Multifonctionnel, Micropipette à base Méthode de constitution et la stimulation de la société Bacterial mécanosensible Canaux ioniques en gouttelettes interface Bilayers

1. Préparation d'hydrogels de PEG-DMA Sélectionnez un récipient de mesure / mélange approprié (flacon, gobelet, etc.) Pour l'application. Nettoyez soigneusement avec du détergent et de l'eau, puis essuyez-le avec essuie chiffon non pelucheux. Portez des gants pour éviter de contaminer la verrerie avec les huiles du bout des doigts. Rincer le récipient avec de l'eau déminéralisée suffisant pour enlever les résidus de détergent. Essuyez le récipient avec un tissu non pelucheux pour se débarrasser de l'eau, puis vaporiser avec de l'alcool isopropylique (IPA, 99,5%) et essuyer jusqu'à ce que propre. Placez-le dans une chambre à vide pour permettre à tous IPA pour évaporer complètement. Nettoyez le reste du matériel de laboratoire utilisé dans le processus de formation d'hydrogel avec de l'eau distillée. Pour préparer un 40% (p / v) de solution de PEG-DMA hydrogel, pèse 4 g de poly (éthylène-glycol) diméthacrylate (PEG-DMA; MM = 1000 g / mol) polymère en utilisant une échelle de laboratoire. Placez le PEG-DMA pesé dans flacon et de la chaleur en utilisant un bain de sonication à 45-55 ° C jusqu'à ce que le solide PEG-DMA a liquéfié. Pendant le processus, couvrir l'ouverture de la fiole avec Parafilm papier / de cire pour empêcher l'eau. Une fois que le PEG-DMA a liquéfié, ajouter la solution tampon (500 mM de KCl, 10 mM de MOPS, pH 7,0) jusqu'à ce que le volume total atteint ~ 10 ml (suffisamment pour plusieurs expériences sur une période de six mois). Ajouter l'agent de durcissement à raison de 0,5% (p / v). Dans ce cas, ajouter 0,05 g de l'agent de durcissement au mélange 10 ml. Placer le ballon dans le bain de sonication et permettre aux composants de se dissoudre dans la solution (environ 10 min, à 250 watts). NOTE: Une fois que l'agent de durcissement a été ajouté à la solution, les hydrogels permet de guérir (consolider) en cas d'exposition à une source de lumière pour un laps de temps suffisant. Pour lutter contre cela, envelopper le flacon / récipient avec du ruban adhésif noir et le stocker dans un endroit sombre. Cette solution peut être conservée pendant plusieurs semaines à température ambiante (22 ° C). 2. Préparation de Liposomes Préparer 10 ml d'une / ml de solution de 2 mg de lipide par addition de 10 ml de tampon (500 mM de KCl, 10 mM de MOPS, pH 7,0) à 20 mg de 1,2-sn-glycéro-diphytanoyl- 3-phosphocholine (DPhPC) synthétique lipides achetés sous forme de poudre lyophilisée. Vérifiez que les deux vésicules lipidiques et solution tampon sont bien mélangés (le mélange doit avoir un aspect homogène et brumeux quand tout est dissous). Freeze (-20 ° C) et dégeler complètement le nouveau mélange de lipides pour un total de six fois. Laissez le dégel du mélange à la température ambiante, jamais dans un environnement chauffé. Utilisation d'une extrudeuse disponible dans le commerce, extruder les lipides tout en forçant la suspension de lipides à travers un filtre première membrane de polycarbonate de 0,4 um et ensuite six fois à travers un filtre de 0,1 um de la membrane. Ce procédé permet d'obtenir des particules ayant des diamètres proches de 100 nm (égal à la taille des pores du filtre). NOTE: D'autres lipides et les ratios lipidiques peut être préparé en utilisant cela methode. Liposomes doivent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs semaines. 3. Isolement et MscL Reconstitution Tués sur une plaque d'agarose de température, contenant 100 ug / ml d'ampicilline, E. MJF465 cellules coli avec un plasmide portant le gène pB10b V23T MscL prolongé avec une étiquette 6-His à l'extrémité 3 '(C-terminale). Permettre à la plaque de la nuit de la culture (12-16 h) à 37 ° C dans un incubateur stationnaire. Le plasmide est choisi et retenu dans les cellules avec 100 ug / ml d'ampicilline dans un milieu LB standard. Le prochain endroit de jour 20 ml de milieu LB avec 100 pg / ml d'ampicilline dans une vésicule de culture (un flacon de 50 ml ou de ce qui est disponible pour maintenir la culture). Prenez la plaque qui a été cultivé pendant une nuit, puis sélectionnez une colonie de la plaque de transfert (inoculer) au prêt de 20 ml du milieu LB avec un bâton inoculation stérile. Laisser la culture de 20 ml de croître pendant la nuit (12-16 h) à 37 ° C à 250 tpm dans un incubateur à agitation. Décanter le 20 ml overnculture ight dans 2-4 L de milieu LB. L'ampicilline est plus nécessaire. Agiter les flacons dans un incubateur à agitation à 250 tours par minute à 37 ° C jusqu'à DO 600 atteigne 0,5. Ajouter isopropilene β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,6 mM et laissez la culture aller pendant une heure (à DO600 = 0,8-1,0). Mettez les flacons sur la glace pour refroidir les cultures et collecter les bactéries par centrifugation. Utilisez six tubes coniques 400 ml (ou autant que permis par le rotor utilisé) et centrifuger pendant 5-8 min à 7438 xg qui est suffisant pour sédimenter les bactéries. Décanter le surnageant, et répéter la procédure jusqu'à ce que toutes les cellules des médias sont récoltées. Le nombre de tours requis varie en fonction de la quantité de la culture qui a été cultivé et le rotor utilisé. Pour un 2 L culture, il est seulement nécessaire de tourner vers le bas les cellules une fois. Transférez toutes les cellules récoltées dans un tube de centrifugeuse unique. Reprendre les culots cellulaires à ~ 20 ml de tampon de presse française (KP 100 mMi et 5 mM de MgCl2, pH 7,4). La suspension devrait être dense (comme la crème ou du lait). Immédiatement avant-français appuyant sur la suspension ajouter le fluorure de phénylméthylsulfonyle d'inhibiteur de protéase (PMSF) à une concentration finale de 2 mM et mélanger vigoureusement. Français-appuyez sur la culture, dans une cellule française de pression de 35 ml, à 10.000 à 16.000 psi. Isoler la suspension pour séparer les cellules non rompues à 7438 xg, 10 min à 4 ° C. Mettez le surnageant dans un tube séparé, et ajoutez-y le lysozyme et DNase (0,2 mg / ml chacun). Laissez-linge surnageant pendant 10 min à température ambiante. REMARQUE: DNase est facultative; elle réduit la viscosité de la centrifugation à grande vitesse. Le lysozyme est critique; il digère les restes de la paroi cellulaire et permet d'augmenter le rendement de l'extraction de la membrane fait avec un détergent doux non dénaturant. Distribuer le mélange de surnageant dans deux tubes d'ultracentrifugation et tourner eux à106,883-153,911 xg (selon le rotor) à 4 ° C pendant 40 min. Après centrifugation, le surnageant est décanté et le culot au fond brunâtre (la fraction totale de la membrane) peut être congelé dans le tube pour le stockage à long terme (- 80 ° C) ou utilisé pour la purification de la protéine immédiate. Préparer 0,5-1 L de tampon Haute Imidazole: 100 mM de NaCl + mM d'imidazole 500, titrer à pH 7,2-7,4 avec HCl concentré. Notez que imidazole est une bonne substance tampon par lui-même. Préparation de 0,5 à 1 L de tampon imidazole Low: NaCl 100 mM, imidazole 15 mM +, en diluant de manière appropriée avec le tampon ci-dessus 100 mM de NaCl. Aucun ajustement de pH est nécessaire. Prendre 100 à 150 ml de chaque tampon dans des flacons séparés, et à 1% (p / v) b-octyl glucopyranoside (OG). Bien agiter la solution et filtrer à travers un filtre de 0,22 um. Ces solutions sont les solutions de chromatographie basse et haute imidazole. Préparer tampon d'extraction, prendre 50 ml de tampon Basse-imidazole, et ajoutez 3% (p / v)OG et filtrer le tampon. Utilisez pastilles membranaires de 0,5-2 g de poids humide pour l'isolement de la protéine. Ajouter 5-7 ml de tampon d'extraction, resuspendre le culot, et l'homogénéiser dans un homogénéiseur verre-piston 30 ml entraînée à la main. Avec 5-10 caresses faire une suspension homogène sans grumeaux. Faites preuve de prudence, contrainte de cisaillement est connu pour provoquer la dénaturation des protéines. Isoler les particules insolubles (milieu de gamme de centrifugeuses, à angle fixe rotor, 38,478-68,405 XG, à 4 ° C pendant 15 min). Pendant ce temps, prendre 3 ml de perles Ni NTA (6 ml de suspension) et les laver une fois avec le tampon de faible imidazole (w / o OG) en les secouant dans un 15 ml à bouchon à vis tube. Laissez les billes se déposent sur le fond (~ 5-7 min) ou spin-les à 129-201 g pendant une minute à 4 ° C. Une fois la pastille est formée, décanter soigneusement le surnageant par la main et répétez la procédure. Equilibrer les billes avec 2-3 ml de tampon d'extraction de OG 3%. Mélanger le mélange homogénéisé (culot de membrane et un tampon d'extraction) à partir de trois.12 avec 3-3,5 ml perles Ni NTA. Laissez la chute de mélange dans un tube à bouchon à vis pour 60 min (lot-chargement). Faites tourner les billes vers le bas à 201 xg (30 sec), décanter le surnageant par la main, et se laver les billes avec 1% OG tampon faible imidazole fois. Pellet les perles comme en 3.13 à nouveau et remettre en suspension dans 20-30 ml de tampon frais à faible imidazole. Emportez une petite colonne (équipé d'une carte de débit supérieure) avec les perles Ni NTA, et laisser les perles se déposent en ouvrant le robinet de laisser le flux d'extrait à travers (ne pas laisser les perles à sec). Laver les billes avec une aliquote de 10 ml à faible imidazole tampons (1% OG) avec le robinet d'arrêt ouverte. Charger la machine de la chromatographie avec faible pur et de haute tampons imidazole à environ 25 ml de chaque à la vitesse d'écoulement de la machine défini (varie par machine); cela se fait par passage du tampon imidazole-bas par l'intermédiaire du premier système. Zéro l'enregistreur optique à 260 OD (ligne de base). Notez que le tampon est tout à fait différente de l'eau parce imidazole de bas grade a impurities qui absorbent les UV. Insérez l'adaptateur de courant à la colonne et l'attacher à la machine. Laver la colonne à nouveau avec un tampon à faible imidazole (à 1 ml / min) jusqu'à ce que la DO de l'écoulement à travers la ligne de base est atteint (il peut prendre 10-20 ml). Cela supprime les protéines non liées à partir de la colonne. Appliquer un gradient linéaire d'imidazole de 20 à 500 mM, pendant 30 minutes, à 1 ml / min. Début de la collecte fractions de 4 ml quand OD 600 montre une augmentation. Les deux premières fractions sont pleins de protéines liées de manière lâche, alors que MscL-6His commence son élution à environ 40% du gradient linéaire. La majorité de la protéine apparaît dans les fractions 3 à 8. REMARQUE: une augmentation linéaire de OD sera observée en raison de l'augmentation% d'imidazole. Rassembler les fractions 4/3, 6/5, 8/7 et ensemble. Eventuellement, on concentre les fractions individuellement. Concentrer les fractions 6-10 fois en utilisant des filtres centrifuges. Après un spin de 20 min à 804 xg et à 4 ° C, mélanger soigneusement la protéine concentrée,la protéine a tendance à coller au filtre. Retirer aliquotes de 50 ul, les mélanger avec un tampon d'échantillon SDS, et vérifier la pureté des protéines par électrophorèse sur gel de PAGE. REMARQUE: MscL migre comme une bande floue d'environ 17 kDa à la partie inférieure du gel. Les fractions concentrées à quantifier la protéine en utilisant un kit de dosage de protéine, en suivant les instructions du fabricant. Un rendement typique d'une membrane 0,8 g granulés est jusqu'à 0,2 mg de protéine pure dans les fractions combinées. Reconstituer V23T MscL dans des liposomes DPhPC par dialyse. Prendre une solution à 10 mg / ml de chloroforme et DPhPC aliquote de 0,5 ml (soit 5 mg de lipide) de celui-ci en trois jetable à fond rond (12 x 130 mm) des tubes de verre. Sécher le lipide sous le jet d'azote et enlever les restes de chloroforme sous vide (4-6 h). Ajouter 15 mg de 20 poudre OG au lipide sec dans chaque tube, le dissoudre dans 2 ml de tampon de dialyse (100 mM de KCl, 5 mM de KPi, pH 7,2), vortex, et misonicat ldly. Les lipides OG-solubilisé devraient former une solution claire. Ajouter V23T solutions concentrées MsCl dans chaque tube à atteindre 1: 100, 1: 300 et 1: 1,000 protéine-lipide à-vortex et ainsi des ratios. Couper et laver trois pièces (~ 12 cm de long) du tube de dialyse (MWCO 8000, diamètre de 7,5 mm, ont trois paires de clips numérotés prêts.) Placez les mélanges lipides-protéines solubilisées à l'intérieur du tube, fermer soigneusement les extrémités avec des clips, et dialyser contre 2 litres de tampon (100 mM de KCl, mM KPi 5, pH 7,2) pendant 48 heures à 4 ° C avec quatre changements de la tampon toutes les 12 heures. Après dialyse, les Proteo-liposomes sont prêts. REMARQUE: La solution de liposome peut être complété avec 2 mM de NaN3 (de l'azoture de sodium) et stocké à 4 ° C. Éviter le gel. 4. Fabrication du réservoir d'huile Percez deux trous opposés (1,0 mm de diamètre) tout le chemin à travers la paroi d'un diamètre de 2 pouces, 1,5 cm de long acrylique cylinder à 1 cm du fond (figure 1A). Percez deux trous de 4 mm concentriques à l'précédemment forés 1 mm trous. Les profondeurs des trous doit être de 1 mm chacune (assurez-vous de ne pas percer tout le chemin). Ces trous sont faites pour adapter les joints en caoutchouc. La place et de la colle de deux joints en caoutchouc ayant des diamètres internes de 1 mm dans les trous plus grands afin d'éviter les fuites d'huile. Collez le cylindre usiné pour 10 cm x 10 cm de la feuille acrylique mince en utilisant n'importe quel époxy polyvalente (Figure 1). Le jour de l'expérience: 5. Préparation d'électrodes Couper une longueur de 7 cm de deux fils d'argent 250 um de diamètre, puis plonger leurs conseils à l'eau de Javel pour deux heures pour former un chlorure d'argent (AgCl) de revêtement. Une couleur grise indique qu'un revêtement AgCl a été formé (figure 2E). Utilisation d'un coupe-verre, diviser un 10 cm de long, 1 / 0.58 OD / ID mm Capil de classe de borosilicatelary en deux 5 cm capillaires. En utilisant une aiguille de calibre 34 Microfil remplir les capillaires avec l'hydrogel PEG-DMA. Pour éviter l'hydrogel hydraté de l'enflure du capillaire, garder un dégagement de 3 mm sur les conseils et assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans les capillaires. Insérer les électrodes Ag / AgCl dans l'hydrogel rempli capillaires (figure 2e). Guérir l'hydrogel PEG-DMA par photopolymérisation radicaux libres lors de l'exposition à la lumière UV pendant 2 min à 1 W en utilisant un pistolet spot UV. 6. Configuration de l'Expérience NOTE: L'expérience est installé dans une cage de Faraday à la terre pour une connexion de terre de l'amplificateur de patch. Fixez l'un des micropipettes à un titulaire de microélectrodes droite qui a un connecteur mâle (figure 2E). Connectez le support de microélectrodes à l'headstage de l'amplificateur de patch (figure 2A). Pour connecter le HEAdstage à la terre, souder un fil de cuivre isolé de calibre 18 à un connecteur approprié pour le headstage. Montez le headstage sur un 3-axe micromanipulateur manuel. Fixez la plaque de montage headstage (il devrait être acheté avec le micromanipulateur ou fait sur mesure dans un atelier d'usinage) au micromanipulateur puis connectez le headstage à la plaque de montage en utilisant des vis appropriées. Attacher le deuxième micropipette à l'actionneur linéaire à travers un connecteur de laboratoire faites et ensuite monter à la fois sur un deuxième micromanipulateur (figure 2B). Les micropipettes devraient être opposés l'un à l'autre, alignés et nivelés horizontalement. Remarque: la marque et le style des manipulateurs ne comptent pas. Dans un flacon en verre, mélanger 0,1 ml de liposomes DPhPC avec 0,01 ml de la solution de protéoliposome V23T MscL. Remarque: Cette étape est nécessaire pour réduire le rapport protéines-lipides (~ 0,0002), ce qui est essentiel à la formation d'un lipide bilaye stabler. En utilisant une aiguille de calibre 34 Microfil, remplissez les conseils des deux micropipettes avec protéoliposome solution (figure 3A). Placez le réservoir sur le dessus d'un microscope droit, et de nourrir les micropipettes à travers les trous opposés 1 mm (figure 2B). REMARQUE: toute microscope pourrait être utilisé tant dans les gouttelettes peuvent être clairement visibles. Remplir le réservoir à la surface avec hexadécane (99%). L'hexadécane n'a pas besoin de purification ultérieure. Pour former les gouttelettes sphériques à la pointe des micropipettes, utiliser un troisième 10 um diamètre micropipette en verre borosilicate, monté sur un troisième micromanipulateur, pour distribuer la solution de V23T dilué MscL de protéoliposome (~ 0,00052 ml) à la pointe des micropipettes et former le des gouttelettes (figure 3). Contrôler la taille des gouttelettes (en diminuant ou en augmentant le volume) comme désiré et laisser reposer pendant 10 minutes pour former des monocouches de complètement (Figure 3). Amener les gouttelettes en contact, la formation de bicouche aura lieu dans 1 à 2 min. 7. Configuration du logiciel et de l'équipement Préparer le logiciel en tournant sur les ordinateurs, microscopes, contrôleur de l'oscillateur piézo-électrique, générateurs de fonctions, l'amplificateur de patch, et le système d'acquisition de données à faible bruit. REMARQUE: un amplificateur de patch peut être utilisé et les instructions suivantes sont spécifiquement pour celui que nous avons utilisé et qui est répertorié dans la liste des matériaux et de l'équipement. Sur le panneau avant de l'amplificateur de patch, de placer le bouton «Mode» pour VHOLD / IHOLD et V-Clamp. Sur le panneau avant réglé le "passe-bas" filtre de Bessel à 1 kHz et gain de sortie à 2. Réglez le "Configuration" à l'ensemble de β CELL = 1. Assurez-vous que le reste des boutons sont mis à zéro ou en position neutre. Échantillonner toutes les mesures actuelles DIB à 5 kHzavec un filtre de Bessel anti-aliasing de 1 kHz. Exécutez le logiciel en double-cliquant sur l'icône sur le bureau. Cliquez sur "Configurer> Digitizer" pour ouvrir la boîte de dialogue "Digitizer", puis cliquez sur le bouton "Modifier". Dans la boîte de dialogue "Changer Digitizer", sélectionnez "Digidata 1440 Series" de la liste "Digitizer Type". Cliquez sur le bouton Scan pour détecter le numériseur. Cliquez sur "OK" pour quitter la boîte de dialogue "Changer Digitizer", puis cliquez sur "OK" pour quitter la boîte de dialogue "Digitizer". Cliquez sur "Configurer> paillasse". Dans l'onglet Signaux d'entrée de la table de laboratoire, sélectionnez analogique dans un sous Digitizer Chaînes. Réglez le facteur d'échelle à 0,002. 8. La formation de la bicouche lipidique L'utilisation d'un câble BNC, branchez la sortie de awgénérateur aveform à l'avant d'entrée de commande externe commuté (sur le panneau arrière du système d'acquisition de données). Envoyer une forme d'onde 10 Hz, 500 mV crête-à-crête triangulaire à l'headstage. Utilisation du micromanipulateur, déplacer les micropipettes de verre horizontalement pour apporter les gouttelettes en contact jusqu'à ce qu'ils touchent légèrement et attendre bicouche amincissement de se produire (généralement autour de 1 à 2 min) (figures 3C et 3D). REMARQUE: La progression du processus de formation de la bicouche peut être vu visuellement au microscope et peut être contrôlée par la mesure du courant (figure 4). Ajuster la taille de la bicouche (~ 250 um de diamètre) en contrôlant la position de la gouttelette monté sur l'actionneur, à l'aide du micromanipulateur. Remarque: la taille de la bicouche peut être estimée visuellement à travers le microscope. Cette méthode rend plus facile pour le chercheur de contrôler la taille de la bicouche facilement pardéplacer les gouttelettes en utilisant les micromanipulateurs. 9. excitation dynamique et MscL Gating Une fois que le bicouche est formé et est stable (à savoir la double couche est non conductrice ou rupture), de stimuler les gouttelettes par l'envoi d'un signal sinusoïdal à l'aide d'un générateur de fonction. Pour stimuler la protéine MscL incorporé dans la bicouche, envoyer une onde sinusoïdale avec une amplitude de 175 um crête-à-crête, la fréquence de 0,2 Hz, et le cycle de service de 50% à la servo-contrôleur piézoélectrique. (Différents types de formes d'onde peuvent être envoyés avec des amplitudes différentes, les fréquences et cyclique) 10. Traitement et Interprétation des résultats Sauvegardez les mesures actuelles, enregistrées en utilisant le système d'acquisition de données, en format .ABF. Importation de données (en format .ABF) à Matlab en utilisant un fichier de fonction "abfload", puis analyser et traiter les données. Le fichier "abfload" est disponible gratuitement en ligne. Estimation til tension dans la bicouche et l'expansion de surface des gouttelettes, en utilisant des vidéos de la goutte pendant les cycles d'actionnement complets qui sont enregistrés à l'aide d'une caméra appropriée. Vidéos de processus dans Matlab, par le traitement des images individuelles en utilisant des techniques de traitement d'image pour estimer la superficie de l'interface eau / huile, ainsi que l'angle entre les gouttelettes. NOTE: l'utilisation d'une trame 2D prise de la vidéo, la détection de l'interface eau-huile (par exemple le bord de la goutte), puis estimer la surface de révolution.