミックスを配布し、でそれらを回転40分間4℃で（ローターによって異なります）106,883-153,911 XG。遠心分離後、上清をデカントし、底部に茶色がかったペレット（総膜画分）は、長期保存のためにチューブに凍結することができる（ – 80°C）、または即時のタンパク質精製のために使用されます。 ハイイミダゾールバッファーの0.5-1 L準備：100mMのNaCl + 500 mMイミダゾールを、濃HClでpH 7.2-7.4に滴定します。イミダゾール自体が良い緩衝物質であることに注意してください。 適切に100mMのNaClで上記緩衝液を希釈することにより、100mMのNaCl、+ 15 mMイミダゾール：低イミダゾール緩衝液の0.5〜1 Lを用意。いいえpH調整は必要ありません。 別々のボトルに各バッファ100〜150ミリリットル取り、B-オクチルグルコピラノシド（OG）（w / v）の1％を追加します。よくソリューションを攪拌し、0.22μmのフィルターを通してそれをフィルタリングします。これらのソリューションは、低および高イミダゾールクロマトグラフィーソリューションです。 、抽出緩衝液を調製した低イミダゾール緩衝液を50mlを取り、3％を追加（w / v）のOGとバッファをフィルタリングします。 タンパク質の単離のために0.5〜2グラム湿重量の膜ペレットを使用してください。 、抽出緩衝液5-7 mlを加えペレットを再懸濁し、30ミリリットルの手主導のガラスピストンホモジナイザーでそれを均質化します。 5-10穏やかなストロークでダマのない均質な懸濁液を作ります。十分に注意してください、せん断応力は、タンパク質の変性を引き起こすことが知られています。 （15分間、4℃で、ミッドレンジの遠心分離機、固定角ローター、38,478-68,405 XG）不溶性粒子をスピンダウン。一方、ニッケルNTAビーズ（サスペンションの6ミリリットル）の3ミリリットルを取り、15ミリリットルのスクリューキャップチューブでそれらを振とうすることにより、低イミダゾールバッファー（W / O OG）で1回、それらを洗ってください。ビーズが底に（〜5-7分）を決済するか、4℃で1分間129から201×gで、それらをスピンダウンしてみましょう。ペレットが形成されると、丁寧に手で上清を除去し、手順を繰り返します。 3％OG抽出緩衝液2-3 mlのビーズを平衡化。 3からの均質化混合物（膜ペレットおよび抽出緩衝液）を混合します。3〜3.5ミリリットルのNi NTAビーズと12。 60分（バッチ・ロード）用のスクリューキャップチューブにミックスタンブルをしてみましょう。 、201×gで（30秒）でビーズをスピンダウン手で上清を除去し、一回1％のOG低イミダゾール緩衝液でビーズを洗浄します。再び3.13のように、ビーズをペレット化し、新鮮な低イミダゾールバッファ20〜30 ml中に再懸濁します。 ニッケルNTAビーズで（上位フローアダプターを装備した）小さな列をパックし、ビーズは抽出物（ビーズが乾燥することはできません）を通って流れるようにするストップコックを開いて落ち着かせて。オープンストップコックで10ml低イミダゾールバッファー（1％のOG）の1つのアリコートでビーズを洗浄します。 （マシンごとに異なります）マシン定義された流量で約25 mlずつの純粋な低および高イミダゾール緩衝液を用いてクロマトグラフィーマシンをロード。これは、最初にシステムを介して低イミダゾールバッファーを渡すことによって行われます。ゼロOD 260（ベースライン）の光記録装置。低品位イミダゾールIを持っているので、バッファは、水は全く異なることに注意してください紫外線を吸収するmpurities。列にフローアダプターを挿入し、マシンに接続します。 フロースルーのODが来るまで（それ10〜20ミリリットルかかる場合があります）は、ベースラインに到達した（1ml /分で）低イミダゾール緩衝液で再びカラムを洗浄。これは、カラムからの非結合タンパク質を除去します。 1ml /分で、30分間、500 mMの20のイミダゾールの線形勾配を適用します。 OD 600が増加しているときに4ミリリットルの分画の収集を開始。 MSCL-の6Hisは直線勾配の〜40％で溶出を開始するのに対し、最初の二つの画分は、ゆるく結合したタンパク質でいっぱいです。タンパク質の大部分は、3〜8の分​​画で表示されます。 注：ODの線形上昇はイミダゾールの増加％に観察されます。 3-4、5-6、7-8が一緒に画分をプール。必要に応じて、個別の画分を濃縮します。画分を遠心分離フィルターを使用して、6〜10倍に濃縮します。 804×gで、4℃で20分間スピンした後、慎重に、濃縮されたタンパク質を再懸濁タンパク質は、フィルターに固執する傾向があります。 、50μlのアリコートを撤回SDSサンプルバッファーでそれらを混合し、PAGEゲル電気泳動を用いてタンパク質の純度を確認してください。 注：MSCLがゲルの底に約17キロダルトンのファジーバンドとして移行されます。 製造業者の指示に従って、タンパク質アッセイキットを用いてタンパク質を定量化するために濃縮された画分を使用します。 0.8グラムの膜ペレットからの典型的な収量は、合わせた画分中の純粋なタンパク質の0.2ミリグラムまでです。 透析を通じてDPhPCのリポソームにV23T MSCLを再構成します。 3使い捨ての丸底（12×130ミリメートル）ガラス管にそれの10 mg / mlのクロロホルムDPhPCの溶液とアリコート0.5ミリリットル（脂質のすなわち、5 mg）を取ります。窒素気流下で脂質を乾燥させ、真空（4-6時間）の下でクロロホルムの残骸を削除します。 透析緩衝液（100mMのKClを、5 mMののKPi、pHは7.2）、渦、およびMIの2ミリリットルでそれを溶解し、各チューブに乾燥脂質に粉末OGの15 20mgの追加ldly超音波処理。 OG可溶化脂質は、透明な溶液を形成しなければなりません。 100：1：300と1：1を実現するために各チューブに集中V23T MSCLソリューションを追加千タンパク質対脂質比と渦も。カットし、透析チューブの三枚（~12センチ）洗浄（MWCO 8000、7.5ミリメートルの直径を、準備番号のクリップの3ペアを持ちます。） 慎重にクリップで両端を閉じ、4つの変更で、4℃で48時間、バッファの2 L（100のKCl、5mMののKPi、pH7.2中）に対して透析、チューブ内部に可溶化脂質 – タンパク質の混合物を配置します12時間毎にバッファ。透析後、プロテオリポソー​​ムは、準備が整いました。 注：リポソーム溶液をアジ化ナトリウム、2 mMの（アジ化ナトリウム）を補充し、4℃で保存することができます。凍結は避けてください。 油層の4製造直径2インチの壁を通って対向する二つの穴（直径1.0ミリメートル）のすべての方法をドリル、長さ1.5cmアクリルCYLボトム（ 図1A）から1センチメートルでインダー。 同心ドリル2つの4 mmの穴は、以前に1 mmの穴を掘削しました。穴の深さは1mmで、各（すべての方法をドリルダウンしないように注意してください）​​である必要があります。これらの穴は、ゴムガスケットに適合するように作られています。 漏れるオイルを防止するために大きな穴に1 mmの内径を有する二つのゴム製ガスケットを配置し、接着剤。 任意の多目的エポキシ（ 図1）を使用して、10センチメートルX 10センチメートル薄いアクリル板に機械加工シリンダーを接着。 実験の日に： 電極の5準備 2250μmの直径の銀ワイヤの7センチメートルの長さを切断し、次に塩化銀（AgClの）コーティングを形成するために2時間の漂白にその先端を浸します。灰色は、塩化銀のコーティングが（ 図2E）を形成したことを示しています。 ガラスカッターを使用して、長さ10cm分け、1 / 0.58 OD / IDミリメートルホウケイ酸クラスcapil2 5cmの毛細血管にラリ。 34ゲージのmicrofil針を使用すると、PEG-DMAヒドロゲルと毛細血管を埋めます。キャピラリーの外に膨潤水和ヒドロゲルを防止するために、先端に3mmの隙間を維持し、毛細血管内に気泡がないことを確認してください。 ヒドロゲル満たさ毛細血管（ 図2E）にはAg / AgCl電極を挿入します。 UVスポットガンを用いてW 1で2分間のUV光への曝露の際にフリーラジカル重合を介してPEG-DMAヒドロゲルを硬化させます。 6.実験のセットアップ注：実験はパッチアンプのアース接続に接地ファラデーケージの下に設定されています。 オスコネクタ（ 図2E）を持つまっすぐな微小電極ホルダーにマイクロピペットのいずれかを接続します。 パッチアンプ（ 図2A）のヘッドステージに微小電極ホルダーを接続します。ょんを接続す​​るには地面にdstageは、ヘッドステージのための適切なコネクタに18ゲージの絶縁銅線をはんだ付けしてください。 3軸の手動マイクロマニピュレーターにヘッドステージをマウントします。ヘッドステージ取付板を取り付けます（これは機械工場で作られたマイクロマニピュレーターやカスタムと一緒に購入する必要があります）マイクロマニピュレーターにし、適切なネジを使用して取付板にヘッドステージを接続します。 ラボ製コネクタを介してリニアアクチュエータに2つ目のマイクロピペットを取り付けた後、第2マイクロマニピュレーター（ 図2B）の両方をマウントします。マイクロピペットは、整列され、互いに対向し、水平方向に水平にする必要があります。注意：マニピュレータのブランドやスタイルは重要ではありません。 ガラスバイアルで、V23T MSCLのプロテオリポソー​​ム溶液を0.01ミリリットルとDPhPCリポソームの0.1ミリリットルを混ぜます。 注：この手順は、安定した脂質bilayeの形成に重要であるタンパク質対脂質比（〜0.0002）を、軽減するために必要とされますR。 34ゲージのmicrofil針を使用して、プロテオリポソーム溶液（ 図3A）との両方のマイクロピペットの先端を埋めます。 正立顕微鏡の上に貯蔵器を置き、反対側の1ミリメートルの穴（ 図2B）を介してマイクロピペットを養います。注：任意の顕微鏡があれば液滴がはっきりと見ることができたで使用することができます。 ヘキサデカン（99％）で表面に貯水池を埋めます。ヘキサデカンはさらに精製を必要としません。 第10μmの直径ホウケイ酸ガラスのマイクロピペットを使用し、マイクロピペットの先端に球形の液滴を形成するために、マイクロピペットの先端に希釈V23T MSCLのプロテオリポソー​​ム溶液（〜0.00052ミリリットル）を分与し、形成するために、第三のマイクロマニピュレータに取り付けられました液滴（ 図3）。 所望に応じて液滴（体積を減少または増加させることによって）の大きさを制御し、単層を完全に形成するためにそれらを10分間休ませ（Figure 3）。 接触液滴をもたらす、二層の形成は、1〜2分以内に発生します。 7.ソフトウェアおよび機器のセットアップコンピュータ、顕微鏡、圧電発振器コントローラ、関数発生器、パッチ増幅器、低雑音データ収集システムをオンにすることによってソフトウェアを準備します。 注：任意のパッチアンプを使用することができ、次の手順では、我々が使用され、資機材リストに記載されているもののために特別です。 パッチアンプのフロントパネルには、VHOLD / IHOLDとV CLAMPに「モード」ノブを設定してください。 フロントパネルの「 ローパス」ベッセル 2に1 kHzから出力ゲインにフィルター設定します。 全細胞β= 1の「構成」に設定します。 ノブの残りの部分はゼロまたは中立位置に設定されていることを確認。 5 kHzですべてのDIB電流測定サンプル1 kHzのベッセルアンチエイリアシングフィルタと。 デスクトップのアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを実行します。 「デジタイザ 」ダイアログを開き、「設定>デジタイザ」をクリックし、「変更」ボタンをクリックします。 「変更デジタイザ」ダイアログで「デジタイザタイプ」リストから「Digidata 1440シリーズ」を選択します。 デジタイザを検出するために、[スキャン]ボタンをクリックします 。 「変更デジタイザ」ダイアログを終了してから、「デジタイザ」ダイアログを終了し、「OK」をクリックし、「OK」をクリックします。 「設定>ラボベンチ」をクリックしてください 。 実験台の入力信号]タブでは、デジタイザチャンネルの下オングストロームでアナログを選択します。 0.002のスケール係数を設定します。 脂質二重層の形成8 BNCケーブルを使用すると、AWの出力を接続します外部コマンド入力前にaveformジェネレータは、（データ・アクイジション・システムの背面パネルに）切り替えます。ヘッドステージに10ヘルツ、500 mVのPKツーPK三角波を送信します。 マイクロマニピュレーターを用いて、（通常は約1〜2分）、彼らは少し触れると発生する間伐二重層を待つまで接触液滴をもたらすために、水平ガラスマイクロピペットを移動する（ 図3Cおよび 3D）。 注：二重層形成プロセスの進行を顕微鏡で視覚的に見ることができ、電流測定によってモニターすることができる（ 図4）。 小滴の位置を制御することにより、二層のサイズ（直径〜250μm）を調整し、マイクロマニピュレーターを使用して、アクチュエータに搭載されています。注意：二重層の大きさは、顕微鏡を通して視覚的に推定することができました。この方法は、簡単に研究者が簡単にすることによって二層のサイズを制御できるようになりますマイクロマニピュレータを用いて液滴を移動させます。 9.ダイナミック励起およびMSCLゲーティング二重層が形成され（ すなわち、二重層が破壊または導電性でない）安定していたら、関数発生器を使用して正弦波信号を送信することによって、液滴を刺激します。 二重層に組み込まMSCLタンパク質を刺激するために、圧電サーボコントローラ175ミクロンのピーク・ツー・ピーク振幅、0.2 Hzの周波数、および50％のデューティサイクルの正弦波形を送信します。 （波形の様々なタイプの異なる振幅、周波数、およびデューティサイクルで送信することができます） 10.処理と結果の解釈 .ABF形式で、データ収集システムを使用して記録された電流の測定値を、保存。関数ファイル」abfload」を使用してMATLABに（.ABF形式）データをインポートするには、そのデータを分析し、処理します。 「abfload "ファイルには、無料のオンラインのために利用可能です。 見積もりトン適切なカメラを使用して記録されている完全な作動サイクル中の液滴の動画を使用して二層と液滴の面積拡大に彼は緊張、。 水/油の界面の面積、並びに液滴間の角度を推定するために画像処理技術を使用して、個々のフレームを処理することによって、MATLABで処理ビデオ、。注：ビデオから取った2Dフレームを使用するには、水-油界面（ すなわち、液滴のエッジ）を検出し、回転することによって表面積を推定します。