JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

Published: November 19, 2015
doi:
10.3791/53362
, , , , , ,
1Department of Mechanical Engineering,Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Biomedical Engineering and Sciences,Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biology,University of Maryland, 4College of Engineering,University of Georgia, 5Department of Engineering Sciences and Mechanics,Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

Abstract

MscL, ערוץ מוליכות גדולות mechanosensitive (MSC), הוא שסתום שחרור osmolyte בכל מקום שמסייע חיידקים לשרוד זעזועים תת-האוסמוטי פתאומיים. זה כבר גילה וקפדנות למד באמצעות טכניקת תיקון מהדק לכמעט שלושה עשורים. תפקידה הבסיסי של תרגום מתח להחיל את קרום התא לתגובת חדירות עושה אותו למועמד חזק לתפקד כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular מבוסס קרום מלאכותיים. משמש כאבני בניין למכשירים כאלה, bilayers ממשק אגל (דיבס) יכולה לשמש כפלטפורמה חדשה להתאגדות והגירוי של ערוצי MscL. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת micropipette כדי ליצור דיבס ולמדוד את הפעילות של ערוצי MscL התאגדו. שיטה זו מורכבת של טיפות מימיות-עטוף שומנים מעוגנים לטיפים של שני micropipettes היריב (מיקום coaxially) הזכוכית בורוסיליקט. כאשר טיפות מובאות במגע, ממשק bilayer שומנים הואנוצר. טכניקה זו מציעה שליטה על ההרכב הכימי ואת הגודל של כל טיפה, כמו גם ממדים של ממשק bilayer. יש אחד של micropipettes המצורף למפעיל פיזואלקטריים הרמוני מספק את היכולת לספק גירוי oscillatory רצויה. באמצעות ניתוח של הצורות של הטיפות בעיוות, ניתן לאמוד את המתח שנוצר בממשק. שימוש בטכניקה זו, הפעילות הראשונה של ערוצי MscL במערכת DIB מדווחת. מלבד ערוצי MS, פעילויות מסוגים אחרים של ערוצים ניתן ללמוד באמצעות שיטה זו, המוכיחות את הרב-פונקציונלי של פלטפורמה זו. השיטה שהוצגה כאן מאפשרת מדידה של נכסי קרום בסיסי, מספקת שליטה רבה יותר על היווצרות קרום סימטרי וא-סימטרי, והיא דרך חלופית כדי לעורר וללמוד ערוצי mechanosensitive.

Introduction

בעשור האחרון, ההרכבה של bilayers שומנים המלאכותי כבר התקדמה באופן משמעותי באמצעות הפיתוח של שיטת bilayer ממשק טיפה. ידוע כיציב ואיתן, דיבס כפה את עצמם כמערכות מודל חלופיות לקלסיים הצבועים (Mueller) וbilayers המקופלת מישוריים (Montal-מולר) 1. למרות שהרעיון של שימוש בטיפין כדי ליצור bilayers שומנים שתחילתה 1960 2, לא זכה לפופולריות עד לאחרונה. הניסיון המוצלח הראשון שדווח על ידי קבוצת Takeushi 3, ואחריו כמה מחקרים מדגימים היווצרות bilayer באמצעות רשת של טיפות על ידי קבוצת ביילי 4-6. לאחרונה, טכניקות אנקפסולציה הוצעו על ידי קבוצת ליאו 7-9, שהיה חלוצות הרעיון של שימוש דיבס כאבני בניין של מערכות חומר לרומן גירויים מגיבים 10. במחקרים קודמים, דיבס הוכיח את היכולת שלהם להגיב לחשמלי 9,11, כימיגירויי iCal 10,12, ואופטיים 13. ביו-תרכובות שונות עם פונקציות גירויים מגיבים שונות כבר עוררו ביעילות כאשר מחדש בDIB 10,14. לאור ניסיונות המוצלחים אלה שאלה חשובה היא הרים: יכולות להגיב לגירוי מכאני DIB כאשר מולקולות ביולוגיות מתאימות משולבות? הכוחות הפועלים על interfacial DIB שונים מאלה ב15,16 מערכת bilayer האחר. לכן, את המתח בbilayer מוחזק על ידי הטיפות יכולים להיות נשלט על ידי ויסות מתח בממשקים-שמן-מים שומנים; מושג אינו ישים במערכות bilayer הצבועות או מקופלות.

ערוצי MscL, ידועים כשסתומי שחרור osmolyte ואלמנטים בסיסיים של קרום cytoplasmic חיידקים, מגיבים למתח קרום עלה 17,18. במקרה של זעזועים תת-אוסמוטי, מספר ערוצים המתגוררים בקרום של תא קטן 19 יכול ליצור masתגובת חדירות sive לשחרר במהירות יונים ומולקולות קטנות, חיסכון בחיידקים מתמוגה 20. Biophysically, MscL הוא למד היטב ומתאפיין בעיקר באמצעות טכניקת מהדק התיקון הבולט 21-23. מודלים מבניים אמין מסבירים 24,25 מנגנון gating של MscL מוצעים מבוססים על המבנה של homolog גביש 26,27, דוגמנות 28, ותוצאות של ניסויים נרחבים 24,29-31. תחת מתח מיושם ב~ 10 MN / מ ', הערוץ הסגור אשר מורכב מחבילה הדוקה של סלילים הטרנסממברני, הופך לטבעת של סלילים מוטים מאוד להרכיב נקבובית מלא מים ~ 28 Å מוליך 21,24,32. כמו כן, נקבע כי הידרופוביות של השער ההדוק, ממוקמת בצומת של תחומים TM1 הפנימיים, קובעת את סף ההפעלה של הערוץ 33. במקביל, נמצא כי על ידי הפחתת הידרופוביות של השער, tensioסף n יכול להיות הוריד 22. מאפיין זה של MscL התאפשר העיצוב של שסתומי שליטה שונים 34, בעיקר למטרות משלוח סמים. לכל המאפיינים הנ"ל ומבוסס על תפקידה הבסיסי של תרגום מתחים מוגזמים קרום תא לפעילות אלקטרו, MscL עושה כושר נהדר כמתמר mechanoelectrical בדיבס.

במאמר זה, אנו מציגים שיטה מבוססת micropipette מקורי כדי ליצור דיבס ולמדוד את הפעילות של ערוצי MscL התאגדו תחת גירוי מכאני. אנו מדווחים לראשונה, התגובה של דיבס לגירוי מכאני והכינון מחדש הפונקציונלי של המוטציה V23T נמוך הסף של MscL בדיבס 35.

המערכת הניסיונית מורכבת של טיפות מימיות שומנים עטופים המעוגנות לטיפים של שני micropipettes הזכוכית בורוסיליקט היריב. כאשר טיפות מובאות במגע ממשק bilayer שומנים הוא FOrmed. טכניקה זו מציעה שליטה על ההרכב הכימי וגודל של כל אגל (בתפזורת), כמו גם את הממדים של ממשק bilayer. בנוסף, קרומים סימטריים עם קומפוזיציות שומנים שונות בכל עלון יכולים להיווצר בקלות. יש אחד של micropipettes המצורף למפעיל פיזואלקטריים הרמוני, מספק את היכולת ליישם חד מחזור מתוכנתים מראש או גירוי oscillatory. מתח מועבר אל הקרום המלאכותי באמצעות הדחיסה של שני הטיפות התומכות בו. כתוצאה מעיוות אגל, תחומי עלייה-שמן-מים שומנים ממשקים, ובו זמנית הזווית בין הטיפות יורד, גורמים לעלייה במתח קרום והפעלת MscL חולפת. באמצעות ניתוח של הצורות של הטיפות בעיוות, יכול להיות מוערך המתח שנוצר בממשק. למרות ההתמקדות במאמר זה היא על מאפייני mechano-התמרה של DIB, אנחנו גם להדגיש כי סוגים אחרים של ביומולקולות, כגון alamethicin, יכולות להיות מופעלות על ידי פלטפורמה רב תפקודית זו. אנו מציגים כאן, את כל ההיבטים הטכניים של הכנה, הרכבה, ומדידות בשיטה חדשה זו באופן צעד-אחר-צעד.

Protocol

1. הכנת PEG-DMA הידרוג בחר מיכל מדידה מתאימה / ערבוב (בקבוק, כוס, וכו '.) ליישום. נקה אותו ביסודיות באמצעות חומר ניקוי ומים, ולאחר מכן לנגב אותו עם מגבי רקמה נטול מוך. ללבוש כפפות כדי להימנע מזיהום הזכוכית עם שמנים מקצות אצבעות. יש לשטוף את המכל עם מים ללא יונים מספיק כדי להסיר שאריות חומר ניקוי. נגב את המכל עם רקמה ונטולת מוך כדי להיפטר מהמים, ולאחר מכן לרסס עם אלכוהול איזופרופיל (IPA, 99.5%) ולנגב עד נקי. למקם אותו בתא ואקום כדי לאפשר לכל IPA להתאדות לחלוטין. נקה את שאר ציוד המעבדה המשמש בתהליך יצירת הידרוג'ל עם מים מזוקקים. כדי להכין 40% (w / v) פתרון הידרוג'ל PEG-DMA, שוקל 4 גרם של פולי (אתילן גליקול) dimethacrylate (PEG-DMA; MW = 1000 g / mol) הפולימר באמצעות סולם מעבדה. מניחים את PEG-DMA שקל לבקבוק וחום באמצעות אמבטיות sonicator ב 45-55 ° C עד PEG-DMA מוצק מעובה. במהלך התהליך, לכסות את פתיחת הבקבוק עם נייר / שעוות Parafilm כדי למנוע חדירת מים. ברגע שPEG-DMA יש מעובה, להוסיף פתרון חיץ (500 מ"מ KCl, 10 מ"מ מגבים, pH 7.0) עד נפח כולל מגיע ~ 10 מיליליטר (מספיק לכמה ניסויים על פני תקופה של שישה חודשים). הוסף את סוכן הריפוי ברמה של 0.5% (w / v). במקרה זה, להוסיף 0.05 גר 'סוכן הריפוי של לתערובת 10 מיליליטר. מניחים את הבקבוק בחזרה לאמבטיה sonicator ולאפשר הרכיבים לפזר בפתרון (כ -10 דק ', 250 ואט). הערה: ברגע שסוכן הריפוי נוסף לפתרון, הידרוג ירפא (לחזק) אם נחשף לכל מקור אור לכמות מספקת של זמן. כדי לסייע במאבק זה, לעטוף את הבקבוקון / המכל עם סרט שחור ולאחסן אותו במקום חשוך. פתרון זה יכול להיות מאוחסן במשך כמה שבועות בטמפרטורת חדר (22 מעלות צלזיוס). 2. הכנת Liposomes הכן 10 מיליליטר של פתרון שומנים 2 מ"ג / מיליליטר על ידי הוספת 10 מיליליטר של חיץ (500 מ"מ KCl, 10 מ"מ מגבים, pH 7.0) 20 מ"ג של 1,2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphocholine סינטטי (DPhPC) שומנים נרכשו כאבקת lyophilized. הפוך שלפוחית ​​בטוחה גם שומנים ופתרון חיץ מעורבבים היטב (התערובת צריכה להיראות הומוגני ומעורפלת כאשר הכל נמס). הקפאה (-20 ° C) ולהפשיר את תערובת השומנים החדשה עבור הסכום כולל של שש פעמים לחלוטין. בואו הפשרת התערובת בטמפרטורת חדר, לא בסביבה מחוממת. באמצעות מכבש זמין מסחרי, extrude השומנים ידי אילוץ כל ההשעיה השומנים ראשון דרך מסנן קרום פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר ולאחר מכן שש פעמים דרך מסנן 0.1 מיקרומטר קרום. תהליך זה מניב חלקיקים בקוטר 100 ננומטר ליד (שווה לגודל הנקבובית של המסנן). הערה: שומנים אחרים ויחסי שומנים ניתן להכין באמצעות זהthod. יש לאחסן יפוזומים על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. 3. בידוד MscL וכינון מחדש Streak את צלחת agarose הטמפרטורה, המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, א ' תאי coli MJF465 עם פלסמיד pB10b נושא את גן V23T MscL מורחב עם 6-תג על סוף '3 ​​(C-סופית). לאפשר את הצלחת ללילה תרבות (12-16 שעות) על 37 מעלות צלזיוס בחממה נייחת. פלסמיד נבחר ולנשמר בתאים עם 100 מיקרוגרם אמפיצילין / מיליליטר במדיום LB סטנדרטי. המקום למחרת 20 מיליליטר של תקשורת LB עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין בשלפוחית ​​culturing (בקבוק 50 מיליליטר או מה זמין להחזיק התרבות). קח את הצלחת שתרבית הלילה ובחר מושבה מהצלחת להעביר (לחסן) לתקשורת LB 20 מיליליטר מוכן עם חיסון מקל סטרילי. לאפשר לתרבות 20 מיליליטר לגדול (HR 12-16) הלילה בשעה 37 ° C ב 250 סל"ד בחממה רועדת. למזוג 20 מיליליטר overnתרבות ight ל2-4 L של מדיום LB. אמפיצילין הוא כבר לא נדרש. לנער את צלוחיות בחממה רועדת ב 250 סל"ד על 37 מעלות צלזיוס עד OD 600 מגיע 0.5. להוסיף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 0.6 מ"מ ולתת התרבות ללכת לעוד שעה (600 OD = .8-1.0). שים את צלוחיות על קרח כדי לצנן את התרבויות ולאחר מכן לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה. השתמש בשישה 400 מיליליטר צינורות חרוטי (או כמה שמותר על ידי הרוטור משמש) ו צנטריפוגות במשך 5-8 דקות בXG 7438 וזה מספיק כדי גלולה החיידקים. למזוג supernatant, ולחזור על התהליך עד שכל התאים מהתקשורת נקצרים. מספר הספינים הנדרשים משתנה בהתאם לכמות של תרבות שכבר גדלה ואת הרוטור בשימוש. לתרבות 2 L הוא נחוץ רק כדי לסובב את התאים פעם אחת. העבר את כל התאים שנקטפו לתוך צינור צנטריפוגות יחיד. Resuspend את כדורי תא ב~ 20 מיליליטר של חיץ עיתונות הצרפתי (100 מ"מ KPאני ו5 מ"מ MgCl 2, pH 7.4). ההשעיה צריכה להיות צפופה (כמו שמנת או חלב). מייד לפני צרפתי-לחיצה על ההשעיה להוסיף פלואוריד מעכבי פרוטאז phenylmethylsulfonyl (PMSF) לריכוז סופי של 2 מ"מ ומערבבים נמרצות. צרפתית-עיתונות התרבות, בתא לחץ צרפתי 35 מיליליטר, ב 10,000 עד 16,000 psi. ספין למטה ההשעיה להפריד את התאים רצופים ב7438 XG, 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שים את supernatant בצינור נפרד, ולהוסיף לו יזוזים וDNase (0.2 מ"ג / מיליליטר כל אחד). בואו נפילת supernatant במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: DNase הוא אופציונאלי; היא מפחיתה את הצמיגות לצנטריפוגה במהירות גבוהה. יזוזים הוא קריטי; זה מעכל את שרידי קיר תא ומסייע להגדיל את התשואה של חילוץ הקרום נעשה עם חומר ניקוי שאינו denaturing קל. להפיץ את תערובת supernatant לשני צינורות ultracentrifuge הספין ב106,883-153,911 XG (תלוי ברוטור) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. לאחר צנטריפוגה supernatant הוא יצק וגלול החום בתחתית (סה"כ חלק הקרום) אפשר להקפיא בצינור לאחסון לטווח ארוך (- 80 מעלות צלזיוס) או המשמש לטיהור חלבון מיידית. הכן 0.5-1 ליטר של חיץ הגבוה Imidazole: 100 מ"מ NaCl + 500 מ"מ imidazole, לכיל ל- pH 7.2-7.4 עם HCl המרוכז. שים לב שimidazole הוא חומר חציצה טוב בפני עצמו. הכן 0.5-1 ליטר של חיץ נמוך Imidazole: 100 מ"מ NaCl, + 15 מ"מ imidazole, על ידי כראוי דילול החיץ מעל עם 100 מ"מ NaCl. אין התאמת pH נדרש. קח 100-150 מיליליטר של כל חיץ בבקבוקים נפרדים, ולהוסיף 1% (w / v) glucopyranoside ב-octyl (OG). מערבבים את הפתרון טוב ולסנן אותה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. פתרונות אלה הם פתרונות כרומטוגרפיה הנמוכים וגבוה imidazole. הכן חיץ הפקה, לקחת 50 מיליליטר של חיץ נמוך imidazole, ולהוסיף 3% (w / v)OG ולסנן את החיץ. השתמש בכדורי קרום של משקל רטוב 0.5-2 גרם לבידוד חלבון. להוסיף 5-7 מיליליטר של חיץ חילוץ, resuspend גלולה, וhomogenize זה בhomogenizer זכוכית בוכנה יד מונחה 30 מיליליטר. עם 5-10 משיכות עדינות לעשות השעיה הומוגנית ללא גושים. השתמש בזהירות, מאמץ גזירה ידוע כגורם denaturation חלבון. ספין למטה החלקיקים מסיסים (צנטריפוגות באמצע הטווח, הרוטור זווית קבועה, 38,478-68,405 XG, ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות). בינתיים, לקחת 3 מיליליטר של חרוזים ניקל נת"ע (6 מיליליטר של השעיה) ולשטוף אותם פעם אחת עם החיץ הנמוך imidazole (w / o OG) על ידי טלטולם 15 מיליליטר הברגת כובע הצינור. בואו חרוזים להתיישב בחלקו התחתון (~ 5-7 דק ') או לסובב אותם ב129-201 XG במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס. ברגע שהגלולה נוצר, למזוג בזהירות את supernatant על ידי יד ולחזור על התהליך. לאזן את החרוזים עם 2-3 מיליליטר של 3% חיץ חילוץ OG. מערבבים את התערובת הומוגני (גלולה קרום וחיץ חילוץ) מ 3.12 עם 3-3.5 מיליליטר חרוזים ניקל נת"ע. בוא נפילת התערובת בצינור בורג מכסה למשך 60 דקות (אצווה טעינה). ספין חרוזים למטה ב201 XG (30 שניות), למזוג supernatant ביד, ולשטוף את החרוזים עם חיץ נמוך imidazole OG 1% פעם אחת. גלולה חרוזים כמו ב3.13 שוב וresuspend אותם 20-30 מיליליטר של חיץ נמוך imidazole הטרי. לארוז טור קטן (מצויד בזרימת מתאם עליון) עם חרוזים ניקל נת"ע, ולתת את החרוזים להתיישב על ידי פתיחת השסתום כדי לאפשר את זרימת התמצית דרך (לא מאפשר את החרוזים לייבוש). שטוף את החרוזים עם aliquot אחד 10 מיליליטר חיץ הנמוך imidazole (OG 1%) עם זין התחנה פתוח. טען את המכונה כרומטוגרפיה עם מאגרים נמוכים טהור וגבוה imidazole כ -25 מיליליטר של כל אחד בקצב זרימת המכונה מוגדרת (משתנה לפי מכונה); זה נעשה על ידי עובר החיץ הנמוך imidazole דרך מערכת ראשונה. אפס המקליט האופטי בOD 260 (בסיס). שימו לב שהמאגר הוא שונה לגמרי ממים בגלל imidazole בדרגה נמוכה יש ליmpurities שסופג UV. הכנס את זרימת המתאם לעמודה ולצרף אותו למכונה. לשטוף את העמודה שוב עם חיץ נמוך imidazole (ב 1 מיליליטר / דקה) עד OD של הזרימה דרך מגיע מגיעה נקודת ההתחלה (זה עלול לקחת 10-20 מיליליטר). זה מסיר את החלבונים מאוגד מהטור. החל שיפוע ליניארי של imidazole של 20 עד 500 מ"מ, למשך 30 דקות, ב 1 מיליליטר / דקה. להתחיל לאסוף 4 מיליליטר שברים כאשר OD 600 מצביע על עלייה. שני השברים הראשונים מלאים של חלבונים קשורים באופן רופף, ואילו MscL-6His מתחיל elution ב ~ 40% מהשיפוע ליניארית. רוב החלבון מופיע בברים 3 עד 8. הערה: עלייה ליניארית של OD יקויימו בשל% הגוברים של imidazole. בריכת השברים 3-4, 5-6, 7-8 ויחד. לחלופין, לרכז את השברים בנפרד. לרכז את השברים 6-10 פי באמצעות מסנני צנטריפוגלי. אחרי ספין 20 דקות ב 804 XG ועל 4 מעלות צלזיוס, resuspend זהירות החלבון המרוכז,החלבון נוטה להיצמד למסנן. למשוך 50 aliquots μl, לערבב אותם עם חיץ מדגם SDS, ולבדוק לטוהר חלבון באמצעות ג'ל אלקטרופורזה עמוד. הערה: MscL יעבור כלהקה מטושטשת של כ -17 kDa לתחתית הג'ל. השתמש בשברים מרוכזים לכמת את החלבון באמצעות ערכת assay חלבון, בעקבות ההוראה של היצרן. תשואה טיפוסית מגלולת קרום 0.8 גרם היא עד 0.2 מ"ג של חלבון טהור בשילוב שברים. מחדש V23T MscL ליפוזומים DPhPC באמצעות דיאליזה. קח 10 מ"ג / מיליליטר פתרון כלורופורם של DPhPC וaliquot 0.5 מיליליטר (כלומר 5 מ"ג של שומנים בדם) שלו לשלוש מסביב לתחתית חד פעמית (12 x 130 מ"מ) צינורות זכוכית. ייבש את השומנים מתחת לזרם של חנקן ולהסיר את השאריות של כלורופורם תחת ואקום (4-6 שעות). הוסף 15 20 מ"ג של OG אבקה לשומנים בדם היבש בצינור אחד, לפזר אותו ב 2 מיליליטר של חיץ דיאליזה (100 מ"מ KCl, 5 מ"מ KPI, pH 7.2), מערבולת, ומילsonicate ldly. השומנים-solubilized OG צריכים ליצור פתרון ברור. להוסיף פתרונות V23T MscL מרוכזים לכל צינור כדי להשיג 1: 100, 1: 300 ו- 1: 1,000 יחסים ומערבולת חלבון לשומנים טוב. לגזור ולשטוף שלוש חתיכות (ארוך 12 סנטימטר ~) של צינורות דיאליזה (8000 MWCO, קוטר 7.5 מ"מ, יש שלושה זוגות של קטעים ממוספרים מוכנים.) מניחים את תערובת שומנים חלבון solubilized בתוך צינורות, לסגור היטב את הקצוות עם קליפים, ודיאליזה נגד 2 ליטר של חיץ (100 מ"מ KCl, 5 מ"מ KPI, pH7.2) במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם ארבעה שינויים של חיץ כל 12 שעות. לאחר דיאליזה, proteo-ליפוזומים מוכנים. הערה: פתרון liposome ניתן להשלים עם 2 מ"מ של NaN3 (אזיד הנתרן) ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס. הימנע הקפאה. 4. ייצור של מאגר הנפט לקדוח שני חורים מנוגדים (1.0 מ"מ קוטר) לאורך כל דרך הקיר של קוטר 2 אינץ ', צילינדר אקריליק הארוך 1.5 סנטימטריםאינדר ב1 סנטימטר מהחלק התחתון (איור 1 א). תרגיל שני חורים 4 מ"מ קונצנטריים לנקדחו בעבר חורי 1 מ"מ. מעמקי החורים צריכים להיות 1 מ"מ כל אחד (לוודא שלא לקדוח כל הדרך). חורים אלה עשויים להתאים אטמי הגומי. אטמי מקום ודבק שני גומי שקוטר 1 מ"מ פנימי של חורים גדולים יותר על מנת למנוע מנפט דולף. מדביקים את הגליל במכונה כדי 10 סנטימטרים X 10 סנטימטרים גיליון אקריליק דק באמצעות כל אפוקסי תכליתי (איור 1). ביום של הניסוי: 5. הכנת אלקטרודות לחתוך באורך 7 סנטימטר של שני חוטי כסף 250 מיקרומטר בקוטר, ולאחר מכן לטבול את הטיפים שלהם באקונומיקה במשך שעות כדי ליצור כסף-כלוריד ציפוי (AgCl). צבע אפור מציין כי ציפוי AgCl כבר נוצר (2E איור). באמצעות חותך זכוכית, לפצל OD / capil ארוך 10 סנטימטרים, 1 / 0.58 מ"מ מזהה כיתת ורוסיליקטלארי לשתי 5 נימי סנטימטר. באמצעות מחט microfil 34 מד למלא את הנימים עם הידרוג'ל PEG-DMA. כדי למנוע התייבשות הידרוג'ל מנפיחות מתוך הנימים, לשמור פינוי 3 מ"מ בקצוות ולוודא שאין בועות אוויר בנימי. הכנס את האלקטרודות Ag / AgCl לנימי הידרוג'ל המלא (איור 2E). לרפא הידרוג'ל PEG-DMA דרך photopolymerization רדיקלים חופשי עם חשיפה לאור UV למשך 2 דקות ליום 1 בW באמצעות אקדח נקודת UV. 6. הגדרת הניסוי הערה: הניסוי הוא התקנה תחת כלוב פאראדיי המוארק להארקה במגבר התיקון. צרף אחד micropipettes לבעל microelectrode ישר שיש לו מחבר זכר (איור 2E). חבר את בעל microelectrode לheadstage של מגבר התיקון (איור 2 א). כדי לחבר את חימוםdstage לקרקע, לרתך חוט נחושת מבודד 18 מד למחבר מתאים לheadstage. הר headstage על micromanipulator 3 ידני ציר. צרף את צלחת headstage הרכבה (זה צריך להיות קנה יחד עם micromanipulator או מותאם אישית בחנות מכונת) לmicromanipulator ולאחר מכן חבר את headstage להרכבת הצלחת באמצעות ברגים מתאימים. צרף micropipette השני למפעיל ליניארי דרך מחבר תוצרת מעבדה ולאחר מכן לטעון שני על micromanipulator שני (איור 2). Micropipettes צריך להיות מנוגדים זה לזה, מיושר, ומפולס אופקי. הערה: המותג והסגנון של מניפולטורים לא משנה. בבקבוקון זכוכית, לערבב 0.1 מיליליטר של יפוזומים DPhPC עם 0.01 מיליליטר של פתרון proteoliposome V23T MscL. הערה: יש צורך בשלב זה כדי להפחית את יחס חלבון-לשומנים בדם (~ 0.0002), שהוא קריטי להיווצרות של bilaye שומנים יציבr. באמצעות מחט microfil 34 מד, למלא את הטיפים של שני micropipettes עם proteoliposome פתרון (איור 3 א). מניחים על גבי מאגר של מיקרוסקופ זקוף, ולהאכיל את micropipettes דרך חורי 1 מ"מ המנוגדים (איור 2). הערה: כל מיקרוסקופ יכול לשמש כארוך בטיפין יכולות לראות בבירור. מלא מאגר אל פני השטח עם hexadecane (99%). Hexadecane לא צריך טיהור נוספת. כדי ליצור את הטיפות כדוריות בקצה micropipettes, להשתמש micropipette זכוכית בורוסיליקט שלישי 10 מיקרומטר קוטר, רכוב על micromanipulator שלישי, לוותר פתרון V23T המדולל proteoliposome MscL (~ .00052 מיליליטר) בטיפים של micropipettes ויוצר טיפות (איור 3). לשלוט על הגודל של הטיפות (על ידי הפחתה או הגדלת ההיקף) כרצוי ולתת להם לנוח במשך 10 דקות לmonolayers כדי ליצור לגמרי (Figure 3). להביא את הטיפות במגע, היווצרות bilayer תתרחש בתוך 1 עד 2 דקות. 7. הגדרת התוכנה וציוד הכן את התוכנה על ידי הפעלת המחשבים, נתוני מערכת רכישת רעש הנמוך מיקרוסקופ, בקר מתנד פיזואלקטריים, גנרטורים פונקציה, מגבר תיקון, ו. הערה: כל מגבר תיקון יכול לשמש וההוראות הבאות במיוחד עבור אחד השתמשנו ואשר מופיע ברשימת החומרים וציוד. בלוח הקדמי של מגבר התיקון, להגדיר את הכפתורים "מצב" לVHOLD / IHOLD וV-מהדק. בלוח הקדמי להגדיר את "Lowpass" בסל מסנן לרווח קילוהרץ והפלט 1 עד 2. הגדר את "התצורה" לβ התא כל = 1. ודא שאר הכפתורים מוגדרים אפס או בעמדה ניטראלית. לדגום את כל מדידות זרם DIB בשעת 5 kHzעם מסנן אנטי-aliasing kHz 1 בסל. הפעל את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על הסמל בשולחן העבודה. לחץ על "Configure> דיגיטלי" כדי לפתוח את הדו-שיח "הדיגיטלי", ולאחר מכן לחץ על הכפתור "השינוי". בהדו-השיח "שינוי הדיגיטלי" בחר "סדרת Digidata 1,440" מהרשימה "דיגיטלי סוג". לחץ על לחצן הסריקה כדי לאתר את digitizer. לחץ על "אישור" כדי לצאת מהדו-השיח "שינוי הדיגיטלי", ולאחר מכן לחץ על "אישור" כדי לצאת הדו-שיח "הדיגיטלי". לחץ על "Configure> ספסל מעבדה". בכרטיסיית אותות קלט של ספסל המעבדה, בחר אנלוגי בתחת ערוצים דיגיטלי. הגדר את גורם קנה המידה ל0.002. 8. כינונה של bilayer השומנים באמצעות כבל BNC, לחבר את הפלט של awגנרטור aveform לחזית קלט הפקודה החיצונית עבר (בלוח האחורי של מערכת רכישת נתונים). שלח צורת גל משולשת PK לPK 10 הרץ, 500 mV לheadstage. שימוש micromanipulator, הזז את micropipettes הזכוכית אופקי כדי להביא טיפות במגע עד שהם מעט לגעת ולחכות לbilayer הדליל להתרחש (בדרך כלל סביב 1 עד 2 דקות) (3C דמויות ו3D). הערה: התקדמות של תהליך היווצרות bilayer ניתן לראות מבחינה ויזואלית מבעד למיקרוסקופ ועשויה להיות במעקב על ידי מדידה נוכחית (איור 4). התאם את גודל bilayer (~ 250 מיקרומטר בקוטר) על ידי שליטה על המיקום של הטיפה רכובה על המפעיל, באמצעות micromanipulator. הערה: גודל bilayer יכול להיות מוערך מבחינה ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ. שיטה זו מקלה על החוקר לשלוט על הגודל של bilayer בקלות על ידינע טיפות באמצעות micromanipulators. 9. דינמי עירור וMscL gating ברגע שbilayer יצר ויציב (כלומר bilayer לא לשבור או מוליך), לעורר את הטיפות על ידי שליחת אות סינוסי שימוש במחולל פונקציה. כדי לעורר את חלבון MscL התאגד בbilayer, לשלוח גל סינוסי עם משרעת 175 מיקרומטר שיא-לשיא, תדר 0.2 הרץ, ו -50% מחזור חובת סרוו בקר פיזואלקטריים. (סוגים שונים של צורות גל יכולים להישלח עם אמפליטודות שונות, תדרים, ומחזור עבודה) 10. עיבוד ופרשנות תוצאות שמור את מדידות זרם, נרשמו באמצעות מערכת רכישת נתונים, בפורמט .ABF. נתוני יבוא (בפורמט .ABF) לMatlab באמצעות "abfload" קובץ פונקציה, ולאחר מכן לנתח ולעבד את הנתונים. קובץ "abfload" זמין באינטרנט בחינם. לא אומדןהוא המתח בbilayer וההתרחבות אזורית של הטיפות, באמצעות קטעי וידאו של רביב במהלך מחזורי actuation מלאים שנרשמים באמצעות מצלמה מתאימה. קטעי וידאו תהליך בMatlab, על ידי עיבוד מסגרות בודדות תוך שימוש בטכניקות עיבוד תמונה להעריך את האזור של ממשק מים / שמן, כמו גם את הזווית בין הטיפות. הערה: שימוש במסגרת 2D נלקחה מהווידאו, לזהות את ממשק שמן-מים (כלומר קצה הטיפה) ולאחר מכן להעריך את השטח הפנים על ידי מהפכה.

Representative Results

איורים 1 ו -2 תצוגת ההתקנה וציוד ניסיוניות משמש להקלטת פעילות חלבון במהלך הגירוי המכני של קרום bilayer השומנים. כדי למזער את הרעש חשמלי למדידות שלנו, תחנת העבודה ממוקמת בתוך כלוב פאראדיי תוצרת מעבדה, מקורקע להארקה בAxoPatch 200 B מגבר. היווצרות של bilayer שומנים בידוד יציב היא צעד מפתח במחקר זה. בהסדר זה, monolayer שומנים המרכיב בממשק שמן / מים של הטיפות מימיות שקועים באמבט של ממס אורגני. כאשר טיפות ממוקמות במגע, עודפי שמן מתבטל, וmonolayers השומנים היריב דק לbilayer שומנים עבה שתי מולקולות. הטכניקה הנפוצה ביותר בשימוש באפיון bilayer היא מתח מהדק. עם מתח מהדק, המתח על פני bilayer נשמר ערך קבוע בזמן הנוכחי נמדד. איור 4 </stronז> מציג הקלטה נוכחית בזמן אמת אופיינית להיווצרות bilayer הראשונית. ידיעת הקיבול הספציפי (~ 0.6 μF / 2 סנטימטר) 5 של bilayer השומנים DPhPC, האזור של bilayer נוצר יכול להיות מחושב. אזור bilayer יכול להיות נשלט על ידי שינוי המיקום של הטיפות (איור 4 א). באמצעות המפעיל פיזואלקטריים, סוגים שונים של צורות גל (סינוסי, מרובע, משולש, וכו '.) בתדרים, אמפליטודות, ומחזורי החובה שונים יכולים להיות מיושמים על הטיפות לאופקיות וaxially להתנדנד ובכך, מתח bilayer ואזור אפשר לשנות (איור 4). כאשר DIB מגורה באופן מכאני, תוך שמירה על פוטנציאל למתח קבוע על פני הקרום, המוטציה V23T נמוך סף (להשיג של פונקציה) של MscL יוצרת פעילויות אמינות כוללים מדינות בעיקר תת-מוליך ואירועי פתיחה מלאים מדי פעם (איור 5) . EV אלהמציג זהה לאלה שנרשמו בטכניקת תיקון- clamp מקרומים פנימיים E. coli ויפוזומים מחדש עם V23T המטוהר MscL. התוצאות באיור 5 להוכיח gating המתרחש בתגובה לעלייה במתח, שכן כל הקוצים הנוכחיים הם נצפו בדחיסת השיא. בדחיסת שיא, הרחבת האזוריויות היחסית של הטיפות היא מקסימלי, ולכן, מתח בממשק הוא מקסימאלי. Alamethicin, ערוץ יון מתח מגודרת ואחד מהפפטידים הנחקרים ביותר, מגביר את חדירות קרום כאשר מתח DC מוחל על פני הקרום 36. היכולת של ממשק bilayer השומנים לארח חלבונים הטרנסממברני ופפטידים גם היא נבדקה על ידי ביצוע הקלטות הנוכחיות gating מתח באמצעות alamethicin פפטיד. Alamethicin מעורבב עם פתרון פוספוליפידים לריכוז סופי של מיליליטר / 100 ng. איור 6 מציג את מדידות זרם תחת מהדק מתח (115 mV). הטיפות בניסוי זה נקרע לגזרים על מנת להשיג ממשק קטן bilayer והתנגדות כך גבוהה וקיבול קטן יותר. Gating ההתנהגות של הפפטיד Alamethicin מוצגת דרך השלבים של הנוכחי (איור 6) הבדידים. היסטוגרמה בצד ימין של העלילה מציגה את השינויים במוליכות מרמת הבסיס (.0962 NS), שהוא בעצם רמת המוליכות הראשונה של הערוץ עצמו. איור 1:. סכמטית המתארים את החלקים העיקריים וממדים של מאגר נפט מאגר הנפט מיוצר במכונה החנות באוניברסיטת וירג'יניה טק. הוא מורכב מצינור אקריליק גלילי מכונה דבוקה אל פני השטח של גיליון אקריליק. ניתן לשנות את הממדים והעיצוב כדי להתאים ליישומים שונים או יותר משני micropipettes."Target =" _ /53362/53362fig1large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2:. ניסיון התקנה וmicropipettes הכנה () תחנת העבודה סטנדרטית ליצירה, מכאני גירוי, ואפיון הממשק bilayers כוללת מיקרוסקופ, מניפולטורים 3-ציר, מצלמה דיגיטלית, מתנד פיזואלקטריים, שולחן בידוד רעידות, וכלוב פאראדיי (לא מוצג). (ב) הגדרת הניסוי מורכבת משני micropipettes הידרוג'ל מולא PEG-DMA המנוגדים אופקי ממוקם בתוך אמבט של שמן hexadecane. כל אחד מmicropipettes מכיל אלקטרודה Ag / AgCl לספק חיבור חשמלי. Micropipette שלישי מלא בproteoliposome פתרון משמש כדי ליצור את הטיפות בקצה micropipettes האחר. (ג) בתגובה הנוכחית DIB יכולה להימדדבאמצעות שילוב של נתוני מערכת רכישת הרעש הנמוך המגבר והתיקון. (ד) סגר את התמונה המציגה את הטיפות מימיות נוצרו בקצה micropipettes. אלקטרודות (E) Ag / AgCl נעשות על ידי טבילת קצה שני 250 מיקרומטר חוטי כסף באקונומיקה. אז אלקטרודות מוזנות באמצעות שתי נימי הזכוכית בורוסיליקט מלאות בהידרוג'ל PEG-DMA, שהוא נרפא עם אור UV כדי לחזק. בעל microelectrode ישר עם מחבר זכר משמש לחיבור אחד של micropipettes לheadstage של מגבר התיקון. איור 3:. תמונות הממחישות את היווצרות bilayers ממשק אגל () micropipette 10 מיקרומטר מלאים proteoliposomes ממוקם מתחת למיקרוסקופ בסמוך לטיפי micropipette. באמצעות מזרק מחובר לmicropipette, לוותר נפחים קטניםשל proteoliposomes ליצירת טיפות כדוריות לעצמה רצויה. בואו טופס monolayer כך שהוא מאפשר את הטיפות לשבת במשך עשר דקות. להביא את הטיפות במגע; bilayer יהווה לאחר כל השמן בממשק מתבטל. (ב) בעוד bilayer נוצר, ההרכב הכימי בשני הצדדים של הממשק יכול להיות נשלט על ידי הזרקת כימיקלים רצויים באמצעות micropipette מיקרו בגודל. (ג) הטיפות ברגע של המגע הראשון. (ד) כאשר טיפות bilayer השומנים נוצר. איור 4: מדידות בזמן אמת להראות שני דילול הראשוני וההרחבה הבאה של הממשק נוכחי () נמדד במהלך היווצרות bilayer באמצעות היישום של פוטנציאל חשמלי משולש.. גודל הנוכחי נמדד הוא ביחס ישר לנפחים tance, ובכך האזור של ממשק bilayer. קרוב הטיפות הם הביאו יחד, גדולים יותר באזור של להיפך הממשק וסגן. (ב) במועד היישום של עירור מכאני, האזור של העליות וירידות ממשק bilayer באותה התדירות כמו אות המגרה. איור 5:. מדידות בזמן אמת להראות את התגובה של bilayer לעירור מכאני, כמו גם gating של המוטציה V23T של MscL הצורה של התגובה הנוכחית היא סינוסי, המתייחס לשינוי בסינוסי קיבול bilayer כתוצאה מ שינוי אזור bilayer. הקוצים הנוכחיים, המתרחשים בשיאו של כל מחזור, מצביעים gating תת-מוליכות של המוטציה V23T. עלילת קוטב נוספת מצביעה על כך שgating מתרחש בדחיסת שיא, המשקפת עלייה במתח בממשק bilayer. <p class="jove_content"> איור 6:. מדידות נוכחית תחת מהדק מתח והיסטוגרמה מקביל רמות מוליכות לפעילות gating ערוצי Alamethicin התאגדו gating ההתנהגות של הפפטיד Alamethicin מוצג דרך גידול הצעד חכם הבדיד בנוכחי. רמות המוליכות להתאים היטב עם מדידות קודמות שבוצעו על ידי קבוצת המחקר שלנו באוניברסיטת וירג'יניה טק 7.

Discussion

Mechanosensation מציין אחד מן המסלולים ההעברה החושיות הראשונות שהתפתחו ביצורים חיים. שימוש בתופעה זו ללימוד והבנה של מאפייני mechano-החשמלי של DIB, הוא צעד חיוני לחומרי גירויים מגיבים פונקציונליים. היא כרוכה בהתאגדות והפעלה של ערוץ mechanosensitive, MscL, בDIB כמתמר mechanoelectrical ומד לחץ כדי לזהות עליית מתח בממשק bilayer השומנים. בנימה אחרת, הפונקציה של ערוצי MS יכולה להיות מוסדרת באמצעות תכונות חומר הבסיסיות של bilayers שומנים כוללים עובי, עקמומיות פנימית, ודחיסות. לאור הנ"ל, הטכניקה מבוססת micropipette מספקת כלי רב ערך המאפשר לחוקר את היכולת ללמוד ערוצי MS בדיבס ומספק תובנות לתוך המבנה של bilayer השומנים, כמו גם את אינטראקציות שומנים החלבון.

במהלך שלוש עשר השנים האחרונותים, תיקון מהדק היה השיטה העיקרית ללמוד ערוצי MS, שכן הוא מאפשר הידוק של שני מתח ומתח. עם זאת, תיקון מהדק דורש ציוד יקר ולא מתאים למזעור, רכוש הנדרש להנדסה של מכשירים חושיים והמרה. דיבס בשל הפשטות, היציבות, והקומפקטיות שלהם לייצג סביבה מתאימה ללמוד את הפעילות של MscL. כאן, אנו מרחיבים התקדמות קודמת בטכניקות היווצרות DIB ידי מציע טכניקה מבוססת micropipette, עם היכולת לשלוט על הגודל של טיפות וממשק bilayer, את ההרכב הכימי של כל אגל, והמתח בממשק באמצעות גירוי דינמי. הטכניקה מורכבת של עיגון טיפות מימיות, המכיל proteoliposomes, לטיפים של coaxially מנוגדים נימי זכוכית. הטיפות ממוקמות באמבט של ממס אורגני וכאשר הביאו במגע צורות bilayer שומנים בממשק.

Micropipettes מחובר לעממתנדים iezoelectric, המאפשרים תזוזה אופקית של הטיפות. דינמי דחיסת הטיפות, תוצאות בעלייה של מתח interfacial בממשק שמן מים ולכן עלייה במתח bilayer. שני היבטים מרכזיים להבחין בשיטה זו מטכניקת bilayer בועת קשר דומה ושפורסם לאחרונה (CBB) 37. שימוש בטכניקה שהוצגה במסמך זה, בגודל של bilayer נשלט באמצעות micromanipulators וכך הכרכים של הטיפות יישארו קבועים, שלא כמו בשיטת CBB. בנוסף, טכניקת CBB קוראת למשאבות לחץ, שאין צורך בשיטה שהוצגה במאמר זה עושה את זה פשוט יותר וקל יותר לבנות.

אנו מסוגלים לשלב ולעורר MscL חיידקים בפעם הראשונה ללא שימוש בפיפטה תיקון או שינויים כימיים 38. מאז המערכת מאפשרת היווצרות קרום bilayer שומנים סימטרי חזק, זה מחקה את l הדוק יותרסימטריה איזה נר צריך לשים נמצאה בקרומים ביולוגיים. זה מאפשר לנו לחקור את ההשפעות של הרכב קרום מבוקר או חוסר סימטריה בפעילות של MscL. בנוסף, באמצעות טכניקות עיבוד תמונה, בשיטה זו מסייעת להעריך את המתח בממשק bilayer. טכניקה זו מסייעת בהבנת העקרונות של מרה הדדית בין כוחות בתפזורת והמשטח בDIB, מאפשר מדידות של נכסי קרום בסיסיים, ומשפר את ההבנה של תגובת MscL קרום מתח.

למרות ששיטה זו לוקחת צעד אחד קרוב יותר לכיוון מערכת חומר גירויים מגיבים biomolecular וסביבה פיזיולוגית השונה ללמוד MscL, יש מגבלות למערכת. מתח במערכת זו לא יכול להיות מהודק בשל נוכחותם של מאגר השומנים בצורה של יפוזומים בכל אגל, שנוטה להקל על מתח בממשק שמן / מים. לכן, בערוצי mechanosensitive הנוכחיים יכול להיות מגורהבדיבס רק במשטר דינמי. הנוכחות של בועות אוויר במערכת משפיעה באופן משמעותי את הדיוק ושחזור של הניסויים. בועות האוויר הנוכחיות בהידרוג'ל יכולות לגרום הפסד, אם חיבור חשמלי.

בעוד אנו מתארים את השימוש בשיטה המבוססת מיקרו-פיפטה לגירוי של MscL, הטכניקה יכולה לשמש כדי לחקור סוגים אחרים של ערוצי טרשת נפוצה ויש לו הפוטנציאל להיות בשימוש על ידי חוקרים ללמוד מגוון רחב של מולקולות ביולוגיות. לדוגמא, הגדרה דומה כבר בשימוש במעבדה שלנו כדי ללמוד את תגובת mechanoelectrical של קרום bilayer ממשק טיפה חינם ערוץ. חלבונים שונים יכולים להיות מחדש ומופעלים באמצעות התקנה מבוקרת מאוד זה, לוקחים בחשבון שסביבות הכינון מחדש של כל biomolecule להשתנות. השיטה המתוארת במאמר זה נוגעת בפוטנציאל יישום משמעותי רחב יותר שמוגבל רק לדמיונו של החוקר.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי חיל האוויר Office של מחקר המדעי בסיסי היוזמה גרנט FA9550-12-1-0464.

Materials

0.22 µm filter Corning 430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P Purchased as lyophilized powder
34-gauge microfil World Precision Instruments MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels ThermoFisher 3141 Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz Keysight Technologies 33220A
Ampicillian ThermoFisher BP1760 ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610000
Axio Scope.A1 Carl Zeiss –
AxioCam HSm Carl Zeiss –
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices –
BCA protein assay kit Pierce  23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Dialysis tubing 7 Spectra/Por 132113 MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system Molecular Devices –
DNAse Sigma-Aldrich DN25
DPhPC Avanti 850356C
E-625 PZT Servo-Controller  Physik Instrumente E-526
FPLC System Pharmacia Biotech –
HCl J.T. Baker 9535-33
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Homoginizer Wheaton 357426 15 mL
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Affymetrix 17886
IRGACURE® 2959 IRGACURE® 555047962
Isopore Membrane Filters  EMD Millipore VCTP02500
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
KCl Sigma-Aldrich P3911 ACS Grade
KH2PO4 Mallinckrodt 7100 ACS Grade
Kimble-Chase Kontes 420401-1515 Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System Electro-Lite, corp. 81170
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators Thorlabs PCS-520N
MgCl2 ThermoFisher M33 ACS Grade
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration Sigma-Aldrich M1254-100G
N2 Gas Airgas UN1066
NaCl EMD SX0420-1 ACS Grade
Ni NTA agarose beads Qiagen 1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID McMaster-Carr 8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator Physik Instrumente P-601
PAGE gel Bio-Rad 456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film Parafilm® PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate Polysciences, Inc. 15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk Sterlitech Corporation PCTB0425100
Potassium Chloride  Sigma-Aldrich P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm World Precision Instruments GO1-100
SDS Sigma-Aldrich L5750
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Azide Affymetrix 21610
Test tubes ThermoFisher 14-961-27 12 x 130 mm
Tryptone ThermoFisher BP1421
Ultracal 30K Millipore UFC803024 Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089
Water Purifier Barnstead D11931
Yeast ThermoFisher BP1422
β-octylglucopyranoside Anatrace O311S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).
  2. Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution. Nature. , (1966).
  3. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis. ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).
  5. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).
  6. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nat Nano. 4, 437-440 (2009).
  7. Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates. ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).
  8. Sarles, S. A., Leo, D. J. Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates. ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).
  9. Sarles, S. A. . Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).
  10. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).
  11. Sarles, S. A. The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers. SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).
  12. Sarles, S. A., Leo, D. J. Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials. SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).
  13. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).
  14. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).
  15. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. BIOPHYS J. 12, 432 (1972).
  16. Tien, H. T., Ottova, A. L. The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes. J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).
  17. Perozo, E. Gating prokaryotic mechanosensitive channels. NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).
  18. Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. Mechanosensitive channels in microbes. ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).
  19. Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria. PLoS ONE. 7, e33077 (2012).
  20. Levina, N., et al. Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity. The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).
  21. Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses. BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).
  22. Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL. J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).
  23. Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL. J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).
  24. Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations. PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).
  25. Kubalski, A., Martinac, B. . Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).
  26. Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282, 2220-2226 (1998).
  27. Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).
  28. Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. Structural models of the MscL gating mechanism. BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).
  29. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  30. Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension. NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).
  31. Corry, B., Jayatilaka, D. Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL. BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).
  32. Wang, Y., et al. Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL. eLife. 3, e01834 (2014).
  33. Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating. J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).
  34. Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. A light-actuated nanovalve derived from a channel protein. Science. 309, 755-758 (2005).
  35. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System. MRS Proceedings. 1621, (2014).
  36. Fox, R. O., Richards, F. M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution. Nature. 300, 325-330 (1982).
  37. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Sci Rep. 5, (2015).
  38. Barriga, H. M., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).

Tags

MicropipetteDroplet Interface BilayersMechanosensitive Ion ChannelsMscLMembrane TensionPiezoelectric ActuatorMembrane PropertiesAsymmetric MembranesBiomolecular Devices

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Najem, J. S., Dunlap, M. D., Yasmann, A., Freeman, E. C., Grant, J. W., Sukharev, S., Leo, D. J. Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. J. Vis. Exp. (105), e53362, doi:10.3791/53362 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image