JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

متعددة الوظائف، طريقة Micropipette القائم لتأسيس وتحفيز القنوات Mechanosensitive البكتيرية ايون في القطرة واجهة طبقات ثنائية

Published: November 19, 2015
doi:
10.3791/53362
, , , , , ,
1Department of Mechanical Engineering,Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Biomedical Engineering and Sciences,Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biology,University of Maryland, 4College of Engineering,University of Georgia, 5Department of Engineering Sciences and Mechanics,Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

قنوات mechanosensitive البكتيرية ويمكن استخدام محولات mechanoelectrical في الأجهزة الجزيئية البيولوجية. طبقات ثنائية اجهة قطرة (الدبس)، اللبنات مستوحاة من الخلية إلى هذه الأجهزة، وتمثل منصات جديدة لدمج وتحفيز قنوات mechanosensitive. هنا، علينا أن نظهر طريقة القائم على micropipette الجديد من تشكيل الدبس، والسماح للدراسة قنوات mechanosensitive تحت التحفيز الميكانيكي.

Abstract

MscL، قناة mechanosensitive تصرف كبير (MSC)، هو في كل مكان صمام الافراج osmolyte التي تساعد البكتيريا على قيد الحياة صدمات للفراش لا تسبب الاسموزي مفاجئة. وقد تم اكتشاف ودرس بدقة باستخدام تقنية التصحيح، المشبك لثلاثة عقود تقريبا. دورها الأساسي في ترجمة التوتر تطبق على غشاء الخلية في الاستجابة نفاذية يجعله مرشحا قويا لتكون بمثابة محول mechanoelectrical في الأجهزة الجزيئية البيولوجية التي تعتمد على الأغشية الاصطناعية. بمثابة اللبنات لمثل هذه الأجهزة، طبقات ثنائية اجهة قطرة (الدبس) ويمكن استخدام منصة جديدة لإدراج وتنشيط قنوات MscL. هنا، نحن تصف طريقة القائم على micropipette لتشكيل الدبس وقياس النشاط القنوات MscL يدمج. يتكون هذا الأسلوب من قطرات المغطى الدهون المائية ترتكز على نصائح من اثنين من المعارضين (وضع محوري) بال micropipettes الزجاج البورسليكات. عندما يتم إحضارها قطرات على اتصال، واجهة الدهون طبقة ثنائية هوشكلت. هذه التقنية تتيح السيطرة على التركيب الكيميائي وحجم كل قطيرة، فضلا عن أبعاد واجهة طبقة ثنائية. وجود واحد من بال micropipettes تعلق على المحرك كهرضغطية التوافقي يوفر القدرة على تقديم الحوافز متذبذبة المطلوب. من خلال تحليل الأشكال من قطرات خلال تشويه، والتوتر الناجم في واجهة يمكن تقدير. باستخدام هذه التقنية، فقد ذكر أن النشاط الأول من القنوات MscL في نظام بنك دبي الإسلامي. إلى جانب قنوات MS، أنشطة أنواع أخرى من القنوات يمكن دراستها باستخدام هذه الطريقة، التي تثبت وظائف متعددة من هذا المنبر. الطريقة المعروضة هنا يمكن قياس خصائص الغشاء الأساسي، ويوفر سيطرة أكبر على تشكيل الأغشية المتماثلة وغير المتماثلة، وهي وسيلة بديلة لتحفيز ودراسة قنوات mechanosensitive.

Introduction

في العقد الماضي، والتجمع من طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية قد تقدمت بشكل كبير من خلال تطوير أسلوب طبقة ثنائية اجهة الحبرية. المعروفة باسم مستقرة وقوية، فرضت الدبس أنفسهم نظم بديلة لنموذج الكلاسيكية رسمت (مولر) ومطوية طبقات ثنائية (مونتال-مولر) مستو 1. على الرغم من أن فكرة استخدام قطرات لخلق طبقات ثنائية الدهون يعود إلى 1960s 2، فإنه لم اكتسب شعبية حتى وقت قريب. وذكر أول محاولة ناجحة من قبل مجموعة Takeushi 3، تليها عدة دراسات تثبت تشكيل طبقة ثنائية باستخدام شبكة قطرات من قبل مجموعة بايلي 4-6. وفي الآونة الأخيرة، تم اقتراح أساليب التغليف من قبل مجموعة ليو 7-9، الذي كان رائدا في مفهوم استخدام الدبس لبنات بناء نظم المواد رواية المحفزات التي تستجيب 10. في دراسات سابقة، أثبتت الدبس قدرتها على الرد على الكهرباء 9،11، كيمياءكال 10،12، والبصرية المحفزات 13. الجزيئات الحيوية المختلفة مع وظائف المحفزات استجابة مختلفة قد حفز على نحو فعال عندما أعيد في بنك دبي الإسلامي 10،14. في ضوء هذه المحاولات الناجحة أثير سؤال مهم: يمكن أن تستجيب DIB إلى التحفيز الميكانيكي عندما يتم دمج الجزيئات الحيوية المناسبة؟ قوات بينية بناء على DIB تختلف عن تلك الموجودة في غيرها من 15،16 نظام طبقة ثنائية. لذا، يمكن السيطرة على التوتر في طبقة ثنائية عقدت من قبل قطرات من خلال تنظيم التوتر في الواجهات المائية الدهون النفط. مفهوم لا ينطبق مع أنظمة طبقة ثنائية رسمت أو مطوية.

قنوات MscL، المعروف على نطاق واسع صمامات الإفراج osmolyte والعناصر الأساسية للغشاء هيولي البكتيرية، والرد على زيادة التوتر غشاء 17،18. في حالة حدوث صدمات للفراش لا تسبب ناضح، وعدة قنوات المقيمين في غشاء خلية صغيرة يمكن أن تولد 19 ماساستجابة نفاذية SIVE للافراج بسرعة الأيونات والجزيئات الصغيرة، وتوفير البكتيريا من تحلل 20. Biophysically، MscL تدرس بشكل جيد وتتميز في المقام الأول من خلال التصحيح بارز المشبك تقنية 21-23. واقترح النماذج الهيكلية موثوقة شرح آلية النابضة 24،25 MscL على أساس هيكل homolog لها من الكريستال 26،27، والنمذجة 28، ونتائج التجارب واسعة النطاق 24،29-31. في ظل التوتر التطبيقية ~ 10 مليون / م، وقناة المغلقة التي تتكون من حزمة ضيقة من اللوالب عبر الغشاء، يتحول إلى حلقة من اللوالب يميل كثيرا تشكيل ~ 28 Å مملوءة بالماء المسام موصل 21،24،32. كما تم إثبات أن للا مائية من البوابة الضيقة المتمركزة عند تقاطع المجالات TM1 الداخلية، ويحدد عتبة تفعيل القناة 33. في المقابل، وجد أن من خلال خفض للا مائية من البوابة، والتوتر السطحييمكن خفض ن عتبة 22. جعلت هذه الخاصية من MscL الممكنة تصميم مختلف صمامات التحكم 34، في المقام الأول لأغراض تسليم المخدرات. لكافة الخصائص المذكورة أعلاه، واستنادا إلى دورها الأساسي في ترجمة غشاء الخلية التوتر المفرط في الأنشطة الكهربية، MscL يجعل خيارا مثاليا كما محول mechanoelectrical في الدبس.

في هذه المقالة، نقدم طريقة القائم على micropipette الأصلي لتشكيل الدبس وقياس النشاط القنوات MscL تأسست بموجب التحفيز الميكانيكي. نفيدكم للمرة الأولى، استجابة الدبس إلى التحفيز الميكانيكي وإعادة الوظيفية متحولة V23T منخفضة عتبة MscL في الدبس 35.

يتكون النظام التجريبي من الدهون المغطى قطرات المائية ترتكز على نصائح من اثنين من المعارضين بال micropipettes الزجاج البورسليكات. فإذا ما وضعنا قطرات على اتصال واجهة طبقة ثنائية الدهون هو FOrmed. هذه التقنية تتيح السيطرة على التركيب الكيميائي وحجم كل قطرة (بالجملة)، فضلا عن أبعاد واجهة طبقة ثنائية. وبالإضافة إلى ذلك، والأغشية غير متكافئة مع مختلف مكونات الدهون في كل نشرة يمكن تشكيلها بسهولة. وجود واحد من بال micropipettes تعلق على المحرك كهرضغطية التوافقي، ويوفر القدرة على تطبيق دورة واحدة مبرمجة مسبقا أو التحفيز متذبذبة. يتم تسليم التوتر إلى غشاء اصطناعي من خلال ضغط كل من قطرات دعمها. ونتيجة لقطرات تشوه، مجالات المياه الدهون النفط واجهات الزيادة، في وقت واحد الزاوية بين قطرات النقصان، مما تسبب في زيادة التوتر الغشاء وتفعيل MscL عابر. من خلال تحليل الأشكال من قطرات خلال تشويه، ويمكن تقدير التوتر التي تم إنشاؤها في الواجهة. على الرغم من أن التركيز في هذه المقالة على خصائص والميكانيكية تنبيغ من بنك دبي الإسلامي، فإننا نؤكد أيضا أن أنواع أخرى من الحيويةالجزيئات، مثل alamethicin، يمكن تفعيلها من خلال هذه المنصة متعددة الوظائف. نقدم هنا، كل الجوانب التقنية لإعداد وتجميع، وأخذ القياسات مع هذا الأسلوب الجديد بطريقة خطوة بخطوة.

Protocol

1. إعداد PEG-DMA الهلاميات المائية اختيار القياس المناسب / خلط حاوية (قارورة، دورق، الخ.) للتطبيق. تنظيفه جيدا باستخدام المنظفات والماء، ثم يمسح عليه مع مساحات الأنسجة خالية من الوبر. ارتداء القفازات لتجنب تلويث الأواني الزجاجية مع الزيوت من أطراف الأصابع. شطف الحاوية بالماء منزوع الأيونات يكفي لإزالة بقايا المنظفات. مسح الحاوية مع الأنسجة خالية من الوبر للتخلص من الماء، ثم رش مع ايزوبروبيل (IPA، 99.5٪) ويمسح حتى نظيفة. وضعه في فراغ الغرفة للسماح لجميع IPA لتتبخر تماما. تنظيف ما تبقى من معدات المختبرات التي تستخدم في عملية تشكيل هيدروجيل مع الماء المقطر. لإعداد 40٪ (ث / ت) حل PEG-DMA هيدروجيل، تزن 4 غرام من بولي (إيثيلين غليكول) dimethacrylate (PEG-DMA، MW = 1000 جم / مول) البوليمر باستخدام نطاق المختبر. وضع وزنه PEG-DMA في قارورة والحرارة باستخدام sonicator باث في 4وقد المسال 5-55 درجة مئوية حتى الصلبة PEG-DMA. وخلال هذه العملية، تغطية افتتاح قارورة مع parafilm ورقة / الشمع للحفاظ على المياه. بمجرد المسال في PEG-DMA، إضافة حل العازلة (500 ملي بوكل، 10 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0) إلى أن يصل إجمالي حجم ~ 10 مل (بما فيه الكفاية لعدة تجارب على مدى فترة ستة أشهر). إضافة كيل المعالجة عند 0.5٪ (ث / ت). في هذه الحالة، إضافة 0،05 غرام من وكيل علاج إلى الخليط 10 مل. ضع قارورة مرة أخرى في sonicator باث، والسماح للمكونات لتذوب في الحل (حوالي 10 دقيقة، 250 واط). ملاحظة: مرة واحدة تم إضافة كيل المعالجة إلى الحل، والهلاميات المائية علاج (يصلب) إذا تعرضت إلى أي مصدر للضوء لفترة كافية من الوقت. للمساعدة في مكافحة هذا، والتفاف القارورة / حاوية مع شريط أسود وتخزينها في مكان مظلم. ويمكن تخزين هذا الحل لعدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة (22 ° C). 2. إعداد LiposOMES إعداد 10 مل من 2 ملغ / مل حل الدهون بإضافة 10 مل من العازلة (500 ملي بوكل، 10 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0) إلى 20 ملغ من 1،2-diphytanoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DPhPC) الاصطناعية الدهون شراؤها على شكل مسحوق مجفف بالتجميد. جعل الحويصلات من كلا الدهون وحل العازلة خلطا جيدا (خليط ينبغي أن ننظر متجانسة وضبابي عندما يذوب كل شيء). تجميد (-20 ° C)، وذوبان الجليد تماما خليط الدهن جديد لمجموعه ست مرات. السماح للذوبان الخليط في درجة حرارة الغرفة، أبدا في بيئة ساخنة. باستخدام الطارد المتاحة تجاريا، قذف الدهون عن طريق إجبار تعليق الدهن كله أولا من خلال 0.4 ميكرون فلتر غشاء البولي ومن ثم ست مرات خلال مرشح 0.1 ميكرون الغشاء. هذه العملية ينتج جزيئات بأقطار قرب 100 نانومتر (مساو لحجم المسام للمرشح). ملاحظة: الدهون الأخرى ونسب الدهون يمكن إعدادها باستخدام هذا ليثود. يجب أن يتم تخزين الجسيمات الشحمية في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع. 3. MscL عزل وإعادة إعماره خط من لوحة درجة حرارة الاغاروز، تحتوي على 100 ​​ميكروغرام / مل الأمبيسلين، E. خلايا القولونية MJF465 مع البلازميد pB10b تحمل الجين V23T MscL موسعة مع 6-صاحب علامة على نهاية 3 '(C-المحطة). تسمح لوحة ليلة وضحاها ثقافة (12-16 ساعة) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة. يتم تحديد البلازميد لوالاحتفاظ في زنزانات مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في معيار LB المتوسطة. المكان اليوم التالي 20 مل من LB وسائل الإعلام مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في الحويصلة زراعة (قارورة 50 مل أو ما هو متاح لعقد ثقافة). تأخذ اللوحة التي تم زرعها بين عشية وضحاها وحدد مستعمرة من لوحة لنقل (تطعيم) إلى استعداد 20 مل LB سائل الإعلام مع التلقيح عصا العقيمة. السماح للثقافة 20 مل لتنمو بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) عند 37 درجة مئوية في 250 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز. صب 20 مل overnثقافة آيت إلى 2-4 L من LB المتوسطة. لم تعد هناك حاجة الأمبيسلين. يهز القوارير في حاضنة تهتز في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية حتى OD 600 تصل إلى 0.5. إضافة الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى التركيز النهائي من 0.6 ملم، والسماح للثقافة تذهب لمدة ساعة أخرى (إلى OD 600 = 0،8-1،0). وضع قوارير على الجليد للبرد والثقافات ومن ثم جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي. استخدام ستة أنابيب مخروطية 400 مل (أو ما يصل إلى المسموح به من قبل الدوار المستخدمة) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5-8 دقيقة في 7438 x ج وهو ما يكفي لتكوير البكتيريا. صب طاف، وكرر الإجراء حتى يتم حصاد كل الخلايا من وسائل الإعلام. يختلف عدد يدور المطلوبة على أساس كمية من الثقافة التي قد نمت والدوار المستخدمة. من أجل ثقافة 2 L هناك حاجة فقط لتدور باستمرار خلايا مرة واحدة. نقل جميع الخلايا التي تحصد في أنبوب الطرد المركزي واحد. Resuspend وكريات خلية في ~ 20 مل من العازلة الصحافة الفرنسية (100 ملي KPط و 5 ملي MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.4). يجب أن يكون التعليق الكثيفة (مثل كريم أو الحليب). مباشرة قبل بالفرنسية الضغط على تعليق إضافة phenylmethylsulfonyl فلوريد مثبط البروتياز (PMSF) إلى تركيز النهائي من 2 مم ومزيج بقوة. الصحافة الفرنسية في الثقافة، في 35 مل خلية الضغوط الفرنسية، في 10،000 إلى 16،000 رطل. تدور باستمرار تعليق لفصل الخلايا غير منقطعة في 7438 x ج، 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. وضع طاف في أنبوب منفصل، وإضافة إلى ذلك الليزوزيم والدناز (0.2 ملغ / مل لكل منهما). السماح تعثر طاف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: الدناز هو اختياري. أنه يقلل من لزوجة لالطرد المركزي عالية السرعة. الليزوزيم أمر بالغ الأهمية. فإنه يساعد على هضم بقايا جدار الخلية ويساعد على زيادة العائد من استخراج غشاء القيام به مع معتدل المنظفات غير تغيير طبيعة. توزيع مزيج طاف في أنبوبين نابذة فائقة السرعة وتدور لهم في106،883-153،911 x ج (اعتمادا على الدوار) في 4 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد الطرد المركزي ويصب في وطاف بيليه البني في الجزء السفلي (مجموع جزء الغشاء) يمكن تجميد في أنبوب للتخزين على المدى الطويل (- 80 ° C) أو تستخدم لتنقية البروتين فورية. إعداد 0.5-1 L العازلة عالية إيميدازول: 100 ملي كلوريد الصوديوم + 500 ملي إميدازول يعاير إلى الرقم الهيدروجيني 7،2-7،4 مع حمض الهيدروكلوريك المركز. لاحظ أن إميدازول هو عبارة عن مادة التخزين المؤقت جيدة في حد ذاته. إعداد 0.5-1 L العازلة منخفضة إيميدازول: 100 ملي كلوريد الصوديوم، + 15 ملي إميدازول عن طريق تمييع مناسب عازلة فوق مع 100 ملي كلوريد الصوديوم. لا يلزم ضبط الأس الهيدروجيني. اتخاذ 100-150 مل من كل عازلة في زجاجات منفصلة، ​​وإضافة 1٪ (ث / ت) glucopyranoside ب-الأوكتيل (OG). يحرك جيدا حل وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون. هذه الحلول هي حلول اللوني المنخفضة والعالية إميدازول. إعداد العازلة استخراج، واتخاذ 50 مل من العازلة منخفض إميدازول وإضافة 3٪ (وزن / حجم)OG وتصفية العازلة. استخدام الكريات غشاء من 0.5-2 غرام من الوزن الرطب للبروتين العزلة. إضافة 5-7 مل من استخراج العازلة، resuspend الكرية، والتجانس في 30 مل يحركها ناحية الزجاج مكبس الخالط. مع 5-10 السكتات الدماغية لطيف جعل التعليق متجانس بدون كتل. توخي الحذر، ومن المعروف إجهاد القص للتسبب تمسخ البروتين. تدور باستمرار الجسيمات غير القابلة للذوبان (متوسطة المدى الطرد المركزي، زاوية ثابتة الدوار، 38،478-68،405 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة). وفي الوقت نفسه، يستغرق 3 مل من الخرز ني NTA (6 مل من تعليق) وغسلها مرة واحدة مع المخزن المؤقت المنخفض إميدازول (ث / س OG) التي تهتز لها في 15 مل المسمار الحد الأقصى للأنبوب. السماح للالخرز تستقر في القاع (~ 5-7 دقيقة) أو تدور عليهم في 129-201 x ج لمدة دقيقة واحدة على 4 ° C. مرة واحدة يتم تشكيل بيليه، صب بعناية طاف من جهة، وكرر الإجراء. تتوازن الخرز مع 2-3 مل من 3٪ استخراج العازلة OG. مزج الخليط المتجانس (بيليه الغشاء واستخراج العازلة) من 3.12 مع 3-3.5 مل الخرز ني NTA. السماح للتعثر المزيج في أنبوب المسمار الحد الأقصى لمدة 60 دقيقة (دفعة التحميل). تدور حبات أسفل في 201 x ج (30 ثانية)، صب طاف من جهة، وتغسل حبات مع 1٪ OG عازلة الاسعار المنخفضة للإميدازول مرة واحدة. بيليه الخرز كما في 3.13 ثانية و resuspend لهم في 20-30 مل من العازلة المنخفض إميدازول الطازجة. حزمة عمود صغير (مجهزة بمحول تدفق العلوي) مع حبات ني NTA، والسماح للالخرز تسوية عن طريق فتح محبس السماح للتدفق من خلال استخراج (لا تسمح حبات لتجف). تغسل حبات مع قسامة واحدة من 10 مل العازلة المنخفض إميدازول (1٪ OG) مع وقف الديك مفتوحة. تحميل آلة اللوني مع منخفضة نقية وعالية إميدازول مخازن حوالي 25 مل من كل في الجهاز تعريف معدل التدفق (تختلف حسب الجهاز). يتم ذلك عن طريق تمرير المخزن المؤقت المنخفض إميدازول من خلال النظام أولا. صفر البصرية مسجل في OD 260 (خط الأساس). لاحظ أن المخزن المؤقت يختلف تماما عن الماء لدرجة منخفضة إميدازول له طmpurities التي تمتص الأشعة فوق البنفسجية. إدراج محول تدفق إلى العمود وضمها الى الجهاز. غسل العمود مرة أخرى مع العازلة المنخفض إميدازول (في 1 مل / دقيقة) حتى OD من خلال تدفق يأتي تصل إلى خط الأساس (قد يستغرق 10-20 مل). هذا يزيل البروتينات غير منضم من العمود. تطبيق التدرج الخطي للإميدازول من 20-500 ملم، لمدة 30 دقيقة، في 1 مل / دقيقة. البدء في جمع 4 مل الكسور عندما يظهر OD 600 زيادة. الكسور الأولين مليئة البروتينات ملزمة فضفاضة، في حين MscL-6His يبدأ شطف في ~ 40٪ من الانحدار الخطي. تظهر معظم البروتين في الكسور 3-8. ملاحظة: ارتفاع خطية من OD وسيراعى نظرا ل٪ زيادة من إميدازول. تجميع الكسور 3-4، 5-6، 7-8، وجنبا إلى جنب. اختياريا، والتركيز على أجزاء منفردة. التركيز الكسور 6-10 أضعاف باستخدام مرشحات الطرد المركزي. بعد زيادة ونقصان 20 دقيقة في 804 x ج وعند 4 درجات مئوية، و resuspend بعناية البروتين المركزة،البروتين يميل إلى التمسك التصفية. سحب 50 مكل، مزجها مع SDS عينة العازلة، والتحقق من وجود البروتين نقاء باستخدام هلام PAGE الكهربائي. ملاحظة: سوف MscL الهجرة والفرقة غامض من حوالي 17 كيلو دالتون إلى الجزء السفلي من هلام. استخدام الكسور المركزة لقياس البروتين باستخدام طقم فحص البروتين، بعد تعليمات الشركة المصنعة. A العائد نموذجي من 0.8 ز غشاء بيليه هو ما يصل الى 0.2 ملغ من البروتين النقي في الكسور مجتمعة. إعادة V23T MscL في الجسيمات الشحمية DPhPC من خلال غسيل الكلى. تأخذ 10 ملغ / مل حل الكلوروفورم من DPhPC وقسامة 0.5 مل (أي 5 ملغ من الدهون) منه إلى ثلاث المتاح مستديرة أسفل (12 × 130 ملم) أنابيب زجاجية. تجفيف الدهون تحت سيل من النيتروجين وإزالة بقايا الكلوروفورم في ظل فراغ (4-6 ساعة). إضافة 15 20 ملغ من OG المجفف إلى الدهون الجافة في كل أنبوب، ويحل في 2 مل من العازلة غسيل الكلى (100 ملي بوكل، 5 ملي KPI، ودرجة الحموضة 7.2)، دوامة، وميليصوتن ldly. ينبغي أن الدهون-solubilized OG تشكل حلا واضحا. إضافة حلول V23T MscL المركزة إلى كل أنبوب لتحقيق 1: 100، 1: 300 و 1: 1000 البروتين إلى الدهون النسب ودوامة جيدا. قطع ويغسل ثلاث قطع (~ 12 سنتيمترا) من أنابيب غسيل الكلى (MWCO 8000، 7.5 مم، ولها ثلاثة أزواج من مقاطع مرقمة جاهزة.) وضع solubilized خليط من الدهون والبروتينات داخل الأنبوب، أغلق بعناية ينتهي مع لقطات، وdialyze ضد 2 L العازلة (100 ملي بوكل، 5 ملي KPI، pH7.2) لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية مع أربعة تغييرات لل العازلة كل 12 ساعة. بعد غسيل الكلى، وPROTEO-الجسيمات الشحمية جاهزة. ملاحظة: يمكن أن يستكمل الحل الحويصلية مع 2 ملم من NaN3 (أزيد الصوديوم) وتخزينها في 4 درجات مئوية. تجنب التجميد. 4. تصنيع البترول من الخزان حفر اثنين من الثقوب معارضة (1.0 ملم في القطر) على طول الطريق من خلال جدار يبلغ قطرها 2 بوصة، 1.5 سم سيل الاكريليك طويلةاندر في 1 سم من الأسفل (الشكل 1A). حفر اثنين من الثقوب 4 مم متحدة المركز إلى حفر السابق 1 مم الثقوب. يجب أعماق الثقوب يكون كل 1 ملم (تأكد من عدم حفر كل وسيلة). وتتكون هذه الثقوب لتتناسب مع مقاطع المطاط. مكان والغراء اثنين من المطاط والحشايا وجود أقطار 1 مم الداخلية في ثقوب أكبر من أجل منع النفط من تسريب المعلومات. الغراء الاسطوانة تشكيله إلى 10 سم × 10 سم الاكريليك ورقة رقيقة باستخدام أي الايبوكسي متعددة الأغراض (الشكل 1). في يوم من التجربة: 5. إعداد أقطاب قطع بطول 7 سم من اثنين من الأسلاك الفضة 250 ميكرون قطر، ومن ثم تزج نصائح في التبييض لمدة ساعتين لتشكيل الفضة وكلوريد (أجكل) الطلاء. A اللون الرمادي يشير إلى أن طلاء أجكل وقد تم تشكيل (الشكل 2E). استخدام قطع الزجاج، وتقسيم 10 سم طويلة، 1 / ​​0.58 OD / ID ملم الطبقة البورسليكات capilلاري الى قسمين 5 سم الشعيرات الدموية. باستخدام قياس 34 إبرة microfil تملأ الشعيرات الدموية مع هيدروجيل PEG-DMA. لمنع هيدروجيل رطب من تورم من الشعيرات الدموية، والحفاظ على إزالة 3 ملم على نصائح والتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الشعيرات الدموية. إدراج الأقطاب حج / أجكل في هيدروجيل شغل في الشعيرات الدموية (الشكل 2E). علاج هيدروجيل PEG-DMA من خلال بلمرة ضوئية المنشأ الجذور الحرة عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 دقيقة في 1 W باستخدام بندقية بقعة الأشعة فوق البنفسجية. 6. إعداد التجربة ملاحظة: إن التجربة هي الإعداد تحت قفص فاراداي ترتكز على اتصال الأرض على مكبر للصوت التصحيح. نعلق واحدة من بال micropipettes إلى حائز على التوالي مسرى مكروي التي تحتوي على الرابط الذكور (الشكل 2E). ربط حامل مسرى مكروي إلى headstage من مكبر للصوت التصحيح (الشكل 2A). لربط هيئة التعليم العاليdstage إلى الأرض، جندى من قياس 18 الأسلاك النحاسية المعزولة إلى الموصل المناسب لheadstage. تحميل headstage على 3 محاور اليدوي micromanipulator. نعلق لوحة headstage تركيب (يجب أن اشتراها جنبا إلى جنب مع micromanipulator أو العرف في متجر للآلة) إلى micromanipulator ثم قم بتوصيل headstage إلى لوحة التركيب باستخدام مسامير المناسبة. إرفاق micropipette الثاني إلى المحرك الخطي من خلال موصل من صنع المختبر ومن ثم تحميل كل من على micromanipulator الثاني (الشكل 2B). على بال micropipettes يجب أن تعارض بعضها البعض، الانحياز، وعادل أفقيا. ملاحظة: علامة تجارية ونمط من المتلاعبين لا يهم. في قارورة زجاجية، خلط 0.1 مل من الجسيمات الشحمية DPhPC مع 0.01 مل من محلول proteoliposome V23T MscL. ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه الخطوة للحد من نسبة البروتين إلى الدهون (~ 0.0002)، وهو أمر حيوي لتشكيل bilaye الدهون مستقرةص. باستخدام قياس 34 microfil إبرة، وملء نصائح لكلا بال micropipettes مع proteoliposome الحل (الشكل 3A). وضع الخزان على رأس المجهر تستقيم، وإطعام بال micropipettes من خلال معارضة 1 مم الثقوب (الشكل 2B). ملاحظة: يمكن استخدام أي المجهر طالما في قطرات يمكن رؤيتها بوضوح. ملء الخزان على السطح مع سداسي (99٪). وسداسي لا تحتاج إلى مزيد من التنقية. لتشكيل قطرات كروية في غيض من بال micropipettes، استخدم الثالث 10 ميكرون قطر الزجاج البورسليكات micropipette، التي شنت على micromanipulator الثالث، إلى الاستغناء V23T مخففة حل MscL proteoliposome (~ 0.00052 مل) على نصائح من بال micropipettes وتشكيل قطرات (الشكل 3). التحكم في حجم قطرات (عن طريق خفض أو زيادة حجم) كما هو مطلوب والسماح لهم راحة لمدة 10 دقيقة لالطبقات الوحيدة لتشكيل تماما (Figure 3). جعل قطرات على اتصال، سيحدث تشكيل طبقة ثنائية ضمن 1-2 دقيقة. 7. إعداد برامج ومعدات إعداد البرنامج عن طريق تشغيل أجهزة الكمبيوتر، المجهر، تحكم مذبذب كهرضغطية والمولدات وظيفة، مكبر للصوت التصحيح، وانخفاض الضوضاء نظام الحصول على البيانات. ملاحظة: أي مكبر للصوت التصحيح ويمكن استخدام والتعليمات التالية على وجه التحديد لواحد ونحن المستخدمة والتي تم سردها في قائمة المواد والمعدات. على اللوحة الأمامية من مكبر للصوت التصحيح، تعيين "وضع" المقابض لVHOLD / IHOLD وV-CLAMP. على اللوحة الأمامية تعيين "أم بي" بسل تصفية إلى 1 كيلو هرتز والمخرجات الربح إلى 2. تعيين "تكوين" إلى الجامعة CELL β = 1. تأكد من تعيين ما تبقى من المقابض إلى الصفر أو في موقف محايد. عينة جميع القياسات الحالية ديب في 5 كيلو هرتزمع 1 كيلو هرتز بسل تصفية تنعيم. تشغيل البرنامج عن طريق النقر المزدوج على أيقونة على سطح المكتب. انقر على "تكوين> محول الأرقام" لفتح "محول الأرقام" الحوار، ومن ثم انقر فوق الزر "تغيير". في "تغيير محول الأرقام" الحوار حدد "Digidata 1440 سلسلة" من ​​"محول الأرقام نوع" قائمة. انقر على زر المسح الضوئي للكشف عن التحويل الرقمي. انقر على زر "موافق" للخروج من "تغيير محول الأرقام" الحوار، ومن ثم انقر فوق "موافق" للخروج من "محول الأرقام" الحوار. انقر على "تكوين> مختبر مقاعد البدلاء". في علامة التبويب إشارات الإدخال من مقعد مختبر، حدد النظير في ظل القنوات محول الأرقام. تعيين عامل المقياس إلى 0.002. 8. تشكيل لدهن طبقة ثنائية باستخدام كابل BNC، ربط مخرجات فصيل عبد الواحدمولد aveform إلى الخارجية أمام إدخال الأمر تحول (على اللوحة الخلفية للنظام الحصول على البيانات). إرسال 10 هرتز، 500 فولت PK-PK لالموجي الثلاثي إلى headstage. باستخدام micromanipulator، نقل بال micropipettes الزجاج أفقيا لتحقيق قطرات على اتصال حتى لمس قليلا وانتظر طبقة ثنائية رقيق أن يحدث (عادة حوالي 1-2 دقيقة) (أرقام 3C و 3D). ملاحظة: التقدم في عملية تشكيل طبقة ثنائية يمكن أن ينظر بصريا من خلال المجهر ويمكن رصدها من خلال قياس الحالي (الشكل 4). ضبط حجم طبقة ثنائية (~ 250 ميكرون في القطر) عن طريق التحكم في موقف الحبرية التي شنت على المحرك، وذلك باستخدام micromanipulator. ملاحظة: يمكن تقدير حجم طبقة ثنائية بصريا من خلال المجهر. هذا الأسلوب يجعل من السهل على الباحث للسيطرة على حجم طبقة ثنائية بواسطة بسهولةتحريك قطرات باستخدام micromanipulators. 9. الديناميكي الإثارة وMscL المحاصرة مرة واحدة وقد شكلت طبقة ثنائية وغير مستقرة (أي طبقة ثنائية لا كسر أو موصل)، وتحفيز قطرات عن طريق إرسال إشارة جيبية باستخدام مولد وظيفة. لتحفيز بروتين MscL إدراجها في طبقة ثنائية، وإرسال الموجي الجيبية مع السعة 175 ميكرون الذروة إلى الذروة، تردد 0.2 هرتز، ودورة العمل 50٪ إلى كهرضغطية أجهزة تحكم. (أنواع مختلفة من الطول الموجي يمكن أن ترسل مع سعة مختلفة، الترددات، ودورة العمل) 10. معالجة وتفسير نتائج حفظ القياسات الحالية، مسجلة باستخدام نظام الحصول على البيانات، في شكل .ABF. استيراد البيانات (في شكل .ABF) لمطلب باستخدام ملف وظيفة "abfload"، ثم تحليل ومعالجة البيانات. و"abfload" ملف متاح مجانا على الإنترنت. تقدير ركان التوتر في طبقة ثنائية والتوسع المساحي من قطرات، وذلك باستخدام أشرطة الفيديو من الحبرية خلال دورات يشتغل الكاملة التي يتم تسجيلها باستخدام الكاميرا المناسبة. أشرطة الفيديو عملية في Matlab، من خلال تجهيز إطارات الفردية باستخدام تقنيات معالجة الصور لتقدير مساحة واجهة المياه / النفط، فضلا عن زاوية بين قطرات. ملاحظة: باستخدام إطار 2D مأخوذة من شريط الفيديو، للكشف عن واجهة المياه النفط (أي حافة الحبرية) ومن ثم تقدير المساحة السطحية عن طريق الثورة.

Representative Results

أرقام 1 و 2 شاشة الإعداد والمعدات التجريبية تستخدم لتسجيل نشاط البروتين في سياق التحفيز الميكانيكي من الغشاء الدهني طبقة ثنائية. للحد من الضوضاء الكهربائية في قياساتنا، يتم وضعها داخل محطة العمل من صنع مختبر قفص فاراداي، ترتكز على اتصال الأرض على AxoPatch 200 B مكبر للصوت. تشكيل مستقرة العازلة الدهون طبقة ثنائية هو خطوة رئيسية في هذه الدراسة. في هذا الترتيب، وتجمع أحادي الطبقة الدهنية في واجهة النفط / الماء من قطرات مائية مغمورة في حمام من مذيب عضوي. عندما يتم وضع قطرات في الاتصال، ويتم التخلص من فائض المعروض النفطي، والطبقات الوحيدة الدهون المعارضة رقيقة إلى اثنين من جزيء سميكة الدهون طبقة ثنائية. تقنية الأكثر شيوعا المستخدمة في توصيف طبقة ثنائية هو الجهد المشبك. مع الجهد المشبك، يتم الحفاظ على الجهد عبر طبقة ثنائية في قيمة ثابتة بينما يتم قياس التيار الشكل 4 </stronز> يصور في الوقت الحقيقي تسجيل الحالي نموذجي لتشكيل طبقة ثنائية الأولي. معرفة السعة المحددة (~ 0.6 μF / سم 2) 5 من الدهون طبقة ثنائية DPhPC، ويمكن حساب منطقة طبقة ثنائية تشكيلها. يمكن السيطرة على منطقة طبقة ثنائية عن طريق تغيير موقف قطرات (الشكل 4A). باستخدام المحرك كهرضغطية، وأنواع مختلفة من الطول الموجي (الجيبية، مربع، مثلث، الخ.) على ترددات مختلفة، سعة، ودورات اجب يمكن تطبيقها على قطرات لأفقيا ومحوريا تتذبذب لهم وبالتالي، يمكن أن تتغير التوتر طبقة ثنائية والمنطقة (الشكل 4B). عندما يتم تحفيز DIB ميكانيكيا، مع الإبقاء على إمكانية DC ثابت عبر الغشاء، على عتبة منخفضة (اكتساب-وظيفة) V23T متحولة من MscL يولد أنشطة يمكن الاعتماد عليها بما في ذلك الدول أساسا شبه الموصلة والأحداث افتتاح أحيانا الكاملة (الشكل 5) . هذه EVالوالدان مماثلة لتلك التي تم تسجيلها باستخدام تقنية التصحيح، المشبك من سليمة الداخلية E. coli و الأغشية الجسيمات الشحمية تشكيلها مع V23T تنقيته MscL. النتائج في الشكل 5 تثبت أن يحدث النابضة ردا على زيادة التوتر، حيث يتم مراعاة جميع المسامير الحالية في ضغط الذروة. في ضغط الذروة، والتوسع المساحي النسبي من قطرات هو الحد الأقصى، وبالتالي، والتوتر في واجهة هو الحد الأقصى. Alamethicin، والجهد بوابات قناة ايون واحدة من الببتيدات الأكثر درس، ويزيد من نفاذية الغشاء عندما يتم تطبيق DC الجهد عبر الغشاء 36. يتم اختبار قدرة واجهة الدهون طبقة ثنائية لاستضافة بروتينات الغشاء والببتيدات أيضا عن طريق إجراء التسجيلات الحالية-النابضة الجهد باستخدام alamethicin الببتيد. يتم خلط Alamethicin مع الحل فوسفورية إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل الشكل 6 يظهر القياسات الحالية في إطار المشبك الجهد (+115 فولت). يتم سحبها قطرات في هذه التجربة بصرف النظر من أجل تحقيق اجهة طبقة ثنائية الصغيرة والمقاومة وبالتالي ارتفاع وأصغر السعة. يظهر السلوك النابضة من الببتيد Alamethicin من خلال الخطوات المنفصلة من الحالي (الشكل 6). الرسم البياني على الجانب الأيمن من مؤامرة يوضح التغيرات في تصرف من المستوى (0.0962 NS)، الذي هو في الأساس على مستوى تصرف الأول للقناة نفسها. الشكل 1: رسم تخطيطي تصف الأجزاء الرئيسية وأبعاد خزان النفط يتم تصنيعها خزان النفط في ورشة ميكانيكا في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا. وهو يتألف من أنبوب اسطواني الاكريليك تشكيله لصقها على سطح ورقة الاكريليك. الأبعاد والتصميم يمكن تعديلها لاستيعاب مختلف التطبيقات أو أكثر من اثنين بال micropipettes./53362/53362fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ويشمل الإعداد وبال micropipettes إعداد التجريبية (A) محطة العمل القياسية للتشكيل، ميكانيكيا تحفيز، وتميز طبقات ثنائية اجهة المجهر، المتلاعبين 3 محاور، كاميرا رقمية، مذبذب كهرضغطية، جدول عزل الاهتزاز، وقفص فاراداي: الرقم 2. (غير ظاهر). (B) يتكون الإعداد التجريبية من اثنين من المعارضين PEG-DMA هيدروجيل شغل بال micropipettes وضعه أفقيا داخل حمام من النفط سداسي. كل من بال micropipettes يحتوي على القطب حج / أجكل لتوفير الربط الكهربائي. ويستخدم micropipette الثالث مليئة proteoliposome حل لتشكيل قطرات في غيض من بال micropipettes أخرى. (C) يمكن قياس استجابة DIB الحاليةباستخدام مزيج من مكبر للصوت التصحيح ومنخفضة الضوضاء نظام الحصول على البيانات. (D) وأغلق مرتفعا صورة تظهر قطرات مائية شكلت في غيض من بال micropipettes. مصنوعة أقطاب (E) حج / أجكل عن طريق غمس غيض من اثنين 250 ميكرون الأسلاك الفضية في التبييض. ثم يتم تغذية الأقطاب من خلال اثنين من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مليئة PEG-DMA هيدروجيل، والتي يتم الشفاء للأشعة فوق البنفسجية لترسيخ. ويستخدم حامل التوالي مسرى مكروي مع موصل الذكور للاتصال واحدة من بال micropipettes إلى headstage من مكبر للصوت التصحيح. يتم وضع الصور التي توضح تشكيل طبقات ثنائية اجهة قطرة (A) A 10 ميكرون micropipette مليئة proteoliposomes تحت المجهر في القرب من نصائح micropipette: الرقم 3. باستخدام حقنة متصلة micropipette، الاستغناء عن كميات صغيرةمن proteoliposomes لتشكيل قطرات كروية للحجم المطلوب. السماح للشكل أحادي الطبقة من خلال السماح للقطرات على الجلوس لمدة عشر دقائق. جعل قطرات في الاتصال؛ سوف تشكل طبقة ثنائية بعد القضاء على كل النفط في واجهة. (B) في حين يتم تشكيل طبقة ثنائية، والتركيب الكيميائي في كلا الجانبين من واجهة يمكن السيطرة عليها عن طريق حقن المواد الكيميائية المطلوبة باستخدام micropipette الصغيرة الحجم. (C) وقطرات في لحظة من أول اتصال. (D) وقطرات عندما يتم تشكيل طبقة ثنائية المادة الدهنية. تظهر في الوقت الحقيقي قياسات كل من ترقق الأولي والتوسع اللاحق واجهة (A) الحالي يقاس خلال تشكيل طبقة ثنائية من خلال تطبيق الجهد الكهربائي الثلاثي: الرقم 4. حجم التيار المقاس هو يتناسب طرديا مع capaci tance، وبالتالي مجال واجهة طبقة ثنائية. وأقرب يتم إحضارها قطرات معا، وأكبر مساحة من واجهة والعكس بالعكس. (B) بناء على طلب من الإثارة الميكانيكية، ومنطقة للزيادات واجهة طبقة ثنائية والنقصان في نفس التردد إشارة محفزة. الرقم 5: تظهر القياسات في الوقت الحقيقي استجابة طبقة ثنائية إلى الإثارة الميكانيكية وكذلك النابضة من متحولة V23T من MscL شكل الاستجابة الحالية غير الجيبية، التي تتعلق تغيير الجيبية في طبقة ثنائية السعة نتيجة لل التغيير منطقة طبقة ثنائية. المسامير الحالية، والتي تحدث في ذروة كل دورة، تشير تصرف الفرعي النابضة من متحولة V23T. مؤامرة القطبية أيضا إلى أن النابضة يحدث في ضغط الذروة، مما يعكس زيادة في التوتر في واجهة طبقة ثنائية. <p class="jove_content"> وأظهرت القياسات الحالية تحت المشبك الجهد والرسم البياني المقابل من مستويات تصرف للنشاط النابضة القنوات Alamethicin أدرجت السلوك النابضة من الببتيد Alamethicin من خلال المنفصلة زيادة تدريجية في التيار: الرقم 6. تطابق مستويات تصرف بشكل جيد جدا مع القياسات السابقة التي يؤديها مجموعة بحثنا في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا (7).

Discussion

Mechanosensation يدل على واحدة من أولى مسارات نقل الحسية التي تطورت في الكائنات الحية. استخدام هذه الظاهرة لدراسة وفهم للوالميكانيكية الكهربائية خصائص بنك دبي الإسلامي، هو خطوة حاسمة تجاه مواد محفزات الاستجابة الوظيفية. أنه ينطوي على إدماج وتفعيل قناة mechanosensitive، MscL، في بنك دبي الإسلامي كما محول mechanoelectrical وقياس الضغط للكشف عن زيادة التوتر في واجهة الدهون طبقة ثنائية. على صعيد آخر، يمكن أن تنظم وظيفة قنوات MS خلال خصائص المواد الأساسية للطبقات ثنائية الدهون بما في ذلك سمك، انحناء جوهري، والانضغاطية. في ضوء ما سبق، توفر تقنية القائم على micropipette أداة قيمة تسمح للباحث القدرة على دراسة قنوات MS في الدبس ويقدم نظرة ثاقبة هيكل طبقة ثنائية الدهون، وكذلك التفاعلات دهون، بروتين.

على مدى العقد الماضي ثلاثةالصورة، كان التصحيح، المشبك الطريقة الأساسية لدراسة قنوات MS، لأنه يسمح لقط كل الجهد والتوتر. ومع ذلك، والتصحيح، المشبك يتطلب معدات ضخمة وغير مناسبة لالتصغير، وهي خاصية اللازمة لهندسة الأجهزة الحسية والتحويل. الدبس بسبب من البساطة، والاستقرار، والاكتناز تمثل بيئة مناسبة لدراسة نشاط MscL. هنا، ونحن نعرب السلف السابقة في تقنيات تشكيل بنك دبي الإسلامي من خلال اقتراح تقنية القائم على micropipette، مع القدرة على التحكم في حجم قطرات واجهة طبقة ثنائية، والتركيب الكيميائي لكل قطرة، والتوتر في الواجهة من خلال التحفيز الحيوي. وتتكون هذه التقنية من ترسيخ قطرات المائية، التي تحتوي على proteoliposomes، إلى نصائح من محوري معارضة الزجاج الشعيرات الدموية. يتم وضع قطرات في حمام من المذيبات العضوية وعند مثوله في اتصال من أشكال طبقة ثنائية الدهون في واجهة.

وترد بال micropipettes إلى pمؤشرات التذبذب iezoelectric، مما يسمح النزوح الأفقي للقطرات. ضغط حيوي قطرات، والنتائج في زيادة التوتر السطحي في واجهة النفط المياه، وبالتالي زيادة في طبقة ثنائية التوتر. جانبين رئيسيين هما تفرق هذه الطريقة من المماثلة والتي نشرت مؤخرا طبقة ثنائية فقاعة الاتصال (مصرف البحرين المركزي) تقنية 37. باستخدام تقنية الواردة في هذه الوثيقة، وحجم طبقة ثنائية يتم التحكم باستخدام micromanipulators وبالتالي على حجم قطرات تبقى ثابتة، على عكس الطريقة مصرف البحرين المركزي. وبالإضافة إلى ذلك، تدعو تقنية مصرف البحرين المركزي لمضخات الضغط، التي لا يحتاج إليها في طريقة عرضها في هذه الورقة مما يجعل من أبسط وأسهل لبناء.

ونحن قادرون على دمج وتحفيز MscL البكتيري للمرة الأولى دون استخدام ماصة التصحيح أو التعديلات الكيميائية 38. لأن النظام يسهل تشكيل قوة غير متكافئة الأغشية الدهنية طبقة ثنائية، فإنه يحاكي عن كثب لالتباين IPID وجدت في الأغشية البيولوجية. وهذا يسمح لنا لدراسة الآثار المترتبة على تكوين غشاء رقابة أو التماثل على نشاط MscL. بالإضافة إلى ذلك، من خلال تقنيات معالجة الصور، ويساعد هذا الأسلوب تقدير التوتر في واجهة طبقة ثنائية. ويساعد هذا الأسلوب في فهم مبادئ interconversion بين السائبة وسطح القوات في بنك دبي الإسلامي، ويسهل قياس خصائص الغشاء الأساسية، وتحسين فهم استجابة MscL لغشاء التوتر.

على الرغم من أن هذه الطريقة يأخذنا خطوة أقرب نحو نظام المواد المحفزات التي تستجيب الجزيئية البيولوجية والبيئة الفسيولوجية المختلفة لدراسة MscL، وهناك قيود على النظام. التوتر في هذا النظام لا يمكن فرضت بسبب وجود خزان الدهون في شكل الجسيمات الشحمية في كل قطرة، والتي تميل إلى تخفيف حدة التوتر في واجهة النفط / الماء. لذلك، في قنوات mechanosensitive الحالية يمكن حفزفي الدبس فقط في نظام ديناميكي. وجود فقاعات هواء في نظام يؤثر تأثيرا كبيرا على الدقة واستنساخ التجارب. فقاعات الهواء الموجودة في الهلاميات المائية يمكن أن يؤدي فقدان إذا الربط الكهربائي.

في حين وصفنا استخدام أسلوب ماصة الصغيرة القائمة على تحفيز MscL، يمكن أن تستخدم هذه التقنية لدراسة أنواع أخرى من قنوات MS ولديه القدرة ليتم استخدامها من قبل الباحثين لدراسة مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية. على سبيل المثال، تم استخدام الإعداد مماثل في المختبر لدراسة استجابة mechanoelectrical من واجهة قطرة الغشاء طبقة ثنائية خالية من القناة. يمكن إعادة تشكيل البروتينات المختلفة وتفعيلها باستخدام هذا الإعداد رقابة شديدة، مع الأخذ في الاعتبار أن البيئات إعادة كل جزيء حيوي تختلف. الطريقة الموضحة في هذه المقالة يتطرق إلى إمكانية التطبيق على نطاق أوسع بكثير أن يقتصر فقط على مخيلة الباحث.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويدعم البحث عنها في هذا المنشور من قبل مكتب سلاح الجو للبحوث العلمية الأساسية مبادرة منحة FA9550-12-1-0464.

Materials

0.22 µm filter Corning 430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P Purchased as lyophilized powder
34-gauge microfil World Precision Instruments MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels ThermoFisher 3141 Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz Keysight Technologies 33220A
Ampicillian ThermoFisher BP1760 ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610000
Axio Scope.A1 Carl Zeiss –
AxioCam HSm Carl Zeiss –
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices –
BCA protein assay kit Pierce  23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Dialysis tubing 7 Spectra/Por 132113 MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system Molecular Devices –
DNAse Sigma-Aldrich DN25
DPhPC Avanti 850356C
E-625 PZT Servo-Controller  Physik Instrumente E-526
FPLC System Pharmacia Biotech –
HCl J.T. Baker 9535-33
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Homoginizer Wheaton 357426 15 mL
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Affymetrix 17886
IRGACURE® 2959 IRGACURE® 555047962
Isopore Membrane Filters  EMD Millipore VCTP02500
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
KCl Sigma-Aldrich P3911 ACS Grade
KH2PO4 Mallinckrodt 7100 ACS Grade
Kimble-Chase Kontes 420401-1515 Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System Electro-Lite, corp. 81170
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators Thorlabs PCS-520N
MgCl2 ThermoFisher M33 ACS Grade
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration Sigma-Aldrich M1254-100G
N2 Gas Airgas UN1066
NaCl EMD SX0420-1 ACS Grade
Ni NTA agarose beads Qiagen 1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID McMaster-Carr 8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator Physik Instrumente P-601
PAGE gel Bio-Rad 456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film Parafilm® PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate Polysciences, Inc. 15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk Sterlitech Corporation PCTB0425100
Potassium Chloride  Sigma-Aldrich P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm World Precision Instruments GO1-100
SDS Sigma-Aldrich L5750
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Azide Affymetrix 21610
Test tubes ThermoFisher 14-961-27 12 x 130 mm
Tryptone ThermoFisher BP1421
Ultracal 30K Millipore UFC803024 Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089
Water Purifier Barnstead D11931
Yeast ThermoFisher BP1422
β-octylglucopyranoside Anatrace O311S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).
  2. Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution. Nature. , (1966).
  3. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis. ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).
  5. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).
  6. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nat Nano. 4, 437-440 (2009).
  7. Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates. ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).
  8. Sarles, S. A., Leo, D. J. Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates. ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).
  9. Sarles, S. A. . Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).
  10. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).
  11. Sarles, S. A. The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers. SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).
  12. Sarles, S. A., Leo, D. J. Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials. SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).
  13. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).
  14. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).
  15. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. BIOPHYS J. 12, 432 (1972).
  16. Tien, H. T., Ottova, A. L. The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes. J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).
  17. Perozo, E. Gating prokaryotic mechanosensitive channels. NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).
  18. Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. Mechanosensitive channels in microbes. ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).
  19. Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria. PLoS ONE. 7, e33077 (2012).
  20. Levina, N., et al. Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity. The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).
  21. Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses. BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).
  22. Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL. J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).
  23. Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL. J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).
  24. Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations. PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).
  25. Kubalski, A., Martinac, B. . Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).
  26. Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282, 2220-2226 (1998).
  27. Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).
  28. Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. Structural models of the MscL gating mechanism. BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).
  29. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  30. Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension. NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).
  31. Corry, B., Jayatilaka, D. Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL. BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).
  32. Wang, Y., et al. Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL. eLife. 3, e01834 (2014).
  33. Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating. J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).
  34. Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. A light-actuated nanovalve derived from a channel protein. Science. 309, 755-758 (2005).
  35. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System. MRS Proceedings. 1621, (2014).
  36. Fox, R. O., Richards, F. M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution. Nature. 300, 325-330 (1982).
  37. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Sci Rep. 5, (2015).
  38. Barriga, H. M., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).

Tags

MicropipetteDroplet Interface BilayersMechanosensitive Ion ChannelsMscLMembrane TensionPiezoelectric ActuatorMembrane PropertiesAsymmetric MembranesBiomolecular Devices

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Najem, J. S., Dunlap, M. D., Yasmann, A., Freeman, E. C., Grant, J. W., Sukharev, S., Leo, D. J. Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. J. Vis. Exp. (105), e53362, doi:10.3791/53362 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image